謝圣凱，陳建新

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122）

濃香型白酒作為我國傳統(tǒng)香型白酒之一，其具有窖香濃郁、香味協(xié)調(diào)等風(fēng)格，己酸乙酯已被確定為其主體風(fēng)味物質(zhì)[1]。己酸乙酯主要由己酸和乙醇反應(yīng)生成，其中，己酸產(chǎn)自窖泥中的己酸菌[2]，而首株己酸菌Clostridium kluyveri于1937年由巴克爾發(fā)現(xiàn)，其主要產(chǎn)生己酸和丁酸，同時還生成少量乙酸，該菌被視為己酸菌的模式菌株。目前已報道的己酸菌多屬于專性厭氧的梭菌[3]，梭菌綱微生物分布較廣，也一直被認(rèn)為是影響窖泥質(zhì)量的重要功能菌群[1]。

鑒于己酸菌對濃香型白酒發(fā)酵的重要性，眾多學(xué)者對其展開研究。施安輝[4]從蘭陵美酒廠窖泥中分離出己酸菌C1，其己酸產(chǎn)量基本保持在1.8 g/L以上。吳衍庸等[5]從瀘州老窖窖泥中篩選出的瀘酒梭菌己酸產(chǎn)量為3.08 g/L。薛正楷[6]從萬賓酒業(yè)公司的百年窖池中篩選出的Clostridium celerecrescens菌株己酸產(chǎn)量為5.47 g/L。內(nèi)蒙古輕工研究所分離到的己酸菌株內(nèi)蒙古30#，其在35℃下培養(yǎng)10 d后的己酸產(chǎn)量達到7 g/L[7]。張彬等[8]報道的己酸菌S-20在神州八號飛船太空育種后，培養(yǎng)10 d的己酸產(chǎn)量為4.55 g/L。由此可見，窖泥中存在的多種己酸菌因其多樣化的代謝產(chǎn)物從而具有較強的應(yīng)用價值。

己酸菌廣泛用于人工窖泥培養(yǎng)。姚萬春等[9]以黃泥為載體培養(yǎng)的人工窖泥己酸菌數(shù)量為9.03×106cfu/g；天府酒業(yè)人工窖泥中己酸菌數(shù)量為5.4×105cfu/g[10]。

另外，鑒于濃香型白酒是在窖池中釀造，而窖池具有占地面積大、不利于控溫發(fā)酵等缺點，目前已有一些酒廠采用生物反應(yīng)器釀造濃香型白酒[11]。但是，窖泥以貼壁形式在反應(yīng)器中使用，具有影響傳熱的問題；且黃泥載體窖泥黏附性強，不易取出，故需要培養(yǎng)出新型載體窖泥以適應(yīng)生物反應(yīng)器[12]。

本研究采用厭氧法從窖泥中分離高產(chǎn)己酸菌，并從pH值、乙醇耐受性、揮發(fā)性物質(zhì)含量等方面研究其生理生化性質(zhì)，另外結(jié)合16S rRNA性質(zhì)分析其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。之后將本研究篩選的高產(chǎn)己酸菌作為己酸菌來源培養(yǎng)多種載體的人工窖泥，并搭配酒醅進行厭氧發(fā)酵以評估窖泥發(fā)酵性能，從而為濃香型白酒發(fā)酵及其生物反應(yīng)器釀造提供優(yōu)質(zhì)菌株資源和適宜的窖泥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

窖泥a由某濃香型酒廠提供。

1.1.2 菌株來源

Clostridium guangxiensestrain xsk1和Clostridium kogasensisstrain xsk2均分離自窖泥a。

1.1.3 培養(yǎng)基

己酸菌分離與培養(yǎng)采用RCM培養(yǎng)基和ES培養(yǎng)基[1]。

1.2 儀器與試劑

氣相色譜儀（GC2010），日本島津公司；生化培養(yǎng)箱（BSP-250），上海博訊實業(yè)有限公司；厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧培養(yǎng)袋，日本三菱公司。

甲酸、己酸（色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-乙基丁酸（色譜純），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 己酸菌篩選[13]

把窖泥放入裝有RCM液體培養(yǎng)基、裝液量約90%的50 mL三角瓶中后，以80℃加熱10 min，冷卻后添加2%的無水乙醇，連同未涂布的RCM、ES固體平板快速放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中（內(nèi)有氧氣指示劑和厭氧產(chǎn)氣袋，厭氧產(chǎn)氣袋在耗盡氧氣的同時會產(chǎn)生CO2），于37 ℃下培養(yǎng)4 d后，吸取200 μL窖泥培養(yǎng)液涂布RCM、ES固體平板，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中，37℃培養(yǎng)至菌落長出，挑選平板上長出的單菌落在RCM平板上劃線。

1.3.2 菌種鑒定

（1）基因組提取參考熊君燕的方法[14]。（2）PCR擴增，反應(yīng)體系為 10×PCR buffer(Mg2+)5 μL，dNTP(2.5 mM）4 μL，DNA模板1 μL，10 μM 正反向引物（27F、1492R）各 3 μL，rTaq 酶(5 U/μL)：0.5 μL，ddH2O：33.5 μL。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性：94 ℃ 5 min；變性：94 ℃ 30 s；退火：56 ℃30 s；延伸：72℃ 1 min 30 s；后延伸：72℃ 10 min；循環(huán)數(shù)為30。PCR擴增純化后進行測序，測序結(jié)果在NCBI中進行比對，上傳序列后獲取菌株登錄號。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將分離出的兩株己酸菌16S rRNA序列與其親緣關(guān)系最近的相關(guān)菌株的16S rRNA序列利用MEGA7軟件中Clustal W功能進行比對。然后用Construct/Test Neighbor-Joining Tree方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，數(shù)據(jù)進行1000次自展重抽樣以確定各分支的準(zhǔn)確性[1]。

1.3.4 揮發(fā)性物質(zhì)采用氣相色譜測定

液體樣品處理：將5 mL樣品在8000 r/min下離心10 min，通過濾膜后吸取562.5 μL濾液添加到含有31.5 μL 2-乙基丁酸[15]（184.8 g/L）、31.5 μL乙酸正戊酯（175.2 g/L）的25 mL容量瓶中，并用體積分?jǐn)?shù)為1.5%[16]的甲酸溶液定容，混合均勻后吸取1 μL進行氣相色譜測定。固體樣品處理[17]：使用40 mL 60%乙醇溶液超聲浸提5 g固體樣1 h，將浸提液在8000 r/min下離心10 min，其余步驟同液體樣品。

GC檢測條件[16]：檢測器：氫火焰離子化檢測器；色譜柱：CB-FFAP（30 m×0.50 μm×0.32 mm）；溫度程序：60℃保持5min，以25℃/min升至210℃，保持6 min；進樣口溫度為230℃；分流比：20∶1；檢測器溫度230 ℃。

1.3.5 己酸菌計數(shù)[14]

液體樣品計數(shù)：取1 mL樣品與9 mL無菌生理鹽水混合，混勻后進行梯度稀釋，選取稀釋液涂布RCM平板，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中于37℃進行培養(yǎng)。固體樣品計數(shù)：取10 g樣品于裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，低溫振蕩10 min，吸取1 mL樣液與9 mL無菌生理鹽水混合，其余操作與液體樣品相同。

1.3.6 兩株己酸菌培養(yǎng)實驗

分別將150 μL的菌株Clostridium guangxiensestrain xsk1和Clostridium kogasensisstrain xsk2接種到裝液量約90%[18]的RCM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)適量時間后分別吸取150 μL菌液接種到相應(yīng)培養(yǎng)條件的三角瓶中，快速放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中于37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后分別進行揮發(fā)性成分檢測和己酸菌計數(shù)。

1.3.7 人工窖泥培養(yǎng)工藝流程[9]

己酸菌菌株→放大培養(yǎng)→添加窖泥種子、黃水、乙醇、大曲→復(fù)合功能菌液→加入黃泥等窖泥載體、窖泥種子、大曲、豆餅粉、乙醇、麩皮、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、黃水、干酒糟、水→混合均勻→37℃下密封發(fā)酵60 d。

1.3.8 窖泥性能測定

實驗室模擬發(fā)酵采用單糧發(fā)酵，其中，糧醅比為1∶4.5，糧曲比為3∶1，糧水比為1∶0.9，糧食∶稻殼為4.6∶1。將窖泥用人工窖泥袋包好后放在容器底部，添加一定比例的混蒸后加曲的酒醅，封口后快速放入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋中于37℃下培養(yǎng)50 d，之后取樣檢測酒醅中己酸、己酸乙酯等物質(zhì)含量，以此評估窖泥性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 己酸菌的篩選

2.1.1 己酸菌的篩選與鑒定

采用ES和RCM兩種培養(yǎng)基分別篩選己酸菌，實驗發(fā)現(xiàn)，涂布培養(yǎng)8 d后的ES固體平板無菌落長出，而RCM固體平板表面和底部皆有菌落長出。經(jīng)過篩選純化、分離鑒定和NCBI比對，使用RCM培養(yǎng)基從窖泥中篩選得到2株己酸菌見表1。

表1 窖泥中己酸菌的分離結(jié)果

2.1.2 菌株的形態(tài)

上述2株己酸菌的菌落和顯微鏡結(jié)構(gòu)圖見圖1，兩株己酸菌的菌落形態(tài)皆呈現(xiàn)凸起、白色、近圓形、光滑、質(zhì)地均勻易挑起特征，顯微形態(tài)上皆表現(xiàn)為桿狀。

圖1 己酸菌在培養(yǎng)基上菌落及微觀形態(tài)比較

2.1.3 菌株厭氧性實驗（表2）

由表2可知，此兩株己酸菌皆屬于嚴(yán)格厭氧菌，這符合梭菌綱細菌屬于嚴(yán)格厭氧的芽孢桿菌類微生物的觀點。

2.1.4 不同pH值培養(yǎng)條件下兩株己酸菌培養(yǎng)液揮發(fā)性物質(zhì)變化（圖2）

表2 己酸菌株厭氧特征

圖2 Clostridium guangxiense strain xsk1（a）、Clostridium kogasensis strain xsk2（b）發(fā)酵液中揮發(fā)性成分

由圖2可知，Clostridium guangxiensestrain xsk1菌株在不同pH值條件下培養(yǎng)菌液中揮發(fā)性物質(zhì)含量存在差異，其中，對比有機酸含量可知，己酸＜丁酸＜乙酸，這印證了丁酸、乙酸是合成己酸的前體物質(zhì)的觀點[19]，但是這也說明己酸菌在產(chǎn)酸方面可能并不是己酸含量最高。另外，在pH6時己酸、乙酸和丁酸含量皆處于最高，初步得出pH6較為適合該菌生長，這符合己酸菌更喜歡在中性偏酸性環(huán)境下繁殖的觀點[18]。另外，其菌液中有檢測到己酸乙酯和丁酸乙酯，而丁酸乙酯、己酸乙酯、己酸、丁酸是濃香型白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，這與胡曉龍篩選出的Clostridium kluyveriN6己酸菌液揮發(fā)性物質(zhì)較為類似[1]。

同理，觀察圖2可知，Clostridium kogasensisstrain xsk2菌株在pH6時，菌液中己酸含量相比其他pH值條件下更高，且此時乙酸、丁酸含量也處于最高水平，說明該菌株在pH6條件下適宜生存。另外，此菌株菌液中也檢測出丁酸乙酯和己酸乙酯，說明其對濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成起到促進作用。

綜上所述，上述兩株己酸菌皆適宜在pH6條件下生長。

2.1.5 兩株己酸菌株乙醇耐受性實驗（圖3）

由圖3可知，在不添加乙醇時，Clostridium guangxiensestrain xsk1菌液中己酸含量相比添加乙醇己酸含量更高，這說明其在不含乙醇的環(huán)境下也可生長良好，從而證明了梭菌可利用底物的多樣性，同時，丁酸和乙酸含量也呈現(xiàn)出類似現(xiàn)象，這與己酸的產(chǎn)生機制較為吻合[19]。另外，不添加乙醇與添加1%乙醇培養(yǎng)的菌液中己酸含量較為接近，這說明1%含量乙醇可能并未對該菌株產(chǎn)生較強脅迫，而適量乙醇也可為該己酸菌提供碳源物質(zhì)[19]。值得注意的是，隨著乙醇含量的增大，菌液中己酸、乙酸、丁酸含量皆逐漸降低，當(dāng)乙醇含量增加到7%時，菌液中有機酸含量幾乎不再變化，結(jié)合表3可知，這可能與該菌株在7%乙醇條件下培養(yǎng)4 d后幾乎全部死亡有關(guān)。

Clostridium kogasensisstrain xsk2菌株在1%乙醇含量時己酸、乙酸和丁酸高于其他乙醇含量條件下菌液有機酸含量，可見1%乙醇含量為其適宜生長條件。結(jié)合表3可知，不添加乙醇時菌液中己酸菌數(shù)量高于添加1%乙醇時的菌液，而前者己酸含量卻低于后者，這可能是己酸、丁酸含量過高抑制了己酸菌的生長[20]。

圖3 Clostridium guangxiense strain xsk1（a）、Clostridium kogasensis strain xsk2（b）在不同乙醇含量下發(fā)酵液中揮發(fā)性成分變化

表3 不同乙醇添加量菌液中己酸菌數(shù)量

圖4 兩株己酸菌的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

綜上所述，可知兩株己酸菌的乙醇耐受范圍基本處于0%～5%之間。

2.1.6 兩株己酸菌生理生化特征總結(jié)

如表4所示，兩株己酸菌在許多性質(zhì)上較為相似，這可能與其在窖池中經(jīng)過長期馴化有關(guān)。

表4 兩株己酸菌生理生化特性

表5 人工窖泥己酸菌數(shù)量檢測結(jié)果

2.1.7 兩株己酸菌系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖4可知，從窖泥a中篩選出的兩株己酸菌分布于梭菌屬，其與Clostridium kluyveri菌株遺傳學(xué)地位相對較遠，說明了己酸菌具有豐富的遺傳多樣性[21]。

2.2 己酸菌Clostridium guangxiense strain xsk1在人工窖泥培養(yǎng)中的運用

2.2.1 不同載體人工窖泥的培養(yǎng)

由表5可知，不同載體人工窖泥中己酸菌數(shù)量差異顯著，其中，粉末活性炭載體人工窖泥＞黃泥、粉末活性炭和顆?；钚蕴枯d體人工窖泥＞黃泥、粉末活性炭載體人工窖泥＞黃泥載體人工窖泥，而唯有粉末活性炭載體人工窖泥中的己酸菌數(shù)量超過窖泥a。雖然各載體人工窖泥己酸菌數(shù)量高低不同，但是仍需要進一步評估其發(fā)酵效果。

2.2.2 各載體人工窖泥的發(fā)酵性能

由圖5可知，初始酒醅己酸含量幾乎為零，厭氧發(fā)酵50 d后，各種窖泥發(fā)酵的酒醅中己酸含量幾乎都高于不添加窖泥發(fā)酵的酒醅，這說明窖泥對于己酸的形成具有促進作用。按照5%比例添加的窖泥a發(fā)酵的酒醅己酸含量與不加窖泥發(fā)酵的酒醅較為接近，但是其明顯低于按照10%、15%比例添加的窖泥a發(fā)酵的酒醅，且按照10%比例添加的窖泥a發(fā)酵的酒醅己酸含量略高于15%比例添加的窖泥a發(fā)酵的酒醅，這說明適量的窖泥搭配酒醅發(fā)酵效果可能會更好，而添加不同比例的黃泥載體人工窖泥的發(fā)酵酒醅的結(jié)果也證明了這點。另外，按5%、10%、15%比例添加的粉末活性炭載體人工窖泥發(fā)酵的酒醅，其己酸含量要略高或者顯著高于其他3種載體的人工窖泥發(fā)酵的酒醅，但是，其更為接近窖泥a發(fā)酵酒醅的己酸含量。

對比酒醅中己酸乙酯含量可知，初始酒醅中己酸乙酯含量幾乎為零，窖泥a發(fā)酵的酒醅己酸乙酯含量顯著高于不添加窖泥的酒醅，且其明顯高于其他各載體人工窖泥發(fā)酵的酒醅。其中，粉末活性炭載體人工窖泥發(fā)酵的酒醅己酸乙酯含量最為接近窖泥a發(fā)酵的酒醅。另外，可能由于酒醅發(fā)酵是在厭氧袋中進行的，過早的厭氧環(huán)境導(dǎo)致了酵母菌死亡過多，造成酒精產(chǎn)量較低，最終導(dǎo)致各載體人工窖泥相比不加窖泥發(fā)酵的酒醅己酸乙酯含量差異不大。

對比酒醅中乙酸含量可知，除去窖泥a，其他4種載體人工窖泥按照5%、10%比例發(fā)酵的酒醅中乙酸含量相差不大，且都顯著低于按照15%比例添加的相應(yīng)載體窖泥發(fā)酵的酒醅。而上述4種人工窖泥按照15%比例發(fā)酵的酒醅中乙酸含量與窖泥a按照10%、15%比例發(fā)酵的酒醅相差不大，但都顯著高于不加窖泥發(fā)酵的酒醅。

對比酒醅中丁酸含量可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，酒醅中丁酸含量一般都高于發(fā)酵初始酒醅，其中15%比例添加的窖泥發(fā)酵的酒醅中丁酸含量一般都不低于5%、10%比例添加的窖泥發(fā)酵的酒醅，而且各載體人工窖泥發(fā)酵的酒醅與窖泥a發(fā)酵的酒醅丁酸含量相差不大。

綜上所述，發(fā)現(xiàn)粉末活性炭載體人工窖泥的發(fā)酵性能更為接近窖泥a，考慮到其具有靈活的形狀可塑性，在生物反應(yīng)器中使用時容易取出，因此選定其作為適合生物反應(yīng)器使用的新型窖泥。

圖5 酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)含量

3 結(jié)論

己酸菌作為窖泥中的功能菌，其對合成己酸乙酯具有重要作用。本研究采用厭氧培養(yǎng)袋方法從窖泥中分離出兩株己酸菌：Clostridium guangxiensestrain xsk1和Clostridium kogasensisstrain xsk2，菌株較適生長條件皆是pH6，乙醇耐受范圍皆處于0%～5%之間。其厭氧培養(yǎng)10 d后，前者代謝產(chǎn)物為：己酸4.51 g/L、丁酸7.07 g/L、乙酸7.47 g/L、丁酸乙酯0.20 g/L、己酸乙酯0.13 g/L；后者代謝產(chǎn)物為：己酸2.5 g/L、丁酸1.6 g/L、乙酸2.36 g/L、丁酸乙酯0.09 g/L、己酸乙酯0.36 g/L，由此可見，上述兩株己酸菌在濃香型白酒發(fā)酵上可能具有良好的運用前景[22]。另外，根據(jù)16S rRNA分析，上述兩株己酸菌與模式菌株Clostridium kluyveri在遺傳學(xué)性質(zhì)上有顯著不同，而且這兩株己酸菌在發(fā)育地位上也相隔較遠，從而說明己酸菌可能具有豐富的遺傳多樣性。

將高產(chǎn)己酸的Clostridium guangxiensestrain xsk1菌株作為己酸菌來源培養(yǎng)多種載體的人工窖泥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)60 d后的粉末活性炭載體人工窖泥中己酸菌數(shù)量為1.77×108cfu/g，黃泥載體人工窖泥己酸菌數(shù)量為1.18×105cfu/g，黃泥、粉末活性炭載體人工窖泥己酸菌數(shù)量為3.68×105cfu/g，黃泥、粉末活性炭和顆?；钚蕴枯d體人工窖泥己酸菌數(shù)量達到2.08×106cfu/g。其中，粉末活性炭載體人工窖泥己酸菌數(shù)量高于窖泥a。之后，對比上述各載體人工窖泥和窖泥a的發(fā)酵效果發(fā)現(xiàn)，粉末活性炭載體人工窖泥發(fā)酵性能較為接近窖泥a。

綜上所述，鑒于窖泥中微生物眾多，本文只專注于窖泥中的己酸菌方面，這具有一定的局限性；而且，發(fā)酵后的酒醅中揮發(fā)性成分眾多，而本文只檢測少許物質(zhì)，因此在后續(xù)實驗中仍需要采用精密的檢測儀器進一步完善。