王瑩，曲蕙名，趙博，紀(jì)曉彤，劉可春，楚杰，*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省科學(xué)院生物研究所，山東濟(jì)南250103；2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)院，山東濟(jì)南250014）

體內(nèi)自由基在信號(hào)傳導(dǎo)等方面具有一定功能，但過多的自由基易導(dǎo)致人體細(xì)胞損傷，從而引發(fā)癌癥、腫瘤等疾病[1-3]。β-胡蘿卜素廣泛存在于蔬菜、水果中[4]，可以清除人體內(nèi)的自由基，是一類重要的天然抗氧化劑，能夠有效提高機(jī)體的免疫功能[5-8]。三孢布拉霉發(fā)酵法是目前國際上大規(guī)模生產(chǎn)天然β-胡蘿卜素的最佳方法，改進(jìn)發(fā)酵和提取工藝能夠有效提高β-胡蘿卜素含量[9-12]。目前，對(duì)來源于微生物發(fā)酵β-胡蘿卜素的主要研究集中在提高產(chǎn)量方面，缺乏對(duì)其抗氧化動(dòng)力學(xué)的系統(tǒng)研究，而動(dòng)力學(xué)研究是對(duì)β-胡蘿卜素抗氧化活性機(jī)理研究的前提基礎(chǔ)[13]。因此，對(duì)三孢布拉霉產(chǎn)β-胡蘿卜素抗氧化活性動(dòng)力學(xué)研究具有重要意義。

本文采用DPPH法測(cè)定從三孢布拉霉菌株中提取的β-胡蘿卜素清除自由基的活性，進(jìn)而通過計(jì)算獲得相應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，確定不同質(zhì)量濃度的β-胡蘿卜素在不同的反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間條件下清除DPPH自由基能力的變化，為下一步對(duì)β-胡蘿卜素抗氧化活性的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三孢布拉霉（Blakeslea trispora）正（+）菌株、負(fù)（-）菌株：山東省科學(xué)院生物所工業(yè)微生物科室保藏。

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：梯希愛（上海）化成發(fā)展有限公司；無水乙醇、石油醚等試劑均為國產(chǎn)分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

種子培養(yǎng)基：玉米粉2.5%，黃豆粉5%，VB10.000 5%。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉1.8%，葡萄糖0.48%，黃豆粉3.00%，玉米漿粉0.075%，MgSO4·7H2O 0.10%，KH2PO40.2%，植物油5%。

1.2 儀器與設(shè)備

UNICO UV-2100紫外分光光度計(jì)：上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CS601電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LE204E/02電子天平：梅特勒托利多集團(tuán)；N-1110V-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會(huì)社；FD-1冷凍干燥機(jī)：北京德天佑科技發(fā)展有限公司；HZQ-QX溫控?fù)u床：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DNP-9082恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 三孢布拉霉菌株發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素

在無菌條件下，從斜面保存的三孢布拉霉原始正、負(fù)菌株取一定大小的菌苔，分別置于內(nèi)裝25 mL種子培養(yǎng)基的滅菌后的250 mL錐形瓶中，27℃，180 r/min，搖床培養(yǎng)，其中負(fù)菌培養(yǎng)60 h，正菌培養(yǎng)48 h。而后，將正負(fù)菌株同時(shí)轉(zhuǎn)接到內(nèi)裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，轉(zhuǎn)接正、負(fù)菌株菌種比例為1∶4，27℃，180 r/min，搖床培養(yǎng)120 h。

1.3.2 β-胡蘿卜素提取及含量測(cè)定

將β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶解于乙酸乙酯，分別配制濃度為 0、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL 樣品，使用分光光度計(jì)于450 nm處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

收集發(fā)酵菌液，離心去除上清，菌體蒸干水分，準(zhǔn)確稱量，按照參考文獻(xiàn)[14]方法進(jìn)行提取，測(cè)定450 nm吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算β-胡蘿卜素含量，備用。

1.3.3 β-胡蘿卜素抗氧化活性動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

配制質(zhì)量濃度分別為 80、100、120、140、160 μg/mL的β-胡蘿卜素溶液，并稱取DPPH 0.019 7 g，用無水乙醇溶解并定容至50 mL作儲(chǔ)備液。取DPPH儲(chǔ)備液10 mL稀釋成100 μmol/L DPPH自由基工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。將1 mL樣品與3 mL 100 μmol/L DPPH自由基工作液混勻，分別在37℃和25℃下反應(yīng)不同時(shí)間，于517 nm波長處測(cè)定吸光度。以DPPH自由基清除率（α）和半數(shù)效應(yīng)濃度EC50評(píng)估β-胡蘿卜素樣品清除自由基的能力，按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A為DPPH自由基清除率，%；Ai為加入β-胡蘿卜素時(shí)溶液的吸光度；Aj為β-胡蘿卜素溶液在測(cè)定波長處的吸光度；A0為未加β-胡蘿卜素時(shí)溶液的吸光度。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 三孢布拉霉菌株發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素

三孢布拉霉，有正菌和負(fù)菌兩種菌，負(fù)菌產(chǎn)β-胡蘿卜素能力強(qiáng)，正菌產(chǎn)β-胡蘿卜素能力弱，正菌和負(fù)菌一起融合后，產(chǎn)生三孢酸，誘導(dǎo)β-胡蘿卜素合成。負(fù)菌為主要的生產(chǎn)菌，而正菌在β-胡蘿卜素合成過程中起著一定的誘導(dǎo)作用。相對(duì)正菌，負(fù)菌更容易退化。因此，以三孢布拉霉負(fù)菌為出發(fā)菌株，進(jìn)行定向傳代選育。

將待篩選的三孢布拉霉負(fù)菌與正菌進(jìn)行混合培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵，生產(chǎn)β-胡蘿卜素。通過分步提取，獲得純度較高的β-胡蘿卜素。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定β-胡蘿卜素含量，計(jì)算所得產(chǎn)量，如表1所示。

表1 不同菌株β-胡蘿卜素產(chǎn)量對(duì)比Table 1 The yield of β-carotene from different strains

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，4號(hào)菌株菌體干重為66.23 g/L，β-胡蘿卜素生物合成量為2.44 g/L，在篩選菌種中為最優(yōu)，因此挑選三孢布拉霉負(fù)菌4號(hào)菌株為最終目標(biāo)菌株，與正菌混合培養(yǎng)發(fā)酵。同時(shí)，優(yōu)化發(fā)酵條件，通過加入不同劑量的植物油使菌株菌絲分散，加速菌株生長繁殖。確定最終種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基配方，獲得菌株后，通過提取，獲得β-胡蘿卜素，取部分樣品進(jìn)行含量測(cè)定，其余備用。

2.2 反應(yīng)溫度及β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度對(duì)β-胡蘿卜素抗氧化活性的影響

圖1 溫度對(duì)β-胡蘿卜素清除DPPH自由基的影響Fig.1 Effect of temperature on the kinetics of scavenging DPPH radical by β-carotene

使用提取的β-胡蘿卜素進(jìn)行試驗(yàn)，以對(duì)DPPH自由基清除率為抗氧化活性指標(biāo)。結(jié)果如圖1所示，A～E分別表示 β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度為 80、100、120、140、160 μg/mL時(shí)，反應(yīng)溫度分別在37℃和25℃條件下，β-胡蘿卜素清除DPPH自由基清除率曲線。

圖2中A、B分別表示反應(yīng)溫度分別為37℃和25 ℃時(shí)，不同質(zhì)量濃度（80、100、120、140、160 μg/mL）的β-胡蘿卜素清除DPPH自由基的清除率曲線。

圖2 β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度對(duì)清除DPPH自由基的影響Fig.2 Effect of concentration on the kinetics of scavenging DPPH radical by β-carotene

由圖1、圖2可見，溫度和初始質(zhì)量濃度都對(duì)β-胡蘿卜素清除DPPH自由基有影響。同一質(zhì)量濃度的β-胡蘿卜素在不同溫度下，反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間不同。37℃時(shí)，反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間約為30 min，而25℃時(shí)，（45±2）min時(shí)反應(yīng)結(jié)束；溫度對(duì)β-胡蘿卜素清除DPPH自由基的速率（k）影響顯著（P<0.05），而對(duì)清除率（α）無顯著影響。同一反應(yīng)溫度下，隨著β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度的不斷提高，其清除DPPH自由基的能力逐漸加強(qiáng)，表明在一定范圍內(nèi)β-胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力與其濃度呈明顯的量效關(guān)系。因此要探討初始質(zhì)量濃度和反應(yīng)溫度對(duì)β-胡蘿卜素清除DPPH自由基活性的變化規(guī)律。

2.3 β-胡蘿卜素清除DPPH自由基活性半數(shù)效應(yīng)濃度的測(cè)定

不同反應(yīng)溫度下β-胡蘿卜素對(duì)DPPH自由基的清除曲線見圖3。

圖3 不同反應(yīng)溫度下β-胡蘿卜素對(duì)DPPH自由基的清除曲線Fig.3 Scavenging curves of DPPH radical by β-carotene under different reaction temperatures

如圖3所示，不同反應(yīng)溫度下，80μg/mL～160μg/mL范圍內(nèi)隨著β-胡蘿卜素濃度的升高，清除率均增大。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到30 min時(shí)，37℃下反應(yīng)達(dá)到平衡，最大清除率達(dá)到70.77%；25℃下反應(yīng)尚未結(jié)束，最大清除率為55.80%。表2為不同反應(yīng)溫度條件下反應(yīng)進(jìn)行到30 min時(shí)，β-胡蘿卜素清除DPPH自由基動(dòng)力學(xué)的回歸方程及EC50，由表2可以得出反應(yīng)溫度對(duì)EC50影響顯著（P<0.05），且EC50（37℃）

表2 β-胡蘿卜素清除DPPH自由基動(dòng)力學(xué)的回歸方程及EC50Table 2 Regression equation and EC50of scavenging kinetics of DPPH radical by β-carotene

2.4 β-胡蘿卜素抗氧化動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

假設(shè)β-胡蘿卜素在不同溫度下清除DPPH自由基的速率符合一級(jí)或二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，將所測(cè)定的消除數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[15]。以160 μg/mL組為例，分別以ln（1-α）-t和1/（1-α）-t作圖，結(jié)果如圖4所示。

圖4 一級(jí)、二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程擬合結(jié)果Fig.4Kinetic curves of ln（1-α）-t and 1/（1-α）-t

由圖4可知，在反應(yīng)溫度37℃和25℃條件下，ln（1-α）-t擬合曲線的 R2分別為 0.995 6 和 0.990 7；1/（1-α）-t擬合曲線的R2分別為0.977 8和0.977 0。ln（1-α）-t擬合曲線的R2高于1/（1-α）-t擬合曲線的R2，即一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合的線性相關(guān)性較好。同時(shí)，其余4組濃度均可得出相同結(jié)論。由此可見，β-胡蘿卜素清除DPPH自由基的反應(yīng)動(dòng)力模型符合一級(jí)反應(yīng)，可由公式 ln（1-α）=-kt求得反應(yīng)速率常數(shù)k，式中：α表示DPPH自由基清除率，t為反應(yīng)時(shí)間，min；k為擬一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)，mg/（mL·min）。

根據(jù)阿侖尼烏斯公式 k=K0·exp（－Ea/RT），式中：k為反應(yīng)速率常數(shù)；K0為方程常數(shù)；Ea為表觀活化能，kJ/mol；R為氣體常數(shù)，8.314 dm3·kPa/（K·mol）；T為絕對(duì)溫度，K[16]，對(duì)方程兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)，得到公式lnk=－Ea/RT+lnK0。以lnk對(duì)1/T繪制曲線，通過曲線的斜率和截距即可得到Ea的值，見表3。

表3 β-胡蘿卜素抗氧化動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Parameters for antioxidant kinetics of β-carotene

隨反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)速率常數(shù)k增大，說明溫度升高，反應(yīng)速度加快，升溫有利于反應(yīng)的進(jìn)行；不同質(zhì)量濃度的Ea差異不顯著，說明Ea不受初始質(zhì)量濃度C0的影響。

3 結(jié)論

本研究通過培養(yǎng)發(fā)酵三孢布拉霉菌株生產(chǎn)β-胡蘿卜素，并對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行提取，以其為研究對(duì)象，采用DPPH法測(cè)定β-胡蘿卜素自由基清除率，考察了不同溫度條件下，不同濃度的β-胡蘿卜素抗氧化活性的不同，為充分開發(fā)利用這一天然資源提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明，相同濃度下，β-胡蘿卜素在37℃抗氧化活性達(dá)到平衡的時(shí)間為30 min，短于25℃時(shí)45 min的平衡時(shí)間，說明溫度越高，反應(yīng)速度越快；在相同溫度下，β-胡蘿卜素濃度越高，抗氧化活性越強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到160 μg/mL時(shí)，能夠達(dá)到70.77%的清除效率。同時(shí)，通過計(jì)算可得，隨反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)速率常數(shù)K增大，說明反應(yīng)溫度對(duì)β-胡蘿卜素抗氧化活性有較大影響，溫度升高，反應(yīng)速度加快，升溫有利于反應(yīng)的進(jìn)行，但不同質(zhì)量濃度的Ea穩(wěn)定在31 kJ/mol左右，沒有顯著性差異，說明β-胡蘿卜素起始濃度對(duì)抗氧化活性沒有顯著影響。β-胡蘿卜素具有優(yōu)良的清除自由基的能力，在保健食品和醫(yī)藥工業(yè)等方面應(yīng)用前景廣闊，此研究為β-胡蘿卜素功能產(chǎn)品的研究和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，可以進(jìn)一步深入系統(tǒng)的進(jìn)行探討。

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