林文婷， 高 睿， 滕 亮， 王一霖， 姚國泰， 陳江漢

隱球菌性腦膜炎是嚴(yán)重的深部真菌感染疾病，致死率高，治療困難，復(fù)發(fā)率高，近年來發(fā)病率逐漸上升[1]，其致病機(jī)制、免疫反應(yīng)及治療手段都是目前研究的熱點(diǎn)。建立隱球菌腦膜炎動(dòng)物模型是隱球菌基礎(chǔ)研究的重要手段之一，目前隱球菌腦膜炎動(dòng)物模型主要有小鼠、大鼠、豚鼠、蠶、斑馬魚及家兔等[2-3]。小鼠對隱球菌天然易感，是目前較為成熟的動(dòng)物模型，可通過氣管吸入、靜脈注射或腹腔注射菌液等接種途徑獲得，但小鼠體型小，血、腦脊液含量少，無法進(jìn)行一些精細(xì)操作。建立家兔隱球菌性腦膜炎模型需使用免疫抑制劑，大鼠是否需要使用免疫抑制劑說法不一。與小鼠相比，大鼠對隱球菌抵抗力更強(qiáng)，目前有氣管接種、靜脈注射、腹腔注射及腦池注射等途徑，氣管接種不能導(dǎo)致顱內(nèi)感染，靜脈注射和腹腔注射不能保證顱內(nèi)感染的一致性，無法控制實(shí)驗(yàn)變量的統(tǒng)一[4]。目前尚無成熟的大鼠隱球菌腦膜炎模型及相關(guān)生存率的研究。在此，我們介紹一個(gè)避免使用免疫抑制劑，可行性強(qiáng)、感染率高的大鼠新型隱球菌性腦膜炎模型。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley雄性大鼠購于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，新型隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株H99來源于上海長征醫(yī)院皮膚真菌保藏實(shí)驗(yàn)室，酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YEPD）購于武漢谷歌生物，搖床、血球計(jì)數(shù)板、0.9% NaCl溶液、微量進(jìn)樣器（高鴿 /100 μL）、大鼠腦立體定位儀（美國Stoelting公司）、手術(shù)器械、75%乙醇、縫合線、1%戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的配制 新型隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株H99接種于YEPD液體培養(yǎng)基中（酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL），置于搖床中以30 ℃、225 r/min的條件培養(yǎng)16～18 h，0.9% NaCl溶液洗滌2次（3 000 r/min離心5 min），用血球計(jì)數(shù)板將菌懸液濃度分別調(diào)至2×106cfu/mL、2×107cfu/mL、2×108cfu/mL。

1.2.2 腦池注射 24只體重250～300 g的雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組（A組、B組、C組、D組），1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，剃去大鼠兩耳間頸背部的毛發(fā)，用耳桿將其頭部固定在腦立體定位儀上，以兩耳背側(cè)下緣連線中點(diǎn)為中心，沿中線向切開約1.5 cm，分離皮下組織和肌肉，直至暴露出連接顱骨下緣和第一頸椎上緣的韌帶，用微量進(jìn)樣器穿破此膜，進(jìn)針約2 mm（約沒過針頭的斜面），保持微量進(jìn)樣器位置不動(dòng)，緩慢抽出50 μL清亮腦脊液，再由相同位置注入50 μL配制好的菌懸液，待注入完畢后針頭停留在原處約3～5 min再拔出，依次縫合肌肉及皮，全程無菌操作。

A組接種的菌負(fù)荷量為1×105cfu，B組為1×106cfu，C組為1×107cfu，D組為0.9% NaCl溶液對照組，觀察接種后大鼠臨床表現(xiàn)，在第14、21天取腦脊液做培養(yǎng)計(jì)數(shù)[5]，記錄28 d內(nèi)大鼠死亡情 況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

A組大鼠毛發(fā)生長正常，姿勢體位正常，體重增加，反應(yīng)靈敏；B組大鼠毛發(fā)正常，姿勢正常，體重?zé)o明顯減輕，反應(yīng)力稍有下降；C組大鼠毛發(fā)干枯，失去光澤，體重進(jìn)行性下降，呈明顯弓背向上姿勢，反應(yīng)遲鈍；D組大鼠正常生長，毛發(fā)正常，姿勢無異常，體重正常生長，反應(yīng)靈敏。

2.2 腦脊液培養(yǎng)

第14天和第21天腦脊液培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示。A組菌負(fù)荷減少，從（27 000±4 858）cfu/mL降至（13 667±2 944）cfu/mL；B組菌負(fù)荷增加，從（33 000±7 682）cfu/mL升至（45 000±12 712）cfu/mL；C組菌負(fù)荷增加，從（49 500±23 856）cfu/mL上升至（72 600±15 060）cfu/mL；D組無菌落生長。

圖1 第14天和第21天大鼠腦脊液培養(yǎng)結(jié)果Figure 1 The results on day 14 and day 21 culture for Cryptococcus neoformans with the cerebrospinal fluid of rats

2.3 生存曲線

大鼠生存率如圖2所示，A組無大鼠死亡，生存率100%；B組在接種后第21天有1只大鼠死亡，28 d生存率83.33%；C組接種后第16天開始出現(xiàn)大鼠死亡，28 d生存率16.67%，中位生存時(shí)間23.5 d。統(tǒng)計(jì)學(xué)上，A組和B組生存曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），A組與C組、B組與C組生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。D組為對照組，所有大鼠全部存活。

圖2 大鼠28 d生存曲線Figure 2 The 28-day survival curve of rats after challenging with Cryptococcus neoformans by intracisternal injection

3 討論

隨著隱球菌的研究不斷深入，其動(dòng)物模型也在不斷發(fā)展，根據(jù)不同的研究目的，選擇不同的動(dòng)物模型。隱球菌大鼠模型中，氣管接種主要用于建立隱球菌肺炎模型[6]；靜脈注射和腹腔注射可以感染腦或肺，但感染的程度可能不同，無法控制實(shí)驗(yàn)變量的統(tǒng)一。鞘內(nèi)注射可直接造成大鼠顱內(nèi)感染，不需要使用免疫抑制劑，可以保證顱內(nèi)感染的一致性。

大鼠枕大池腦脊液豐富，從頸背部沿中線切開，分離組織肌肉，直至暴露連接顱骨下緣和第一頸椎上緣的韌帶，在可視的情況下保證進(jìn)針的深度約1～2 mm，可避免觸碰深處神經(jīng)組織，此方法簡單可行，平均10 min可接種一只大鼠。前期研究發(fā)現(xiàn)，新型隱球菌原代菌株毒性最強(qiáng)，轉(zhuǎn)平皿后生長出來的菌落毒性減弱，因此要選取原代培養(yǎng)皿上的菌落，增菌培養(yǎng)后立即接種造模，保持菌體活性，以避免造模失敗。

1×105cfu新型隱球菌鞘內(nèi)注射后，大鼠無明顯臨床癥狀，未導(dǎo)致死亡，腦脊液菌負(fù)荷量下降，這可能與大鼠自身免疫作用有關(guān)。既往研究顯示1×104cfu腦池注射后菌負(fù)荷進(jìn)行性下降[7-8]，由此可以推測當(dāng)隱球菌菌負(fù)荷量不超過1×105cfu時(shí)，由于大鼠對新型隱球菌的免疫作用，腦脊液菌負(fù)荷逐漸下降。1×106cfu新型隱球菌鞘內(nèi)注射后，大鼠出現(xiàn)反應(yīng)略遲鈍現(xiàn)象，無其他臨床癥狀，菌負(fù)荷上升，28 d死亡率16.67%。該結(jié)果表明1×106cfu已經(jīng)超出大鼠自身抵抗力，但病程進(jìn)展相對較慢，短時(shí)間內(nèi)不能導(dǎo)致大鼠死亡，延長觀察時(shí)間可能會(huì)有更多大鼠死亡。1×107cfu新型隱球菌鞘內(nèi)注射后大鼠臨床癥狀明顯，菌負(fù)荷明顯上升，急性病程，感染率高，28 d死亡率達(dá)83.33%。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明1×107cfu大鼠的生存曲線較1×105cfu和1×106cfu有顯著差異，提示1×107cfu可作為大鼠新型隱球菌腦膜炎模型構(gòu)建的鞘內(nèi)注射菌量。

曾有報(bào)道在腦池接種新型隱球菌前使用環(huán)磷酰胺，使大鼠處于免疫抑制的狀態(tài)[9]，但是免疫抑制容易造成大鼠感染其他病原菌，導(dǎo)致造模失敗。在非免疫抑制狀態(tài)下，不同菌負(fù)荷造成大鼠感染程度不同，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的菌負(fù)荷，1×107cfu菌懸液鞘內(nèi)注射可建立較為理想的大鼠新型隱球菌腦膜炎模型。該方法簡單易行，感染率高，重復(fù)性好，為隱球菌的基礎(chǔ)研究提供良好的方法。

[1] SLOAN DJ， PARRIS V. Cryptococcal meningitis： epidemiology and therapeutic options[J]. Clin Epidemiol， 2014， 6 ：169-82.

[2] 周文江， 陶林琳. 新生隱球菌感染動(dòng)物模型應(yīng)用進(jìn)展[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)， 2010， 30（3）：220-224.

[3] TENOR JL， OEHLERS SH， YANG JL， et al. Live imaging of host-parasite interactions in a zebrafish infection model reveals cryptococcal determinants of virulence and central nervous system invasion[J]. MBio， 2015， 6（5）：e01425-15.

[4] 陳裕充. 隱球菌感染動(dòng)物模型[J]. 中國真菌學(xué)雜志，2012，7（4）：232-236.

[5] FRIES BC， LEE SC， KENNAN R， et al. Phenotypic switching ofCryptococcus neoformanscan produce variants that elicit increased intracranial pressure in a rat model of cryptococcal meningoencephalitis[J]. Infect Immu， 2005， 73（3）：1779-1787.

[6] KROCKENBERGER MB， MALIK R， NGAMSKULRUNGROJ P， et al. Pathogenesis of pulmonaryCryptococcus gattiiinfection ： a rat model[J]. Mycopathologia， 2010， 170（5）：315-330.

[7] DZENDROWSKYJ TE， DOLENKO B， SORRELL TC， et al. Diagnosis of cerebral cryptococcoma using a computerized analysis of 1H NMR spectra in an animal model[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 2005， 52（2）：101-105.

[8] KIRKPATRICK WR， NAJVAR LK， BOCANEGRA R， et al.New guinea pig model of cryptococcal meningitis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2007， 51（8）：3011-3013.

[9] 馮峰， 施裕新， 夏淦林，等. 大鼠新型隱球菌腦感染的模型建立 [J]. 海南醫(yī)學(xué)， 2010， 21（9）：8-10.