謝圣凱 ，崔鳳嬌 ，高大禹，許長山，陳建新

（1.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122； 2.糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122）

傳統(tǒng)濃香型白酒釀造多在窖池中[1]進行，因為窖泥中存在著己酸菌等功能微生物，其對濃香型白酒風味物質的產(chǎn)生具有重要作用[2]，同時窖泥也可向酒醅中傳輸其發(fā)酵過程中積累的揮發(fā)性風味物質[3]，但是，窖池中白酒發(fā)酵屬于天然發(fā)酵[4]，難以實現(xiàn)發(fā)酵過程的精準控制。

貴州釣魚臺國賓酒業(yè)將換熱器插入窖池酒醅中，對發(fā)酵溫度進行控制，結果發(fā)現(xiàn)，溫度變化對酵母菌繁殖影響顯著，有利于發(fā)酵進行[5]。羅冰等[6]通過將U型換熱管埋入酒醅中控制發(fā)酵溫度變化，對比非控溫窖池發(fā)現(xiàn)，控溫發(fā)酵也能夠釀造出優(yōu)良的濃香型白酒，可見控溫發(fā)酵對于白酒釀造具有積極作用。但是窖池中插入換熱裝置控溫相對麻煩，且不利于白酒機械化程度的提升。

隨著經(jīng)濟快速發(fā)展，我國白酒行業(yè)日益走上了機械化發(fā)展的道路[7]。蘇占元等[7]在生物反應器中進行白酒固態(tài)發(fā)酵，釀造出了優(yōu)質濃香型白酒。劉念等[8]開發(fā)出了一種濃香型白酒發(fā)酵容器，將窖泥裝在窖壁和窖底的夾層中，提高了白酒釀造的空間利用率。范偉國等[9]研制出了白酒固態(tài)發(fā)酵罐，將窖泥以掛片的方式敷設在反應器內(nèi)壁上使用，且其罐體外壁夾套上裝有冷媒，可以準確調控罐內(nèi)酒醅發(fā)酵溫度，從而解決盛夏溫度過高導致酒廠停產(chǎn)的問題。但是，上述濃香型白酒發(fā)酵反應器存在的缺點為：（1）窖泥容易脫落進入酒醅中，導致白酒具有泥臭味；（2）黃泥載體窖泥黏附性強，不易取出，導致退化窖泥養(yǎng)護困難[10]；（3）窖泥附著在罐壁上影響傳熱效果。

鑒于生物反應器釀造濃香型白酒仍需窖泥微生物的參與，本文旨在研究一種新型窖泥，將其裝入特定裝置中埋入酒醅發(fā)酵，可實現(xiàn)反應器的四周和底部進行換熱，便于控制酒醅溫度。另外，采用人為控制的方法能夠促進窖泥老熟，本文通過對比不同材料作載體培養(yǎng)的窖泥理化和微生物學指標，最終選定一種合適的材料培養(yǎng)窖泥，從而為生物反應器釀造濃香型白酒提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗原料

窖泥a、窖泥b和窖泥c，某酒廠提供；粉末活性炭、顆?；钚蕴浚瑖幖瘓F化學試劑有限公司。

1.1.2 菌株來源

產(chǎn)己酸菌XS1分離自某酒廠的白酒車間的窖泥中。

1.2 儀器與試劑

生化培養(yǎng)箱（BSP-250），上海博訊實業(yè)有限公司；MGC 2.5 L厭氧產(chǎn)氣袋、MGC 2.5 L厭氧培養(yǎng)袋、氧氣指示劑C-22，日本三菱公司；潔凈工作臺（VS-1300），蘇州凈化設備有限公司。

制霉菌素，生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法

（1）銨態(tài)氮測定：連續(xù)流動分析儀測定[11]；（2）有效磷測定：Olsen法[12]；（3）窖泥pH值測定：參考沈怡方的方法[13]。

1.3.2 產(chǎn)己酸菌計數(shù)[14]

液體樣品計數(shù)：取1 mL液體樣品與9 mL無菌生理鹽水混合，低溫振蕩均勻后進行梯度稀釋，選取稀釋液涂布于RCM平板，快速放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋（內(nèi)含厭氧產(chǎn)氣袋和氧氣指示劑，厭氧產(chǎn)氣袋在耗盡氧氣的同時會產(chǎn)生大量的CO2，適合厭氧菌培養(yǎng)）中，37℃培養(yǎng)至菌落長出并計數(shù)。固體樣品計數(shù)：取10 g窖泥于裝有玻璃珠的90 mL無菌生理鹽水中，低溫振蕩10 min，吸取1 mL溶液與9 mL無菌生理鹽水混合，其余操作與液體樣品計數(shù)相同。

1.3.3 好氧細菌計數(shù)[14]

液體樣品細菌計數(shù)：取1 mL樣品與9 mL無菌生理鹽水混合，振蕩均勻后進行梯度稀釋，選取稀釋液涂布LB平板，37℃培養(yǎng)至菌落長出并計數(shù)。固體樣品細菌計數(shù)：取10 g窖泥于裝有90 mL加有玻璃珠的無菌生理鹽水中，低溫振蕩30 min，吸取1 mL溶液與9 mL無菌生理鹽水混合，其余操作與液體樣品細菌計數(shù)相同。

1.3.4 產(chǎn)己酸菌培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)

吸取150 μL XS1菌液接種到裝液量90%[15]的含有RCM液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，快速放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中，于37℃下培養(yǎng)2 d，之后依此類推在500 mL三角瓶中進行擴大培養(yǎng)。

1.3.5 窖泥培養(yǎng)工藝流程[16]

產(chǎn)己酸菌菌種→擴大培養(yǎng)→加入種子窖泥、黃水、酒糟浸出液、乙醇、大曲→復合功能菌液→加入黃泥、種子窖泥、大曲粉、豆餅粉、乙醇、麩皮、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、黃水、干酒糟、酒糟浸出液、水→拌勻→37℃下密封發(fā)酵60 d。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)己酸菌液在窖泥培養(yǎng)中的運用

2.1.1 產(chǎn)己酸菌在窖泥培養(yǎng)中的性能測定（表1）

表1 人工窖泥微生物檢測結果

由表1可知，不加種子窖泥、只加產(chǎn)己酸菌液培養(yǎng)的黃泥載體窖泥產(chǎn)己酸菌數(shù)量與添加種子窖泥、產(chǎn)己酸菌液培養(yǎng)的黃泥窖泥較為接近，這說明該產(chǎn)己酸菌培養(yǎng)窖泥是可行的。

2.1.2 選定培養(yǎng)窖泥的種子窖泥（表2）

由表2可知，對比含水率、銨態(tài)氮、有效磷、好氧細菌和產(chǎn)己酸菌數(shù)量可知，窖泥b產(chǎn)己酸菌數(shù)量和好氧細菌數(shù)量皆最高，其他3項指標也與窖泥a和窖泥c較為接近，故選定窖泥b作為種子窖泥培養(yǎng)窖泥。

2.1.3 選定培養(yǎng)窖泥的載體（表3）

表2 窖泥的理化和微生物學指標檢測結果

表3 各種載體窖泥檢測結果

結合表3、表2，對比窖泥產(chǎn)己酸菌數(shù)量可知，粉末活性炭載體窖泥＞顆?；钚蕴枯d體窖泥＞石英砂載體窖泥＞黃泥載體窖泥，并且粉末活性炭載體窖泥和顆?；钚蕴枯d體窖泥產(chǎn)己酸菌數(shù)量皆大于窖泥b。分析窖泥好氧細菌數(shù)量可知，顆?；钚蕴枯d體窖泥＞粉末活性炭載體窖泥＞石英砂載體窖泥＞黃泥載體窖泥，且顆粒活性炭載體窖泥、粉末活性炭載體窖泥和石英砂載體窖泥好氧細菌數(shù)量皆大于窖泥b。

另外，對比銨態(tài)氮含量發(fā)現(xiàn)，顆?；钚蕴?、粉末活性炭載體窖泥銨態(tài)氮含量與窖泥b、窖泥c較為接近，比黃泥、石英砂載體窖泥銨態(tài)氮含量高，從而可為窖泥微生物生長提供所需的主要氮源[17]。

對比有效磷含量可知，粉末活性炭和顆?；钚蕴拷涯嘤行Я缀勘仁⑸啊ⅫS泥載體窖泥高，結合微生物數(shù)量分析，這與窖泥中適量的有效磷等無機鹽可為微生物繁殖提供營養(yǎng)的結論相符合[17]。

鑒于窖泥中厭氧菌的數(shù)量能反映出窖泥的質量[17]，綜上所述，發(fā)現(xiàn)粉末活性炭更適合作窖泥載體，但是，鑒于黃泥作為傳統(tǒng)窖泥的載體由來已久，故進一步探索粉末活性炭與黃泥混合作載體培養(yǎng)窖泥的可行性，跟蹤發(fā)酵過程中理化、微生物指標變化，并與黃泥單獨載體窖泥和粉末活性炭單獨載體窖泥進行對比。

2.1.4 粉末活性炭和黃泥混合載體窖泥實驗（培養(yǎng)期間定期取樣）（圖1）

圖1 產(chǎn)己酸菌數(shù)量變化

（1）培養(yǎng)期間各載體窖泥產(chǎn)己酸菌數(shù)量變化

圖1可知，觀察窖泥產(chǎn)己酸菌數(shù)量變化，粉末活性炭載體窖泥產(chǎn)己酸菌數(shù)量由開始的1.89×106cfu/g在培養(yǎng)時間為2 d時上升到7.81×108cfu/g窖泥，之后至發(fā)酵結束，產(chǎn)己酸菌數(shù)量在7.81×108～1.12×108cfu/g窖泥之間波動。分析各窖泥產(chǎn)己酸菌數(shù)量可知，粉末活性炭載體窖泥＞黃泥、粉末活性炭混合載體窖泥＞黃泥、粉末活性炭、顆?；钚蕴炕旌陷d體窖泥≈黃泥載體窖泥。

（2）窖泥培養(yǎng)期間好氧細菌數(shù)量變化（圖2）

由圖2可知，發(fā)酵后期各載體窖泥好氧細菌數(shù)量較為接近，各載體皆適合好氧細菌生長。

（3）各載體窖泥培養(yǎng)期間含水率和pH值的變化（圖3、圖4）

圖2 好氧細菌數(shù)量變化

圖3 窖泥含水率變化

由圖3可知，各載體窖泥培養(yǎng)期間含水率波動不大，其中粉末活性炭載體窖泥含水率最高，黃泥載體含水率最低。由圖4可知，黃泥載體窖泥在發(fā)酵22 d后pH值為4.4左右，之后至發(fā)酵結束基本波動不大；而其他3種載體窖泥發(fā)酵22 d后，pH值基為5.4以上，鑒于優(yōu)質窖泥pH值一般處于5～7范圍內(nèi)[18]，顯然黃泥、粉末活性炭、顆?；钚蕴炕旌陷d體，黃泥、粉末活性炭混合載體，粉末活性炭載體更適合微生物繁殖。綜上所述，結合產(chǎn)己酸菌、好氧細菌、pH值指標分析，最終得出選擇粉末活性炭作窖泥載體是合適的。

圖4 窖泥pH值變化

2.1.5 粉末活性炭和黃泥混合載體窖泥實驗（培養(yǎng)期間不取樣）（表4）

表4 各種載體窖泥檢測結果

由表4可知，產(chǎn)己酸菌方面，只有黃泥載體窖泥培養(yǎng)60 d后產(chǎn)己酸菌數(shù)量低于初始水平，其他3種載體窖泥培養(yǎng)60 d后產(chǎn)己酸菌數(shù)量均高于初始值，尤以粉末活性炭載體窖泥產(chǎn)己酸菌數(shù)量增長幅度最大，結合表2可知，其比窖泥b產(chǎn)己酸菌數(shù)量更高。對比窖泥好氧細菌數(shù)量可得，發(fā)酵60 d后，黃泥載體窖泥＞黃泥、粉末活性炭、顆?；钚蕴炕旌陷d體窖泥＞粉末活性炭載體窖泥＞黃泥、粉末活性炭混合載體窖泥。觀察pH值發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵結束后的黃泥載體窖泥pH4.87，而其他3種窖泥pH值都處于5～7之間，更有利于微生物的繁殖。含水率方面，窖泥培養(yǎng)初始和培養(yǎng)60 d后含水率起伏不大，其中黃泥載體窖泥含水率最低，粉末活性炭窖泥含水率最高。另外，對比圖1可知，取樣操作確實對各種人工窖泥培養(yǎng)造成了不同影響，但是粉末活性炭載體窖泥產(chǎn)己酸菌數(shù)量受取樣影響最小，可見粉末活性炭穩(wěn)定性也較好。

另外，實驗發(fā)現(xiàn)，黃泥載體窖泥、黃泥+粉末活性炭+顆?；钚蕴炕旌陷d體窖泥和黃泥+粉末活性炭混合載體窖泥相比，粉末活性炭載體窖泥黏附性更強，不具有靈活的形狀可塑性，綜上所述，最終選擇粉末活性炭作載體培養(yǎng)窖泥。

3 結論

將高產(chǎn)己酸的XS1菌株分別運用到黃泥、石英砂和活性炭載體窖泥的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)粉末活性炭材料最適合作為窖泥培養(yǎng)的載體。其窖泥中產(chǎn)己酸菌數(shù)量相比黃泥載體窖泥、石英砂載體窖泥、顆?；钚蕴枯d體窖泥、黃泥+粉末活性炭載體窖泥、黃泥+粉末活性炭+顆?；钚蕴枯d體窖泥都要高，發(fā)酵時間為60 d的窖泥中產(chǎn)己酸菌數(shù)量能達到7.91×108cfu/g窖泥，且受外界因素影響波動?。唤涯喟l(fā)酵60 d后的好氧細菌數(shù)量能達到1.04×107cfu/g窖泥，其窖泥pH值基本處于5～7之間，符合優(yōu)質窖泥的要求，有利于窖泥功能微生物的繁殖；其窖泥銨態(tài)氮含量、有效磷含量都與各酒廠窖泥接近，能夠滿足微生物的生長所需的氮源和無機鹽成分。同時，粉末活性炭窖泥相比其他載體窖泥具有更好的形狀可塑性，適合在固定裝置中填裝使用，這樣窖泥不會脫落到酒醅中，窖泥養(yǎng)護較為便捷，也不會影響傳熱，同時，粉末活性炭材料成本低，耐酸堿，化學性質穩(wěn)定，具有較大的比表面積，有利于固定微生物[19]。

鑒于窖泥和酒醅中微生物繁多，反應機制復雜，本文只是專注于窖泥中產(chǎn)己酸菌和好氧細菌的研究，這具有一定的局限性，故還需深入研究窖泥和白酒發(fā)酵相關機理。另外，粉末活性炭載體窖泥在生物反應器中使用的最佳方式、實際使用效果還有待深入研究。

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