袁瑾懿 ， 余 慧， 郭 燕， 徐曉剛

銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌耐藥現(xiàn)象日益嚴重，已出現(xiàn)對常用抗菌藥物不敏感的廣泛耐藥（extensively drug resistant，XDR）菌株，成為全球關(guān)注焦點[1]。氨基糖苷類抗生素被廣泛應(yīng)用于臨床，在耐藥革蘭陰性菌、尤其是銅綠假單胞菌所致感染的抗菌治療中，是聯(lián)合用藥的重要品種之一[2]。氨基糖苷類鈍化酶廣泛分布在革蘭陽性和革蘭陰性細菌，通過修飾氨基糖苷類的特定活性部位、影響藥物與靶位結(jié)合，導(dǎo)致細菌對特定的氨基糖苷類耐藥，曾被認為是細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥的主要機制[3]。近年法國和日本學(xué)者先后發(fā)現(xiàn)了一系列由質(zhì)粒介導(dǎo)的新的耐藥機制——16S rRNA甲基化酶（rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA和armA等基因編碼）[4-9]。這些基因位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，易于傳播，成為抗感染治療的重要課題。

本課題組曾報道在上海地區(qū)銅綠假單胞菌臨床分離株中首次檢出16S rRNA甲基化酶基因armA及rmtB[10]。16S rRNA甲基化酶陽性菌株多為多重耐藥或泛耐藥菌株，提示此類耐藥菌株中存在甲基化酶基因傳播。因此，我們補充收集了59株XDR銅綠假單胞菌，就菌株同源性、16S rRNA甲基化酶基因分布及此類耐藥基因周邊結(jié)構(gòu)進行了分析，以進一步認識16S rRNA甲基化酶基因在銅綠假單胞菌中的傳播機制，并為此類耐藥細菌所致醫(yī)院感染的預(yù)防與控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院2005－2006年臨床分離的、紙片擴散法判定為XDR的銅綠假單胞菌，剔除同一患者分離的重復(fù)菌株，共59株。XDR定義為對所有常用抗菌藥物（除多黏菌素）均耐藥。大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司。質(zhì)控菌株均為華山醫(yī)院抗生素研究所臨床微生物室保存菌株。

1.1.2 主要藥物和生化試劑 限制性內(nèi)切酶（BamHI、EcoRI及HindIII），T4連接酶、rTaq酶等分子生物學(xué)試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MIC測定 采用瓊脂稀釋法測定慶大霉素和阿米卡星對銅綠假單胞菌的MIC，按 CLSI 2016標準[11]判讀結(jié)果。

1.2.2 16S rRNA甲基化酶基因檢測及ERIC-PCR分型 參考文獻 [4-10， 12]設(shè)計引物并進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 16S rRNA甲基化酶基因周邊序列分析 隨機選取ERIC-PCR分型為D型，編號為HSPA 23（rmtB陽性）、HSPA 26（armA陽性）臨床株用于周邊序列分析，轉(zhuǎn)種臨床株以及含pUC18的大腸埃希菌DH5α，抽提質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI及HindIII分別酶切各質(zhì)粒，使用T4連接酶連接臨床株野生質(zhì)粒與pUC18質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。實驗參考《分子克隆實驗指南》，并按相關(guān)試劑盒說明書操作。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞后，涂布于含100 mg/L慶大霉素的LB平皿，獲得轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR確認后質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測序，序列與GenBank序列進行比對、分析。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher's exact test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銅綠假單胞菌對氨基糖苷類抗生素的敏感性

瓊脂稀釋法藥敏測定顯示，59株臨床分離銅綠假單胞菌對慶大霉素均耐藥，對阿米卡星耐藥率為88.1%（見表1）。

2.2 銅綠假單胞菌16S rRNA甲基化酶基因分布

59株臨床分離銅綠假單胞菌的16S rRNA甲基化酶基因總檢出率62.7%（37/59），其中armA檢出率28.8%（17/59），rmtB檢出率37.3%（22/59）；2株銅綠假單胞菌同時檢出armA和rmtB基因；未檢出其他甲基化酶基因。16S rRNA甲基化酶基因僅見于慶大霉素高耐（MIC≥128 mg/L）菌株，16S rRNA陽性株對阿米卡星的敏感率低于陰性株（2.7%比22.7%，P=0.011）（見表1），armA和rmtB陽性菌株的阿米卡星MIC50均＞128 mg/L。

表1 59株銅綠假單胞菌對慶大霉素的藥敏結(jié)果及16S rRNA甲基化酶檢出情況Table 1 Distribution of gentamicin MIC values and 16S rRNA methylase genes in 59 strains of extensively drug resistant Pseudomonas aeruginosa

2.3 銅綠假單胞菌臨床分離株的同源性

根據(jù)ERIC-PCR的條帶譜型，59株受試株可分為19個型別，其中D型最為常見（31株，52.5%）。檢出armA的17株銅綠假單胞菌集中分布在D、E、和I 3個譜型，其中D型占88.2%（15/17）。檢出rmtB的22株銅綠假單胞菌散布在9個譜型。

2.4 16SrRNA甲基化酶基因周邊序列

2.4.1armA基因周邊序列 臨床分離株HSPA 26經(jīng)酶切、克隆及慶大霉素平皿篩選，僅HindIII酶切產(chǎn)物有攜帶armA基因的轉(zhuǎn)化子，測序獲得的拼接序列長度為4 042 bp，與GenBank序列比對結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌臨床分離株攜帶armA基因位于一含多種轉(zhuǎn)座酶的DNA序列（圖1），與大腸埃希菌質(zhì)粒pNDM-HK（登錄號HQ451074）、鮑曼不動桿菌質(zhì)粒pZJ06（登錄號CP001938）攜帶的armA陽性質(zhì)粒序列一致性達99%。

圖1 銅綠假單胞菌臨床株armA基因周邊基因結(jié)構(gòu)同源質(zhì)粒示意圖Figure 1 Schematic depiction of the flanking sequences of armA gene in Pseudomonas aeruginosa isolate，which is homologous to the armA-positive plasmid

2.4.2rmtB基因周邊序列 臨床分離株HSPA 23經(jīng)酶切、克隆及慶大霉素平皿篩選，也只有HindIII酶切產(chǎn)物有攜帶rmtB基因的轉(zhuǎn)化子，測序獲得的拼接序列長度為3 035 bp，與GenBank序列比對結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌臨床分離株攜帶rmtB基因位于一含轉(zhuǎn)座酶的序列，其上游有一blaTEM-1基因，這2個耐藥基因與源自大腸埃希菌（登錄號HG003695）和肺炎克雷伯菌（登錄號CP003225）的質(zhì)粒序列一致性高；但本研究獲得的銅綠假單胞菌序列中，兩耐藥基因間有一銅綠假單胞菌特有的轉(zhuǎn)座酶基因（圖2）。

3 討論

2003年法國和日本學(xué)者先后發(fā)現(xiàn)了一種由質(zhì)粒介導(dǎo)的新的耐藥機制——16S rRNA甲基化酶，甲基化酶修飾細菌核糖體16S rRNA，通過靶位改變導(dǎo)致細菌對多種氨基糖苷類抗生素耐藥，該酶導(dǎo)致革蘭陰性桿菌對慶大霉素等多種臨床常用氨基糖苷類藥物高度耐藥。繼而，有多個國家和地區(qū)在多種革蘭陰性桿菌中檢測到編碼這類酶的基因，包括rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA和armA[4-10]，以及本研究后期發(fā)現(xiàn)的rmtF、rmtG和rmtH[13-15]。這些基因位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，易于傳播，成為抗感染治療的重要問題。

圖2 銅綠假單胞菌臨床株rmtB基因周邊基因結(jié)構(gòu)Figure 2 Homology analysis of the flanking sequences of rmtB gene in Pseudomonas aeruginosa isolate

16S rRNA甲基化可導(dǎo)致革蘭陰性菌對氨基糖苷類高水平耐藥[16]。自發(fā)現(xiàn)以來，先后在銅綠假單胞菌、黏質(zhì)沙雷菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、奇異變形桿菌等多種細菌中檢出16S rRNA甲基化酶基因[4-10，13，17-26]。銅綠假單胞菌臨床株中已檢出攜帶armA、rmtA、rmtB和rmtD等16S rRNA甲基化酶基因，不同地區(qū)基因分布差異較大：日本臨床分離株中rmtA陽性率0.8%[20]；在我國，氨基糖苷類高水平耐藥株中armA和rmtB陽性率分別為74.3%和14.3%[4]，亞胺培南耐藥株中rmtA陽性率為5.9%[21]，多重耐藥株中rmtB陽性率10%～42.4%[22-24]；越南[25]和巴西[26]亞胺培南耐藥株中rmtD陽性率分別為13.5%和75%。本研究中，16S rRNA甲基化酶基因在XDR銅綠假單胞菌分離株中分布廣泛，總檢出率高達62.7%，均為armA和rmtB，并全部在慶大霉素高度耐藥菌株中檢出，這與之前上海地區(qū)報道結(jié)果基本相符。ERIC-PCR結(jié)果顯示，armA基因在特定譜型中檢出率高，提示攜帶該基因的菌株存在克隆傳播，醫(yī)院感染防控需關(guān)注消毒、隔離。

既往對16S rRNA甲基化酶周邊結(jié)構(gòu)研究顯示，rmtA與轉(zhuǎn)座子Tn5041相連[27]，而rmtB則被Tn3-類似結(jié)構(gòu)包圍[17]。armA基因位于轉(zhuǎn)座子Tn1548上，并與一個可介導(dǎo)多重耐藥的1型整合子共同存在于一個大質(zhì)粒上[28-29]?；谶@些周邊結(jié)構(gòu)分析，16S rRNA的傳播被認為是由大質(zhì)粒上的可移動元件介導(dǎo)。本研究對銅綠假單胞菌臨床分離株armA和rmtB基因周邊序列分析結(jié)果與之相似，armA基因周邊含多種假定轉(zhuǎn)座酶（putative transposase），與大腸埃希菌（pNDM-HK）、鮑曼不動桿菌（pZJ06）攜帶的armA陽性質(zhì)粒序列一致性達99%；rmtB基因同樣位于一含多種轉(zhuǎn)座酶的序列，耐藥基因與源自大腸埃希菌（登錄號HG003695）和肺炎克雷伯菌（登錄號CP003225）的質(zhì)粒序列一致性高，但轉(zhuǎn)座酶與源自一耐多藥銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosaNCGM2.S1）的序列同源，與大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的轉(zhuǎn)座酶不同。鑒于armA及rmtB周邊均含轉(zhuǎn)座酶，推測兩基因位于質(zhì)粒攜帶的移動元件，提示此類耐藥基因可在不同菌種間水平傳播。

總之，研究結(jié)果顯示16S rRNA甲基化酶基因在XDR銅綠假單胞菌分離株中分布廣泛，均在對慶大霉素高度耐藥的菌株中檢出。armA在銅綠假單胞菌中存在克隆傳播，且armA及rmtB基因可能位于質(zhì)粒攜帶的移動元件，會在不同菌種間水平傳播。研究結(jié)果可為醫(yī)院感染控制策略制定提供參考依據(jù)。

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