郭朦朦，丁 奕，楊澤慧，張清華，馮麗貞，宋 漳

（福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002）

麗赤殼屬（Calonectria）為廣譜寄生真菌，可致多種植物病害，引起木本植物根腐、莖腐、葉斑以及焦枯等癥狀[1-3]。桉樹焦枯病菌（Cylindrocladium leaf blight）是熱帶及亞熱帶桉樹種植區(qū)內(nèi)危害最嚴重的病害之一，也是我國林業(yè)檢疫性病害[4-8]。其主要癥狀為受害葉片頂端開始呈現(xiàn)焦枯狀、在枯葉表面形成黑色小點，病健交接處有淡黃色暈圈，并使嫩枝梢枯，病害嚴重時可造成樹冠光禿、枝干腐爛，個體生長勢衰弱，林分蓄積量下降，嚴重阻礙桉樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，引起福建省桉樹焦枯病病害發(fā)生的主要病原主要有 Ca.kyotensis、Ca.pseudocolhounii、Ca.pseudoreteaudii[7]，其中Ca.pseudoreteaudii YA51為致病性強的優(yōu)勢種。

植物的病原學(xué)研究以及抗病性鑒定等工作的重要環(huán)節(jié)之一是誘導(dǎo)促使真菌產(chǎn)生分生孢子[9]。通常促進分生孢子產(chǎn)生的方法主要有近紫外光照射、菌落劃傷、菌絲涂斷、更換培養(yǎng)基或在培養(yǎng)基中加入植物煎汁或組織、某種營養(yǎng)成分等[9-16]。課題組前期對桉樹焦枯病菌研究中發(fā)現(xiàn)，Ca.pseudoreteaudii YA51在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （potato dextrose agar medium，PDA）中產(chǎn)孢量少且菌絲旺盛，不利于后期進行孢子原生質(zhì)體的制備以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化試驗。隨著桉樹的大規(guī)模種植，桉樹焦枯病的危害日益加重[17]。如何通過人工的方式快速、高效的獲得大量孢子成為該病害研究的瓶頸。有鑒于此，本試驗以查彼德培養(yǎng)基（Czapek-Dox Medium）為基礎(chǔ)，添加不同組分旨在尋找促進Ca.pseudoreteaudii YA51高效產(chǎn)孢的培養(yǎng)基配方，為后續(xù)研究奠定堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用菌株分離自福建福州地區(qū)桉樹焦枯病病樣葉片，為實驗室期鑒定的為Ca.pseudoreteaudii YA51[7]。

1.2 培養(yǎng)基

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA ），加水定容至 1 L[18]。

表1 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基Table 1 Potato glucose agar medium

（2）查彼特培養(yǎng)基（czapek-dox medium，Czapek），加水定容至1 L[18]。

表2 查彼特培養(yǎng)基Table 2 Chapel medium

（3）Czapek-Dox Medium+桉樹葉煎汁 （Czapek+ELA），Czapek-Dox Medium中以3 g桉樹葉煮沸的煎汁取代純水。

（4）Czapek-Dox Medium+桉樹葉煎汁+維生素 B1+維生素 B6（CzapekE+VB1+VB6）

（5）Czapek-Dox Medium+ 南美蟛 蜞 菊 （Wedelia trilobata（L.）Hitchc.）煎汁（Czapek+WTLA），其中以 3 g蟛蜞菊葉片煮沸的煎汁代替純水。

（6）Czapek-Dox Medium+桉樹葉煎汁+維生素 B1（CzapekE+VB1），設(shè)置維生素 B1的濃度梯度為 0.10、0.20、0.30、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、3.00、4.00、5.00 g·L-1。

各培養(yǎng)基110 kpa,121℃滅菌20 min，備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基對Ca.pseudoreteaudii YA51生長的影響

將菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，置于黑暗條件下，28℃恒溫培養(yǎng)10 d，待菌落長至培養(yǎng)皿邊緣時，用接種針挑取邊緣新鮮菌絲，分別接種與上述（1.2培養(yǎng)基）不同平板（直徑9 cm）中央，黑暗無光，28℃培養(yǎng)7 d[9]。測量菌落直徑，觀察并比較不同培養(yǎng)基之間菌落特征以及生長速度的異同。以PDA培養(yǎng)基作為對照。每種培養(yǎng)基重復(fù)3皿。

1.3.2 培養(yǎng)基對Ca.pseudoreteaudii YA51產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)率的影響

接菌方式與培養(yǎng)條件和1.3.1相同。培養(yǎng)7 d后，先用移液槍槍頭輕輕刮掉菌絲，再以2 mL無菌水清洗全皿，并用槍頭輕輕刮洗培養(yǎng)皿表面，并反復(fù)用菌液清洗，確保分生孢子沒有粘附在培養(yǎng)基上，吸取200μL置于血球計數(shù)儀板上計算和統(tǒng)計單位菌落面積的產(chǎn)孢量。以PDA培養(yǎng)基為對照。每種培養(yǎng)基重復(fù)3皿。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS和Excel對試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對菌落形態(tài)、生長的影響

不同培養(yǎng)基對菌株直徑具有一定影響，其中CzapekE+VB1的平均直徑最小，為4.2 cm，CzapekE+VB1+VB6最大直徑為6.42 cm。PDA直徑居中（圖1）。說明復(fù)合維生素營養(yǎng)有宜菌落直徑的生長。由圖2可看出，不同培養(yǎng)基對菌落形態(tài)影響較大，PDA和CzapekE+VB1+VB6菌絲厚重，且菌落周邊偏白，中央?yún)^(qū)域呈現(xiàn)淡褐色，但產(chǎn)孢較少，說明營養(yǎng)物質(zhì)豐富，有利于菌絲生長。Czapek和Czapek+WTLA菌落呈現(xiàn)深褐色，菌絲較稀疏，其中Czapek有菌株老化的趨勢，且產(chǎn)孢不明顯，表明營養(yǎng)匱乏，僅能維持菌落基本生長，無法為后期生長提供充足養(yǎng)分。Czapek+ELA和Czapek+VB1菌落整體顏色偏白。CzapekE+VB1可明顯看出產(chǎn)孢區(qū)，菌絲稀疏。因此，以上試驗結(jié)果說明在可維持基本生長的Czapek基礎(chǔ)上，CzapekE+VB1+VB6菌絲過勝，不利于后期分生孢子液的制作，CzapekE+VB1的組合菌絲稀少，且具有促進產(chǎn)孢的作用。

圖1 不同培養(yǎng)基對Ca.pseudoreteaudii YA51直徑的影響Figure 1 Effects of different culture media on mycelial growth of Ca.pseudoreteaudii YA51

圖2 不同培養(yǎng)基對Ca.pseudoreteaudii YA51形態(tài)和直徑的影響Figure 2 Effects of different culture media on mycelial growth and shape of Ca.pseudoreteaudii YA51

2.2 不同培養(yǎng)基對產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)率的影響

Czapek+ELA 、CzapekE+VB1、CzapekE+VB1+VB6、Czapek+WTLA均對菌株產(chǎn)孢有促進作用，產(chǎn)孢量依次為 1.33×106、1.17×106、7.00×105、1.43×106個/mL，分別為對照組的2倍、2倍、1倍、3倍。但不同培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)率影響不大，萌發(fā)率均在95%以上，表明不同組分不會造成菌落突變或死亡。

圖3 不同培養(yǎng)基對Ca.pseudoreteaudii YA51產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響Figure 3 Effects of different culture media on sporulation and conidia germination of Ca.pseudoreteaudii YA51

2.3 不同濃度維生素B1對菌落形態(tài)、生長速度的影響

對VB1促進產(chǎn)孢最佳濃度篩選試驗表明。不同濃度VB1對菌落直接影響不大（圖4），但菌落形態(tài)有明顯差異（圖5）。添加桉樹葉煎汁和VB1的菌落菌絲稀疏，肉眼可以明顯觀察到產(chǎn)孢區(qū)。然而，隨著濃度的增加，菌落中間黃色區(qū)域明顯變多，可見產(chǎn)孢區(qū)減少，有衰老趨勢，因此，高濃度VB1對于Ca.pseudoreteaudii YA51具毒害作用。

圖4 不同維生素B1濃度對Ca.pseudoreteaudii YA51直徑的影響Figure 4 Effects of different vitamin B1’s concentration on mycelial growth of Ca.pseudoreteaudii YA51

圖5 不同維生素B1濃度對Ca.pseudoreteaudii YA51形態(tài)和直徑的影響Figure 5 Effects of different vitamin B1’s concentration on mycelial growth and shape of Ca.pseudoreteaudii YA51

2.4 不同濃度維生素B1對產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)率的影響

隨著VB1濃度的增加，產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率的趨勢為先增加后減少（圖6），在VB1濃度為0.4 g·L-1時達到巔峰，產(chǎn)孢量為3.23×106個/mL，是對照組的6倍，自0.4 g·L-1高峰后，產(chǎn)孢量極速下降，孢子萌發(fā)率也隨著濃度的增高而降低，因此，高濃度VB1對Ca.pseudoreteaudii YA51有抑制作用，最適產(chǎn)孢VB1濃度為 0.4 g·L-1。

圖6 不同維生素B1濃度對Ca.pseudoreteaudii YA51產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率的影響Figure 6 Effects of different vitamin B1’s concentration sporulation and conidia germination of Ca.pseudoreteaudii YA51

3 小結(jié)與討論

Ca.pseudoreteaudii YA51在PDA培養(yǎng)過程中，一般需要10 d才會大量產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量低，無法滿足1.00×106個/mL的需求[19-20]。本試驗中，在Czapek的基礎(chǔ)上添加桉樹葉煎汁和VB1可在培養(yǎng)7 d時達到1.00×106個/mL，既節(jié)約了時間，又滿足試驗需求量。

草莓炭疽病菌 （Colletotrichum theobromicola）、葡萄潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）等采用涂斷菌絲或者刮傷菌落的方法進而促進產(chǎn)孢[9,21-23]，但此類方法不適宜Ca.pseudoreteaudii YA51，本菌株在PDA培養(yǎng)基過程中易被青霉菌（Penicillium）污染，刮傷菌落后再培養(yǎng)，極大的增加了污染率。雖然在PDA基礎(chǔ)上添加葉片煎汁等也可達到提高產(chǎn)孢量的作用[24]。但Ca.pseudoreteaudii YA51因營養(yǎng)物質(zhì)的變化可引起可觀的形態(tài)改變，我們在培養(yǎng)Ca.pseudoreteaudii YA51中發(fā)現(xiàn)，不同批次的PDA中菌落形態(tài)也有差異，這是由于不同批次土豆的營養(yǎng)物質(zhì)含量不同。

為了避免非可控因素，本試驗采用主要營養(yǎng)物質(zhì)成分來源明確的Czapek培養(yǎng)基，通過自主改變其中某種元素進而達到改變菌落形態(tài)的目的。添加桉樹葉煎汁的目的在于模擬和提供自然環(huán)境下菌株的生長環(huán)境。本試驗結(jié)果表明，Czapek+ELA產(chǎn)孢量為1.33×106個/mL，確有提高產(chǎn)孢量的作用，在其基礎(chǔ)上再添加VB1可進一步提高產(chǎn)孢量，最高可達3.23×106個/mL。何書婷等2017年發(fā)現(xiàn)入侵植物對某些真菌具有抑制作用[25]，其中相關(guān)研究表明蟛蜞菊不僅可抑制植物生長，也對致病真菌菌的生長和活力具一定影響[26-28]。因福建本省南美蟛蜞菊居多，參照桉樹葉煎汁的方式嘗試南美蟛蜞菊煎汁，發(fā)現(xiàn)可以促進Ca.pseudoreteaudii YA51產(chǎn)孢，此方法原材料豐富，成本廉價，操作簡單。

[1]PAULC.Taxonomy and pathology of Cylindrocladium(Calonectria)and allied genera[J].Mycologist,2003,17(3)：127-127.

[2]LOMBARD L,CROUS P W,WINGFIELD B D,et al.Species concepts in Calonectria(Cylindrocladium)[J].Studies in Mycology,2010,66(1)：1-13.

[3]陳帥飛,劉倩麗,李潔瓊,等.中國麗赤殼屬Calonectria真菌物種及遺傳多樣性[J].桉樹科技,2015,32(2)：34-56.

[4]陳全助,陳慧潔,郭文碩,等.桉樹焦枯病菌(Calonectria pseudoreteaudii)生物學(xué)特性測定[J].福建林學(xué)院學(xué)報,2014,34(4)：328-332.

[5]RODASCA,LOMBARD L,GRYZENHOUT M,et al.Cylindrocladium blight of Eucalyptus grandis in Colombia[J].Australasian Plant Pathology,2005,34(2)：143-149.

[6]CHEN S F,LOMBARD L,ROUX J,et al.Novel species of Calonectria associated with Eucalyptus leaf blight in Southeast China[J].Persoonia.2011,26(1)：1-12.

[7]陳全助,郭文碩,葉小真,等.福建省桉樹焦枯病菌分類鑒定[J].福建林學(xué)院學(xué)報,2013,33(2)：176-182.

[8]朱建華,郭文碩,陳紅梅,等.桉樹焦枯病對桉樹生長量的損失估計研究[J].中國森林病蟲,2011,30(5)：6-10.

[9]黃軍凱,張國珍.促進草莓炭疽病菌大量產(chǎn)孢的方法[J].植物保護,2014,40(4)：107-111.

[10]王拱辰,陳輝珍.促進鐮刀菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基[J].植物病理學(xué)報,1995(2)：165-166.

[11]宋漳,江英成,饒如春.氨基酸維生素對綠僵菌液生分生孢子形成影響[J].福建林學(xué)院學(xué)報,2000(3)：251-254.

[12]張淑紅,段曉靜,王建偉.氨基酸和維生素對白僵菌生長的影響[J].唐山師范學(xué)院學(xué)報,2008(2)：51-52.

[13]阮元,馬進川,薛元,等.維生素B1、B6和生長激素 2,4-D對蛹蟲草液體發(fā)酵蟲草素產(chǎn)量的影響[J].菌物學(xué)報,2014,33(2)：477-482.

[14]宋漳,周曉妹.維生素對白僵菌生長和液生分生孢子形成的影響[J].福建林學(xué)院學(xué)報,2010,30(3)：198-201.

[15]馬璐,林衍銓,江曉凌,等.無機鹽、維生素與植物生長調(diào)節(jié)劑對繡球菌菌絲生長的影響[J].菌物研究,2011,9(3)：172-175.

[16]任桂梅,周茂林,毋楠,等.維生素B1對幾種擔(dān)子菌菌絲體生長的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(26)：8075-8076.

[17]李國清,陳帥飛,吳志華,等.中國桉樹焦枯病病原菌物種多樣性及致病力初步分析 [J].熱帶作物學(xué)報,2014,35(6)：1183-1191.

[18]方中達.植病研究方法（第二卷）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[19]韓小路,白靜科,張瑋,等.PEG介導(dǎo)的蘋果果生刺盤孢Colletotrichum fructicola原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2016,25(3)：442-449.

[20]金麗.農(nóng)桿菌介導(dǎo)柑橘指狀青霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及其致病機理的初步研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[21]姚晟偉,謝悅,李興紅.葡萄潰瘍病病菌(Botryosphaeria dothidea)的誘導(dǎo)產(chǎn)孢方法評價[J].中外葡萄與葡萄酒,2011(9)：4-7.

[22]王靜,任安芝,謝鳳行,等.幾種誘導(dǎo)黑麥草 Loliump erenneL.內(nèi)生真菌產(chǎn)孢的方法[J].菌物學(xué)報,2005(4)：120-126.

[23]趙紅,王彩霞,陳曉忍,等.蘋果腐爛病菌誘導(dǎo)產(chǎn)孢方法[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2012,28(10)：151-154.

[24]陸寧海,徐瑞富,吳利民,等.長蠕孢菌產(chǎn)孢條件的研究[J].微生物學(xué)通報,2005(5)：77-81.

[25]何書婷,賀銳林,王立,等.5種入侵植物提取物對2種芒果病原真菌的抑制作用[J].熱帶生物學(xué)報,2017,8(1)：22-28.

[26]李守婷,周艷,麻兵繼,等.蟛蜞菊烯酸鈉鹽抑制植物病原真菌菌絲生長活性研究 [J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,49(5)：653-657.

[27]柯展鴻,陳雁飛,惠苗,等.南美蟛蜞菊和蟛蜞菊化感作用的比較研究[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,46(1)：83-88.

[28]吳易.南美蟛蜞菊根系分泌物抑制土傳致病真菌從而有益于其入侵[A].中國植物學(xué)會.生態(tài)文明建設(shè)中的植物學(xué)：現(xiàn)在與未來——中國植物學(xué)會第十五屆會員代表大會暨八十周年學(xué)術(shù)年會論文集——第2分會場植物生態(tài)與環(huán)境保護[C].北京：中國植物學(xué)會,2013：1.