袁瑾懿， 徐曉剛， 胡付品， 郭 燕， 楊 洋， 董 棟， 徐慶慶， 丁百興， 王明貴

肺炎克雷伯菌是臨床最重要的條件致病菌之一，可導(dǎo)致肺部感染、尿路感染、血流感染、化膿性肝膿腫、眼內(nèi)炎、腦膜炎等多種感染性疾病，重則威脅生命[1-2]。其耐藥率逐年升高，尤其多重耐藥菌株日益增多，已成為全球關(guān)注焦點(diǎn)[3]。

多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是最常用的細(xì)菌基因分型方法之一，肺炎克雷伯菌的MLST方法最初建立于2005年[4]，后被廣泛用于對(duì)肺炎克雷伯菌臨床菌株耐藥性、毒力等的特征分析和分子流行病學(xué)研究[5]。

ST11為我國(guó)肺炎克雷伯菌臨床株中最主要型別，ST15、23和29型等亦多見[6-7]。ST11型肺炎克雷伯菌為常見耐藥克隆，已有產(chǎn)碳青霉烯酶（KPC-2和VIM-1等）、超廣譜β內(nèi)酰胺酶（CTX-M和SHV等）和16S rRNA甲基化酶的ST11型肺炎克雷伯菌在世界各地流行[8-10]。除β內(nèi)酰胺酶和16S rRNA甲基化酶外，ST11型肺炎克雷伯菌還常同時(shí)存在喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）突變、并攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因，故常呈多重耐藥[11]。ST11型多重耐藥肺炎克雷伯菌近年在中國(guó)廣泛傳播[12-14]。不同于歐美國(guó)家以ST258型為主[15]，我國(guó)碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌主要為ST11型、其次為ST15型[16-17]。我國(guó)替加環(huán)素耐藥肺炎克雷伯菌株也是以ST11和ST15型為主[18-19]。

為了解復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院臨床分離肺炎克雷伯菌基本情況，本研究收集2010年本院臨床分離肺炎克雷伯菌112株進(jìn)行耐藥性及分子流行病學(xué)分析，以期對(duì)本院肺炎克雷伯菌耐藥克隆傳播的防控及抗菌治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 連續(xù)收集2010年3－5月我院臨床分離的肺炎克雷伯菌，按常規(guī)方法進(jìn)行菌種鑒定，剔除同一患者同一部位重復(fù)分離菌株，共獲得112株。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922為本研究所臨床微生物室保存菌株。

1.1.2 病史資料 采集患者住院期間的病史資料，包括性別、年齡、科室、標(biāo)本來(lái)源和菌株分離時(shí)間等資料。

1.1.3 主要試劑 藥敏試驗(yàn)所用萘啶酸為Sigma-Alorich公司產(chǎn)品（純度≥98%），余抗菌藥物粉劑來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?，PCR相關(guān)試劑均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂稀釋法測(cè)定抗菌藥敏感性 按照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）文件[20]推薦的瓊脂稀釋法測(cè)定抗菌藥物對(duì)受試菌株的MIC。替加環(huán)素按照美國(guó)FDA規(guī)定的折點(diǎn)（http://www.pfizerpro.com/hcp/tygacil）判定耐藥、中介和敏感，其他抗菌藥物按照2017年CLSI規(guī)定的折點(diǎn)判定（其中萘啶酸和諾氟沙星采用尿液分離菌標(biāo)準(zhǔn)）。

1.2.2 MLST 分型根據(jù)http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html網(wǎng)站提示設(shè)計(jì)引物并對(duì)部分菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送杰里生物科技公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交該網(wǎng)站進(jìn)行分析，并使用eBURST V3在線軟件（http://eburst.mlst.net/）進(jìn)行聚類分析。

1.2.3 耐藥基因檢測(cè) 參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物并對(duì)部分菌株P(guān)CR擴(kuò)增檢測(cè)16S rRNA甲基化酶armA、rmtB、rmtD基因[21]、gyrA和parCQRDR[22]、多重耐藥外排泵oqxAB基因[23]、質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥元件qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6')-lbcr和qepA基因[24-29]、β內(nèi)酰胺酶基因blaCTX-M1組、2組、9組和8/25/26組[30-31]、blaSHV和blaTEM和碳青霉烯酶blaKPC[32]。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS statistics 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher's exact test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌臨床株來(lái)源

112株肺炎克雷伯菌臨床株主要來(lái)源于痰標(biāo)本（76株，67.9%），19.6%來(lái)源于尿標(biāo)本（22株），血培養(yǎng)（5株）和其他無(wú)菌體液（4株）標(biāo)本共占8.0%。

94.6%（106株）的受試菌株分離自住院患者，共涉及11個(gè)科室，其中老年科（25/106，23.6%）、腦外科（23/106，21.7%）、康復(fù)科（19/106，17.9%）和ICU（12/106，11.3%）為主要科室來(lái)源，綜合病房、普外科、感染科、神經(jīng)內(nèi)科、內(nèi)分泌科、腎內(nèi)科、消化科、骨科等亦有分布。

2.2 肺炎克雷伯菌臨床株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

受試肺炎克雷伯菌對(duì)喹諾酮類耐藥程度高（表 1）。

表1 112株肺炎克雷伯菌臨床株對(duì)常用喹諾酮類的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Susceptibility profile of 112 K. pneumoniae strains to the commonly used quinolones

2.3 MLST

受試菌株在環(huán)丙沙星各MIC層均有分布，故根據(jù)該藥MIC分層，選取代表性菌株48株進(jìn)行MLST。選擇菌株包括全部15株環(huán)丙沙星MIC≥128 mg/L菌株、13株MIC≤0.015 mg/L菌株中的9株、以及其間各MIC梯度分別1～4株。

48株肺炎克雷伯菌臨床株進(jìn)行MLST分析，結(jié)果歸為4個(gè)克隆復(fù)合體（CC）、22個(gè)ST型：最常見的為CC1型（均為ST11），CC2～CC4型各含2～3株臨床株，余菌株不屬于任何CC型。值得注意的是，僅次于ST11型（15株），18.8%受試肺炎克雷伯菌為ST494型（9株），余ST型各含1～2株受試株。

環(huán)丙沙星敏感率下降菌株中存在克隆傳播趨勢(shì)：CC1（ST 11）、CC4（ST15和ST655）和ST494菌株均對(duì)環(huán)丙沙星不敏感（MIC分別為16～＞128 mg/L、4～128 mg/L和2～8 mg/L），以上各ST型菌株共占環(huán)丙沙星不敏感菌株86.2%（25/29）。而19株敏感菌株分屬17個(gè)ST分型，未呈現(xiàn)明顯克隆集中現(xiàn)象。

2.4 ST494型肺炎克雷伯菌耐藥性及耐藥機(jī)制

2.4.1 臨床背景 ST分型共發(fā)現(xiàn)9株ST494型菌株，均分離自不同患者；標(biāo)本來(lái)源于痰（7株）、尿和傷口分泌物；3株分離自同一病區(qū)，3株分離自腦外科3個(gè)不同病區(qū)，ICU、骨科和腎內(nèi)科各分離1株。

2.4.2 耐藥表型 ST494型菌株對(duì)慶大霉素、萘啶酸、頭孢他啶、頭孢噻肟均耐藥；但對(duì)四環(huán)素、替加環(huán)素均敏感。比較ST494型、ST11型和非ST494/11型3組菌株對(duì)受試常用抗菌藥物的敏感率，結(jié)果有顯著差異：ST11型菌株對(duì)氟喹諾酮類的耐藥率顯著高于ST494型和非ST494/11型菌株；ST11型菌株對(duì)阿米卡星和β內(nèi)酰胺類的耐藥率也高于非ST494/11型菌株、而與ST494型菌株無(wú)明顯差異；ST11型菌株對(duì)替加環(huán)素和四環(huán)素的耐藥率與非ST494/11型無(wú)顯著差異、而對(duì)四環(huán)素的耐藥率高于ST494型菌株（P=0.006）；ST494型菌株對(duì)受試氨基糖苷類、喹諾酮類、β內(nèi)酰胺類藥物敏感率均低于非ST494/11菌株（表2）。

表2 ST494型、ST11型與非ST494/11型肺炎克雷伯菌臨床株對(duì)抗菌藥物敏感性Table 2 Susceptibility of K. pneumoniae strains - antimicrobial agents in terms of ST494， ST11 and non-ST494/11

表2（續(xù)）Table 2（continued）

2.4.3 耐藥基因 5株對(duì)阿米卡星、慶大霉素高度耐藥（MIC均＞256 mg/L）的菌株均攜帶armA基因，9株ST494型菌株均未檢出rmtB、rmtD基因。

9株ST494型肺炎克雷伯菌臨床株gyrA的QRDR均存在單位點(diǎn)突變，其中8株為S83Y、1株為S83I，praC的QRDR未發(fā)現(xiàn)有意義點(diǎn)突變。受檢肺炎克雷伯菌均攜帶多藥外排泵基因oqxAB，根據(jù)既往文獻(xiàn)[23]，考慮為染色體攜帶。對(duì)9株ST494型肺炎克雷伯菌進(jìn)行質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因篩查，其中3株同時(shí)攜帶qnrD和aac(6')-lb-cr基因，1株攜帶aac(6')-lb-cr基因，未檢出qnrA、qnrS、qnrB、qnrC或qepA基因。

9株均同時(shí)攜帶blaCTX-M1組、blaSHV和blaTEM基因，其中2株同時(shí)產(chǎn)blaKPC酶，這2株菌對(duì)哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南耐藥。

3 討論

肺炎克雷伯菌臨床株對(duì)常用抗菌藥耐藥物日益嚴(yán)重，使臨床抗感染治療面臨極大挑戰(zhàn)。我院分離肺炎克雷伯菌臨床株對(duì)環(huán)丙沙星敏感率為28.6%，遠(yuǎn)低于同期CHINET數(shù)據(jù)[33]。經(jīng)MLST分析提示，我院分離環(huán)丙沙星不敏感肺炎克雷伯菌臨床株中存在克隆傳播趨勢(shì)：CC1（ST11）、CC4（ST15和ST655）以及ST494菌株共占環(huán)丙沙星不敏感菌株的86.2%。既往報(bào)道ST494型菌株僅在產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌臨床株被發(fā)現(xiàn)，占受試菌株0.5%（2/378）～5.7%（2/35）[34-35]。而本研究發(fā)現(xiàn)ST494型菌株占受試臨床株18.9%，居于第2位。ST494型成為臨床分離肺炎克雷伯菌主要克隆之一，這一現(xiàn)象為我院特有。這或可解釋我院肺炎克雷伯菌菌株對(duì)氟喹諾酮類敏感率甚低這一現(xiàn)象。當(dāng)然，本研究菌株僅為短期內(nèi)集中收集，可能存在選擇偏倚，有待更大規(guī)模研究佐證。

為了解ST494型菌株對(duì)我院肺炎克雷伯菌臨床株耐藥性影響，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)除對(duì)替加環(huán)素和四環(huán)素100%敏感、美羅培南敏感率78%外，其對(duì)常用抗菌藥物敏感率均低于50%。ST494型菌株均攜帶blaCTX-M1組、blaSHV和blaTEM等多種β內(nèi)酰胺酶基因，因而對(duì)所有頭孢菌素均耐藥；其中22.2%菌株同時(shí)產(chǎn)KPC酶，導(dǎo)致對(duì)碳青霉烯類耐藥；ST494型菌株均存在gyrA的QRDR單位點(diǎn)突變，均攜帶oqxAB基因，部分?jǐn)y帶qnrD和aac-(6')-lb-cr，導(dǎo)致對(duì)喹諾酮類敏感率下降；對(duì)氨基糖苷類耐藥率高達(dá)56%～100%，產(chǎn)16S rRNA甲基化酶armA是其主因。有意思的是，ST494型肺炎克雷伯菌不僅對(duì)替加環(huán)素均敏感，而且對(duì)四環(huán)素也有很高敏感率，MIC僅2～4 mg/L。

qnrD基因首先在我國(guó)臨床分離沙門菌中被發(fā)現(xiàn)[26]，接合轉(zhuǎn)入該基因能使受體菌環(huán)丙沙星MIC提高32倍（從0.002到0.06 mg/L）。qnrD基因多見于沙門菌屬、變形桿菌屬和大腸埃希菌中，檢出率低于qnrA、qnrB或qnrS。檢索PubMed和EMBASE數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)僅報(bào)道臨床分離肺炎克雷伯菌攜帶qnrD基因2株：其一來(lái)自我國(guó)某醫(yī)院分離人類尿標(biāo)本菌株，同時(shí)攜帶aac(6')-lb-cr基因[36]；另一來(lái)自匈牙利某大學(xué)醫(yī)院血培養(yǎng)標(biāo)本，同時(shí)產(chǎn)ESBL[37]。而本研究在ST494型肺炎克雷伯菌中檢出攜帶qnrD肺炎克雷伯菌臨床株3株，陽(yáng)性率高達(dá)33.3%，或?yàn)樵揝T型肺炎克雷伯菌基因特征之一。

ST494型肺炎克雷伯菌臨床株在我院為常見克隆之一，其對(duì)喹諾酮類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、碳青霉烯類等多種常用抗菌藥物均有較高耐藥率，或?yàn)槲以悍窝卓死撞R床株對(duì)喹諾酮類高度耐藥的原因之一；但ST494型菌株對(duì)四環(huán)素、替加環(huán)素均敏感，在替加環(huán)素價(jià)格昂貴且無(wú)口服制劑的現(xiàn)狀下，價(jià)格低廉、生物利用度高、可靜脈/口服序貫使用的四環(huán)素類藥物，如多西環(huán)素、米諾環(huán)素，不失為治療肺炎克雷伯菌感染的良好選擇之一。

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