楊愛華 ，劉 雪 ，2，張學梅 ，曹建全 ，2

（1.山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東景芝262119； 2.山東省釀造食品生物發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，山東景芝262119）

己酸菌是一類梭狀芽孢桿菌，其代謝產(chǎn)物己酸是濃香型白酒主體香氣物質(zhì)己酸乙酯的前體物質(zhì)，因此己酸菌在窖池內(nèi)生長及產(chǎn)酸能力強弱將直接影響到白酒的品質(zhì)。長期以來，如何提高以己酸菌為目的的有益窖泥功能微生物的數(shù)量，增強己酸菌代謝產(chǎn)生己酸的能力，一直是酒廠及科研單位探索和研究的方向。各酒廠分離得到的己酸菌產(chǎn)生能力不盡相同，一般為3～6 g/L[1]。如彭兵等[2]通過對從優(yōu)質(zhì)窖泥中分離獲得的己酸菌發(fā)酵條件的優(yōu)化，己酸產(chǎn)量為4.36 g/L；薛正楷等[3]篩選得到的己酸菌產(chǎn)己酸能力達到了5.47 g/L；本廠從優(yōu)質(zhì)老窖泥中篩選得到1株實驗室產(chǎn)酸水平在6.5 g/L的己酸菌[4]。

影響己酸菌生長繁殖以及代謝產(chǎn)酸的因素較多，包括碳、氮、礦物質(zhì)元素、水分、溫度、酸度、乙醇濃度等，且在白酒釀造過程中，己酸菌主要以窖泥為生長繁殖的載體。而窖泥中除含有己酸菌之外，還存在大量的丁酸菌、甲烷菌、放線菌等共棲微生物[5]。近年來，己酸菌混合培養(yǎng)體系引起了廣泛關(guān)注，利用微生物之間共棲性來推動己酸菌的發(fā)酵能力。陳翔等在己酸菌培養(yǎng)基中加入大曲粉、粉碎的酒醅，并將培養(yǎng)成熟的混合己酸菌液用于窖泥制作，取得了較好的效果；司波等[6]從己酸菌的生長特性出發(fā)，改善工藝條件，加入了窖泥、黃水和香醅，創(chuàng)造利于己酸菌生長和產(chǎn)酸且有效抑制雜菌生長的環(huán)境，提高了己酸菌培養(yǎng)液的質(zhì)量及合格率；郭威等[7]篩選得到1株對己酸菌產(chǎn)酸有明顯促進作用的優(yōu)良放線菌；此外，己酸菌與丁酸菌[8]以及己酸菌與酵母混合培養(yǎng)都取得了很好的效果。

本研究從菌種復(fù)壯、大曲及窖泥處理方式和己酸菌與酵母混合培養(yǎng)等方面出發(fā)，改進窖泥功能菌液的培養(yǎng)工藝，增強己酸菌生長及產(chǎn)酸能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

己酸菌JZ-79、JZ-80由本廠優(yōu)質(zhì)老窖泥中分離得到；酵母菌由本實驗室篩選并保藏；窖泥取自本廠優(yōu)質(zhì)老窖泥；大曲粉為本廠自制。

1.1.2 試劑

乙酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸銨、碳酸鈣、硫化鈉、乙醚、乙醇、瓊脂粉、硫酸銅等，國藥集團化學試劑有限公司；酵母膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

磨口三角瓶、平底燒瓶及卡氏罐培養(yǎng)基：酵母膏5 g/L、蛋白胨5 g/L、MgSO40.2 g/L、K2HPO40.4 g/L、(NH4)2SO40.5 g/L、NaAc 6 g/L,加蒸餾水定容至1 L，121℃下滅菌20 min；接種前加入無水乙醇2%、CaCO35 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3751-PC高壓蒸汽滅菌鍋，日本松下公司；DHG型電熱恒溫鼓風干燥箱、DNP型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；5804R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；氣相色譜儀，美國Agilent 7890A型氣相色譜儀；色譜柱，CP-WAX 57CB毛細管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)；厭氧發(fā)酵罐，山東泰山集團泰安市普瑞特機械制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 己酸菌的復(fù)壯

對所用己酸菌種包括JZ-79、JZ-80以及取自本廠窖池的優(yōu)質(zhì)老窖泥，進行復(fù)壯：85℃水浴加熱10 min，按10%接種量接種于磨口三角瓶中，培養(yǎng)7 d后，測定各項發(fā)酵參數(shù)，包括細菌總數(shù)、硫酸銅顯色，總酸、己酸、乙酸及丁酸含量，共進行4個輪次。

1.3.2 己酸菌的發(fā)酵罐培養(yǎng)

(1)己酸菌種子液的培養(yǎng)：將復(fù)壯后的己酸菌以體積分數(shù)10%的接種量接種到磨口三角瓶內(nèi)，接種后三角瓶內(nèi)裝液量控制在90%以上，并對三角瓶封口。三角瓶內(nèi)培養(yǎng)成熟的己酸菌按10%接種量接種于1 L的平底燒瓶內(nèi)進行擴大培養(yǎng)，隨后接入卡氏罐中培養(yǎng)成熟，作為種子使用。

(2)大曲及窖泥實驗方法：研究不同窖泥及大曲處理方法對發(fā)酵結(jié)果的影響，不同接種量及窖泥、大曲處理方式見表1。

表1 大曲及窖泥處理方法設(shè)計

(3)己酸菌與酵母菌的混合培養(yǎng)

酵母菌種子液培養(yǎng)：從試管中接入經(jīng)過培養(yǎng)基滅菌的小三角瓶，再以10%接種量接入大三角瓶，隨后以10%接種量轉(zhuǎn)入小型發(fā)酵罐中繼續(xù)擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟，作為種子液使用。

己酸菌與酵母的混合培養(yǎng)：在發(fā)酵罐培養(yǎng)基中接入10%的按(1)方法培養(yǎng)的己酸菌種子液和2%上述培養(yǎng)方法得到的酵母菌種子液，混合培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35℃，時間為7 d。

1.3.3 菌體濃度測定

血球計數(shù)板計數(shù)：取5 mL適量培養(yǎng)液，以超純水稀釋適當倍數(shù)，用血球計數(shù)板計數(shù)富集菌液中的活菌數(shù)。

細菌總數(shù)計數(shù)：發(fā)酵結(jié)束后，采用上述血球計數(shù)板方法對發(fā)酵液中總菌數(shù)進行計數(shù)。

芽孢桿菌計數(shù)：發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液搖勻后取2 mL，加入8 mL無菌水中，80℃加熱10 min，冷卻后接入EAM培養(yǎng)基中，用封口膜封口，35℃培養(yǎng)24 h，再利用上述血球計數(shù)板法進行計數(shù)。

1.3.4 硫酸銅顯色法[9]

吸取2 mL的培養(yǎng)液加入到試管中，加入2 mL 2%的CuSO4和1 mL乙醚，振蕩搖勻后靜置分層，觀察乙醚層，呈現(xiàn)藍色則說明有己酸生成。

1.3.5 氣相色譜法測定發(fā)酵樣品中的有機酸含量

色譜檢測條件：CP-WAX 57CB毛細管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)；檢測器為氫火焰離子檢測器；柱溫采取程序升溫，初始溫度為35℃，保持3 min，然后以3.5℃/min的速率升溫，升至180℃，再以15℃/min升至200℃，保持10 min；進樣口溫度為220℃，檢測室溫度為240℃；載氣：(99.999%高純氮氣)流速為30 mL/min，氫氣為30 mL/min，空氣為350 mL/min；柱流速為0.8 mL/min，分流比35∶1,進樣量為0.8 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 己酸菌的復(fù)壯

長期保藏以及重復(fù)使用的己酸菌菌種，其繁殖及產(chǎn)酸能力會有所下降，利用熱處理的方法對其產(chǎn)酸能力進行復(fù)壯。菌株JZ-79、JZ-80由本廠分離篩選，利用甘油管法保藏于-80℃冰箱，窖泥為本廠優(yōu)質(zhì)老窖泥。對上述菌株采用80℃處理10 min，菌數(shù)變化如圖1。熱處理發(fā)酵7 d，JZ-79、JZ-80及窖泥1的菌數(shù)變化趨勢一致，活菌數(shù)有所下降，特別對窖泥而言，熱處理淘汰了大量的雜菌。連續(xù)熱處理復(fù)壯，菌數(shù)基本保持不變。

圖1 己酸菌復(fù)壯不同輪次菌數(shù)的變化趨勢

經(jīng)過兩輪次復(fù)壯后，總菌數(shù)有所降低，但己酸產(chǎn)量明顯增加(圖2)。菌株JZ-79及優(yōu)質(zhì)老窖泥經(jīng)復(fù)壯兩輪己酸產(chǎn)量最高，分別為2909.7 mg/L和3113.1 mg/L，JZ-80復(fù)壯一輪己酸產(chǎn)量最高為3260.2 mg/L。可能是由于分離得到的菌種不同，芽孢的耐熱能力各不相同，菌株達到最大產(chǎn)己酸能力需要經(jīng)過復(fù)壯的輪次不同。

2.2 大曲不同處理方式對己酸菌發(fā)酵影響

由表2可知，將大曲粉進行加熱處理，己酸產(chǎn)量為2762.7 mg/L，比未處理的2324.8 mg/L高了18.8%。大曲粉內(nèi)除含有可提供己酸菌生長的營養(yǎng)物質(zhì)外，還有大量的其他微生物，未經(jīng)熱處理的大曲粉，大曲內(nèi)的微生物也將繁殖，導致大量雜菌的生長，而己酸菌的生長受到抑制，致使己酸產(chǎn)量受到影響。而熱處理的方法淘汰了大量的雜菌。因此，在己酸菌培養(yǎng)過程中，可添加適量大曲粉，且大曲粉需在罐內(nèi)經(jīng)熱處理，以提供己酸菌生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)，提高發(fā)酵過程中己酸菌濃度，再結(jié)合其他強化己酸合成的策略，從而提高己酸最終產(chǎn)量。

2.3 窖泥不同處理方式提高己酸產(chǎn)量

本輪實驗探討了己酸菌大罐培養(yǎng)基中添加的窖泥的處理方法對發(fā)酵的影響。結(jié)果如表3，發(fā)現(xiàn)以純卡氏罐己酸菌種子接種以及純窖泥接種時，己酸含量分別為2762.7 mg/L和2613.8 mg/L。當二者同時接種時，己酸含量為3029.5 mg/L，較單獨接種分別提高了9.7%和15.9%。純種培養(yǎng)的己酸菌，菌株強壯且產(chǎn)酸能力強，但己酸菌生長及產(chǎn)酸對培養(yǎng)條件要求較高。而窖池內(nèi)環(huán)境非常復(fù)雜，在己酸菌培養(yǎng)過程中添加適量的窖泥，培養(yǎng)成熟窖泥中含有豐富的微生物及微量元素，對于促進己酸菌產(chǎn)酸及適應(yīng)窖池內(nèi)環(huán)境必不可少。同時發(fā)現(xiàn)，當窖泥經(jīng)過加熱處理之后再接種，己酸產(chǎn)量略有降低，為2934.6 mg/L，較未經(jīng)過處理時僅降低了3.1%。但經(jīng)熱處理后，能夠淘汰窖泥中大量的雜菌，且降低了發(fā)酵過程中的乙酸濃度，由3439.3 mg/L降低至3017.8 mg/L，降低了14.0%。

圖2 己酸菌復(fù)壯不同輪次酸度的變化趨勢

表2 大曲處理方法對發(fā)酵的影響

表3 窖泥不同處理方法對己酸發(fā)酵結(jié)果的影響

2.4 己酸菌與酵母混合培養(yǎng)提高己酸產(chǎn)量

復(fù)壯的菌株JZ-79、JZ-80以及熱處理一輪的本廠優(yōu)質(zhì)老窖泥富集液，分別與酵母菌混合培養(yǎng)，并對以上3種菌進行混合培養(yǎng)。如圖3所示，與酵母菌混合培養(yǎng)后，活菌總數(shù)增加，而芽孢桿菌數(shù)除優(yōu)質(zhì)老窖泥外，沒有明顯差異。與酵母菌混合培養(yǎng)后，JZ-79、JZ-80、優(yōu)質(zhì)老窖泥富集液和3種菌混合培養(yǎng)的總酸包括己酸、丁酸以及乙酸含量都有所提高(圖4)，己酸含量分別由2795.9 mg/L、2930.4 mg/L、2110.5 mg/L和3067.5 m/L，提高至3204.3 mg/L、3439.3 mg/L、3025.7 mg/L和3365.6 mg/L；合成己酸的前體物質(zhì)丁酸較原來也有明顯提高，分別達到6431.8mg/L、6371.8mg/L、5557.0mg/L和6590.6mg/L。隨后，在己酸菌培養(yǎng)基中提高酵母粉的添加量，己酸產(chǎn)量并未提高（數(shù)據(jù)未顯示），因此，己酸產(chǎn)量提高的原因不是酵母給予己酸菌提供的營養(yǎng)物質(zhì)。與酵母菌混合培養(yǎng)產(chǎn)酸提高的主要原因正如文獻報道，可能是由于酵母菌的加入能夠改善己酸菌生長的厭氧條件，從而強化了由乙酸到丁酸和由丁酸到己酸的代謝途徑，進而提高了乙酸及丁酸的轉(zhuǎn)化率[1]。

圖3 己酸菌與酵母混合培養(yǎng)的菌數(shù)對比

圖4 己酸菌與酵母混合培養(yǎng)的菌數(shù)有機酸含量對比

3 結(jié)論

本研究從菌種復(fù)壯、大曲及窖泥處理方式和己酸菌與酵母混合培養(yǎng)等方面出發(fā)，增強己酸菌生長及產(chǎn)酸能力：經(jīng)熱處理復(fù)壯的菌種，產(chǎn)酸能力明顯提高，JZ-80復(fù)壯兩輪、JZ-79和優(yōu)質(zhì)老窖泥富集液復(fù)壯一輪效果最好；經(jīng)過熱處理的大曲粉和窖泥，既有效促進己酸菌的生長及產(chǎn)酸，同時還能為己酸菌快速適應(yīng)窖池內(nèi)環(huán)境奠定一定的基礎(chǔ)；酵母菌對己酸菌產(chǎn)己酸有較好的促進作用，且多種己酸菌混合培養(yǎng)產(chǎn)酸情況優(yōu)于單一己酸菌培養(yǎng)。本研究通過不斷探索和實驗，己酸菌產(chǎn)酸能力有了很大的提升，為生產(chǎn)高質(zhì)量的濃香型窖泥功能菌液提供了參考和依據(jù)。