鄭家敏,梁燕輝,朱 凡,葉秀云,林 娟

(福州大學,福建省海洋酶工程重點實驗室,福建福州 350116)

幾丁質(zhì)(chitin)又稱甲殼素或殼多糖,是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖和少量D-氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的線性多糖[1]。幾丁質(zhì)在自然界中儲量巨大,是僅次于纖維素的可再生資源,主要來源于海洋中的蝦蟹殼[2]。

幾丁質(zhì)酶(chitinase,EC3.2.1.14)是一類能特異性催化幾丁質(zhì)水解生成幾丁寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖的酶。1905年,Benecke首次發(fā)現(xiàn)貝內(nèi)克氏菌(Beneckeachitinovora)具有降解幾丁質(zhì)的能力[3],之后科學家相繼發(fā)現(xiàn)細菌、真菌、放線菌也能通過合成幾丁質(zhì)酶來降解幾丁質(zhì)作為自身能量來源,一些動植物和病毒在生長特殊時期也能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶[4-6]。幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)生成的高附加值產(chǎn)物及其衍生物,具有抗菌益菌、降低血糖血脂、抗癌、調(diào)節(jié)人體pH、增強免疫力等生物活性,在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品等行業(yè)具有廣闊的應用前景[7-9]。

微生物幾丁質(zhì)酶的研究已經(jīng)取得了一定的進展,但菌株產(chǎn)酶量低且不穩(wěn)定限制了幾丁質(zhì)酶的生產(chǎn)應用。目前,國內(nèi)外學者用來提高幾丁質(zhì)酶活力的方法大多可分為傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)、

基因工程技術(shù)和基因重排技術(shù)。傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)包括物理和化學誘變。研究發(fā)現(xiàn),使用紫外線、X射線、微波輻射、激光、離子束等物理方法均可取得良好的誘變效果,具有設備簡單、操作方便、安全快速等優(yōu)點,但是長期重復使用會導致誘變率降低和抗飽和性[10]。化學誘變的優(yōu)點是突變頻率較高,但誘變劑量過高會有一定毒性,因此會采用物理-化學聯(lián)合的方法來達到預期的誘變效果。田強等[11]通過UV-LiCl復合誘變獲得一株幾丁質(zhì)酶變異株TUC13,發(fā)酵條件優(yōu)化后酶活提高了236.5%,酶活力為0.11 U/mL。張敏等[12]通過紫外線、氯化鋰、硫酸二乙酯的復合誘變,獲得了1株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性菌株,優(yōu)化后酶活力提高到了1.53 U/mL,較出發(fā)菌株提高了347.7%。

本文通過紫外-LiCl和微波-LiCl兩輪復合誘變以及發(fā)酵條件優(yōu)化來提高菌株的產(chǎn)酶能力,為幾丁質(zhì)酶的開發(fā)應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)G3-1 從海洋中分離獲得;粘質(zhì)沙雷氏菌GF-21 紫外-LiCl和微波-LiCl復合誘變后的突變株;細粉幾丁質(zhì) Sigma公司;胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉(BR) 上海生物工程有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

U-2910分光光度計、CF16RXⅡ型高速冷凍離心機 日本HITACHI公司；78-1型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；SW-CJ-2F I類B型潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；WP800TL23-K3微波爐 廣東格蘭仕集團有限公司；UB-7型pH計 賽多利斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基:2%(w/v)膠體幾丁質(zhì)500 mL,K2HPO40.7 g,KH2PO40.3 g,MgSO40.5 g,FeSO4·H2O 0.02 g,NaCl 5 g,蛋白胨3 g,蒸餾水定容至1000 mL,pH7.0～7.2,121 ℃,20 min滅菌;

種子培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,蒸餾水定容至1000 mL,pH7.0～7.2;

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基[13]:2%(w/v)膠體幾丁質(zhì)500 mL,蛋白胨10 g,K2HPO40.7 g,KH2PO40.3 g,MgSO40.5 g,FeSO4·H2O 0.02 g,NaCl 5 g,蒸餾水定容至1000 mL,pH7.0～7.2。

1.2.2 出發(fā)菌株G3-1生長曲線的測定 將菌株G3-1經(jīng)活化后轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng),每隔2 h取菌液測定OD600并記錄。

1.2.3 幾丁質(zhì)酶活力的測定

1.2.3.1 N-乙酰-D-氨基葡萄糖標準曲線的繪制 準確稱取0.2 g烘干至恒重的N-乙酰-D-氨基葡萄糖,用蒸餾水定容至100 mL,再取出10 mL定容至100 mL,配制成終濃度為0.2 mg/mL的N-乙酰-D-氨基葡萄糖標準溶液,采用DNS法測定[9,14],按表1加入試劑,混勻后沸水浴5 min,冷水冷卻至室溫,在540 nm下測定吸光值,根據(jù)吸光值與質(zhì)量的關(guān)系繪制標準曲線,得到回歸方程為y=5.3327x-0.0656,R2=0.9991。

表1 N-乙?；?D-氨基葡萄糖標準曲線繪制Table 1 The standard curve of N-Acetyl-D-glucosamine

1.2.3.2 酶活力的測定 采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)法測定還原糖含量[9,14]。取0.1 mL酶液與0.9 mL的0.5%膠體幾丁質(zhì)底物,于50 ℃水浴反應30 min后,加入1.5 mL DNS終止反應并煮沸5 min顯色;同時以滅活酶液組作為空白對照。6000 r/min離心5 min,取上清液于540 nm測定吸光值,根據(jù)N-乙酰-D-氨基葡萄糖標準曲線計算還原糖含量。酶活力單位定義為:在該反應條件下,1 min催化底物產(chǎn)生1 μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量作為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 紫外-LiCl復合誘變 取對數(shù)生長期菌液離心(10000 r/min,5 min)后,沉淀用生理鹽水稀釋成濃度為108個/mL的菌懸液。將裝有5 mL菌懸液的無菌平皿置于磁力攪拌器上,在實驗前打開紫外燈預熱10 min,在距離紫外燈(15 W)30 cm處進行誘變。分別照射0、3、6、9、15、30、45 s,每個照射時間各取0.1 mL處理后的菌液涂布于篩選平板上,30 ℃避光培養(yǎng)5 d,計算致死率,確定最佳紫外照射時間[11]。

致死率(%)=(未經(jīng)誘變處理菌落數(shù)-誘變處理后菌落數(shù))/未經(jīng)誘變處理菌落數(shù)×100

式(1)

將經(jīng)過紫外誘變后的菌懸液涂布在含有0.5% LiCl的篩選平板上,置于30 ℃培養(yǎng)。

1.2.5 微波-LiCl復合誘變 以紫外-LiCl復合誘變的突變株G-12作為微波誘變的出發(fā)菌株。將裝有5 mL菌懸液的無菌試管置于微波爐中進行誘變處理,微波輻射采用高檔火(最大功率700 W,微波波段2450 MHz),分別輻射0、15、30、45、60、75、90、120、180 s,并每隔3 s用冰浴法消除熱效應。每個輻射時間分別吸取0.1 mL處理后的菌懸液涂布于篩選平板上,30 ℃培養(yǎng)5 d,根據(jù)公式(1)計算致死率,確定最佳微波輻射時間[15]。

將經(jīng)過微波誘變后的菌懸液涂布在含有0.5% LiCl的篩選平板上,置于30 ℃培養(yǎng)。

1.2.6 培養(yǎng)基成分對突變株GF-21產(chǎn)酶的影響 培養(yǎng)基初始pH7.0,溫度30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,接種齡8 h,接種量8%,在此發(fā)酵條件下,對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化。

1.2.6.1 碳源對產(chǎn)酶的影響 在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加5 g/L的環(huán)糊精、淀粉、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、糯米粉、馬鈴薯淀粉、麩皮作為碳源,以基礎發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照組,研究不同碳源對GF-21產(chǎn)酶的影響,確定最適碳源。

向基礎培養(yǎng)基中分別添加1、2、3、4、5、6、7 g/L的乳糖,確定乳糖添加量。

1.2.6.2 氮源對產(chǎn)酶的影響 在添加6 g/L乳糖的基礎上,分別以5 g/L的(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4HPO3、NH4NO4、花生餅粉、玉米粉、尿素、蛋白胨、酵母膏取代基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源,以添加6 g/L乳糖的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照組,研究不同氮源對GF-21產(chǎn)酶的影響,確定最適氮源[13]。

向基礎培養(yǎng)基中分別添加2、4、6、8、10、12、14 g/L的尿素,確定尿素添加量。

1.2.6.3 金屬離子對產(chǎn)酶的影響 在添加6 g/L乳糖和8 g/L尿素的基礎上,分別添加0.2 mmol/L和1 mmol/L的K+、Ca2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Ni+、Zn2+、Cu2+、Mg2+和10 mmol/L的K+、Ca2+,研究不同金屬離子對GF-21產(chǎn)酶的影響,確定對產(chǎn)酶促進作用最明顯的金屬離子。

向基礎培養(yǎng)基中分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mmol/L的K+,確定K+添加量。

1.2.6.4 其他培養(yǎng)基成分添加量的影響 在添加6 g/L乳糖、8 g/L尿素和0.8 mmol/L K+的基礎上,研究作為誘導劑的膠體幾丁質(zhì)添加量(0、2、4、6、8、10、12、14 g/L)以及作為滲透壓調(diào)節(jié)劑的NaCl添加量(1、2、3、4、5、6、7 g/L)對GF-21產(chǎn)酶的影響。

1.2.6.5 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化 在培養(yǎng)基成分單因素實驗基礎上,選擇乳糖、尿素、KCl、膠體幾丁質(zhì)進行4因素4水平L16(45)正交實驗[16-17]。正交實驗設計表如2所示。

表2 正交實驗設計表Table 2 Orthogonal experimental design

1.2.7 發(fā)酵條件對突變株GF-21產(chǎn)酶的影響

1.2.7.1 培養(yǎng)基初始pH對幾丁質(zhì)酶合成的影響 分別設置優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,以8%(v/v)接種量,200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液酶活,研究不同初始pH對GF-21產(chǎn)酶的影響[12]。

1.2.7.2 發(fā)酵溫度對幾丁質(zhì)酶合成的影響 培養(yǎng)基初始pH為9.0,以8%(v/v)接種量,200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液酶活,研究不同發(fā)酵溫度(23、25、27、30、33、35、37 ℃)對GF-21產(chǎn)酶的影響。

1.2.7.3 搖床轉(zhuǎn)速對幾丁質(zhì)酶合成的影響 培養(yǎng)基初始pH為9.0,以8%(v/v)接種量,30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液酶活,研究不同搖床轉(zhuǎn)速(150、180、200、220、250 r/min)對GF-21產(chǎn)酶的影響。

1.2.7.4 接種齡對幾丁質(zhì)酶合成的影響 培養(yǎng)基初始pH為9.0,以8%(v/v)接種量,30 ℃,200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液酶活,研究種子液不同菌齡(3、4、5、6、7、8、9 h)對GF-21產(chǎn)酶的影響。

1.2.7.5 接種量對幾丁質(zhì)酶合成的影響 培養(yǎng)基初始pH為9.0,30 ℃,200 r/min發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測定發(fā)酵液酶活,研究不同接種量(2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%)對GF-21產(chǎn)酶的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個樣品設3個平行,采用Origin 8.0軟件作圖和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 出發(fā)菌株G3-1生長曲線的測定

如圖1所示,菌株G3-1在4 h后進入對數(shù)生長期,10 h后進入穩(wěn)定期,選擇培養(yǎng)8 h后的菌液進行誘變。

圖1 菌株G3-1的生長曲線Fig.1 Growth curve of strain G3-1

2.2 紫外-LiCl復合誘變

如圖2所示,在3～15 s之間,隨著紫外照射時間的延長,致死率迅速增加,15 s后趨于平衡。在以紫外線作誘變劑時,一般采用致死率為80%～85%左右的劑量,因此選擇最佳紫外誘變時間為12 s。

圖2 菌株G3-1紫外誘變的致死曲線Fig.2 Lethal curve of UV mutation

經(jīng)紫外-LiCl復合誘變,獲得15株酶活明顯提高的正突變菌株(表3)。其中突變株G-12產(chǎn)酶能力提高最多,酶活力達到1.41 U/mL,比出發(fā)菌株G3-1提高了69.9%。選取4株酶活力有較大提高的突變菌株GU-4、G-12、G-16、GU-17在活化平板上連續(xù)傳代5次,測定其遺傳穩(wěn)定性。

表3 紫外-LiCl復合誘變突變菌株的幾丁質(zhì)酶活力提高率Table 3 Improvement rate of chitinase activity of strains by UV-LiCl mutagenesis

由表4可以看出,突變株G-12和G-16的遺傳穩(wěn)定性較好,由于在傳代實驗中G-12的第一代酶活略高些,因此選擇突變株G-12作為微波-LiCl復合誘變的出發(fā)菌株。

表4 紫外-LiCl復合誘變突變菌株遺傳穩(wěn)定性Table 4 The genetic stability of mutant strains

2.3 微波-LiCl復合誘變

如圖3所示,微波輻射時間在0～60 s之間,微波對G-12的影響較小,60 s時致死率僅為15.31%;但在60～75 s之間細菌迅速死亡,這可能是由于微波輻射熱效應的積累對G-12影響導致的。最后選擇致死率在75%左右的微波輻射時間75 s作為最佳誘變劑量。

圖3 G-12微波誘變的致死曲線Fig.3 Lethal curve of microwave mutation

經(jīng)微波-LiCl復合誘變,獲得9株酶活力提高較多的正突變菌株(表5)。選取酶活力提高最多的4株突變株GF-21、GF-25、GF-28、GF-32在活化平板上連續(xù)傳代5次,測其遺傳穩(wěn)定性,結(jié)果如圖4所示。4株突變株都有較好的遺傳穩(wěn)定性,結(jié)合4株突變株的酶活力,選擇酶活力提高率為87.31%的突變株GF-21作為后續(xù)研究的實驗菌株。

表5 微波-LiCl復合誘變突變菌株的幾丁質(zhì)酶活力提高率Table 5 Improvement rate of chitinase activity of strains by microwave-LiCl mutagenesis

圖4 微波-LiCl誘變突變菌株的遺傳穩(wěn)定性Fig.4 The genetic stability of mutant strains

2.4 培養(yǎng)基成分對突變株GF-21產(chǎn)酶的影響

2.4.1 碳源對GF-21產(chǎn)酶的影響 碳源為微生物細胞物質(zhì)合成提供碳骨架成分,不同碳源對幾丁質(zhì)酶的影響結(jié)果表明,以乳糖作為碳源,GF-21的酶活力最高,說明其效果最好(圖5),當乳糖添加量為6 g/L時,產(chǎn)酶能力達到最高(圖6),因此確定乳糖適宜添加量為6 g/L。

圖5 碳源種類對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.5 Effects of carbon sourceson chitinase production

圖6 乳糖添加量對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.6 Effects of lactose addition on chitinase production

2.4.2 氮源對GF-21產(chǎn)酶的影響 氮源是微生物合成核酸和蛋白質(zhì)的重要物質(zhì),不同氮源對幾丁質(zhì)酶的影響結(jié)果表明,尿素對產(chǎn)酶影響最大(圖7),當尿素添加量為2～6 g/L時,GF-21產(chǎn)酶能力隨著尿素添加量的增加而緩慢增加;當尿素添加量超過12 g/L時,產(chǎn)酶能力迅速下降(圖8)。因此確定尿素的添加量為8 g/L。

圖7 不同氮源對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.7 Effects of nitrogen sources on chitinase production

圖8 尿素添加量對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.8 Effects of urea addition on chitinase production

2.4.3 金屬離子對GF-21產(chǎn)酶的影響 金屬離子參與了細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)物質(zhì)和某些酶的活性基團的組成,并且影響細胞的跨膜運輸方式。結(jié)果表明,K+對產(chǎn)酶有較大的促進作用,而Cu2+對產(chǎn)酶幾乎100%抑制,Ni+的抑制效果次之,而Ca2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+對GF-21產(chǎn)酶幾乎沒有影響(圖9)。

圖9 不同金屬離子對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.9 Effects of different metal ions on chitinase production

選擇對產(chǎn)酶促進作用最明顯的K+進行添加量實驗,結(jié)果如圖10所示。產(chǎn)酶能力隨K+濃度增加而增加,在0.8 mmol/L時GF-21產(chǎn)酶能力最高,之后趨于平衡,故選擇K+濃度為0.8 mmol/L。

圖10 K+添加量對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.10 Effects of K+ addition on chitinase production

2.4.4 其他培養(yǎng)基成分添加量對GF-21產(chǎn)酶的影響 膠體幾丁質(zhì)作為GF-21發(fā)酵產(chǎn)酶過程中的誘導劑,同時提供碳源和氮源,膠體幾丁質(zhì)添加量對GF-21產(chǎn)酶有較大影響。如圖11所示,當膠體幾丁體添加量為10 g/L時,GF-21產(chǎn)酶能力達到最高;當膠體幾丁質(zhì)大于12 g/L,GF-21產(chǎn)酶能力下降,因為膠體幾丁質(zhì)濃度太高導致發(fā)酵液變得粘稠,不利于溶氧,抑制細菌生長。因此選擇膠體幾丁質(zhì)添加量為10 g/L。

圖11 膠體幾丁質(zhì)添加量對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.11 Effects of colloid chitin concentration addition on chitinase production

因出發(fā)菌株G3-1來源于海洋,故研究NaCl對其產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明,當NaCl濃度為5 g/L時,GF-21產(chǎn)酶能力達到最高,增加或減少NaCl濃度,GF-21產(chǎn)酶能力都下降,因此選擇NaCl添加量為5 g/L(圖12)。

圖12 NaCl添加量對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.12 Effects of NaCl addition on chitinase production

2.4.5 正交實驗 在單因素實驗的基礎上,選擇乳糖、尿素、KCl、膠體幾丁質(zhì)進行4因素4水平L16(45)正交實驗,實驗結(jié)果如表6所示。由極差分析可得各因素對產(chǎn)酶的影響大小為:

表6 L16(45)正交實驗結(jié)果Table 6 Results of L16(45)orthogonal experiment

D(膠體幾丁質(zhì))>A(乳糖)>B(尿素)>C(KCl);通過比較K值大小確定最優(yōu)水平組合為A2B4C3D4,即乳糖6 g/L,尿素10 g/L,KCl 1.0 mmol/L,膠體幾丁質(zhì)10 g/L。在該條件下進行驗證實驗,酶活力為4.73 U/mL,比優(yōu)化前提高了109.3%。由方差分析可知(表7),膠體幾丁質(zhì)對產(chǎn)酶影響極顯著(p<0.01),其次為尿素和乳糖(p<0.1),KCl影響不顯著(p>0.1)。

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance

2.5 發(fā)酵條件對突變株GF-21產(chǎn)酶的影響

2.5.1 培養(yǎng)基初始pH對GF-21產(chǎn)酶的影響 當培養(yǎng)基初始pH為4.0～9.0時,GF-21產(chǎn)酶能力逐漸增加;當pH為9.0時,產(chǎn)酶能力達到最高。因此選擇培養(yǎng)基初始pH為9.0(圖13)。

圖13 培養(yǎng)基初始pH對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.13 Effects of initial pH on chitinase production

2.5.2 溫度對GF-21產(chǎn)酶的影響 當溫度為25～33 ℃之間時,GF-21產(chǎn)酶能力較高且相對穩(wěn)定,故選擇30 ℃作為最佳發(fā)酵溫度(圖14)。

圖14 溫度對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.14 Effects of temperature on chitinase production

2.5.3 轉(zhuǎn)速對GF-21產(chǎn)酶的影響 搖瓶轉(zhuǎn)速影響供氧水平,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)速為150～220 r/min時對GF-21產(chǎn)酶能力影響不大,但高于220 r/min,產(chǎn)酶能力下降,因此選擇搖瓶轉(zhuǎn)速為220 r/min(圖15)。

圖15 不同轉(zhuǎn)速對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.15 Effects of rotation speed on chitinase production

2.5.4 接種齡和接種量對GF-21產(chǎn)酶的影響 接種齡和接種量會影響菌體的生長周期,但在該實驗中,接種齡和接種量對GF-21產(chǎn)酶無明顯影響(圖16,圖17)。處于對數(shù)生長期的菌體生長較快,為了使菌體快速生長達到一定的菌濃度,在后續(xù)實驗中,選擇接種齡為5 h,接種量為10%。

圖16 接種齡對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.16 Effects of inoculation age on chitinase production

圖17 不同接種量對幾丁質(zhì)酶合成的影響Fig.17 Effects of inoculum size on chitinase production

3 結(jié)論與討論

本文以產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細菌G3-1作為出發(fā)菌株,通過紫外-LiCl和微波-LiCl兩輪復合誘變,最終獲得一株產(chǎn)酶能力高且遺傳穩(wěn)定的突變株GF-21,并對其發(fā)酵培養(yǎng)基和產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化。研究結(jié)果表明,最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:乳糖6 g/L,尿素10 g/L,KCl 1.0 mmol/L,NaCl 5 g/L,膠體幾丁質(zhì)10 g/L。在該條件下進行驗證實驗,酶活力為4.73 U/mL,比優(yōu)化前提高了109.3%,較出發(fā)菌株提高了470%。最優(yōu)發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基初始pH9.0,溫度30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,接種齡5 h,接種量10%。

根據(jù)已報道的文獻,目前幾丁質(zhì)酶活力偏低,限制了幾丁質(zhì)的開發(fā)利用。如施騰鑫等[18]從海塘土壤中分離得到一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的粘質(zhì)沙雷氏菌菌株,酶活力為1.0 U/mL。王慧敏等[19]對海洋細菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶條件進行優(yōu)化,優(yōu)化后的酶活力為0.63 U/mL。陶勇[20]對產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細菌發(fā)酵條件進行優(yōu)化,在最優(yōu)條件下酶活力為2.68 U/mL。Singh等[21]篩選到的Paenibacillussp. D1幾丁質(zhì)酶活力為0.8 U/mL。Wang等[22]表明在最優(yōu)產(chǎn)酶條件下進行發(fā)酵,其酶活力為0.38 U/mL。本文通過兩輪復合誘變獲得一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株,產(chǎn)酶穩(wěn)定且酶活力(4.73 U/mL)高,為幾丁質(zhì)酶的生產(chǎn)應用奠定了良好的基礎。

[1]郝之奎.Chitinolyticbactermeiyuanensis的篩選鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶研究[D]. 無錫:江南大學,2011.

[2]王曉輝. 海洋細菌Dl-6幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的生化性質(zhì)與功能研究[D]. 大連:大連理工大學,2016.

[3]Benecke U.Bacilluschitinovoruseien chitin zersetzenden spaltpilz[J]. Bot Ztg,1995,63(8):227.

[4]Li A,Yu K,Liu H,et al. Two novel thermostable chitinase genes from thermophilic fungi:Cloning,expression and characterization[J]. Bioresource Technology,2010,101(14):5546-51.

[5]Singh AK,Chhatpar HS. Purification and characterization of chitinase fromPaenibacillussp. D1[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2011,164(1):77-88.

[6]Zhang H,Liu M,Tian Y,et al. Comparative characterization of chitinases from silkworm(Bbombyxmori)and bollworm(Helicoverpaarmigera)[J]. Cell Biochemistry Biophysics,2011(61):267-275.

[7]紀瑩. 殼寡糖對巨噬細胞IL-1β、TNF-α基因表達的影響[D]. 杭州:浙江大學,2002.

[8]楊銘鐸,曲志華,李元瑞,等. 幾丁質(zhì)、幾丁聚糖及其衍生物在食品中的應用[J]. 食品科學,2001,1(5):97-99.

[9]García-Fraga B,Silva AFD,López-Seijas J,et al. A novel family 19 chitinase from the marine-derived pseudoalteromonas tunicata ccug 44952t:Heterologous expression,characterization and antifungal activity[J]. Biochemistry Engineering Journal,2015(93):84-93.

[10]施巧琴. 工業(yè)微生物育種學[M]. 北京:科學出版社,2003:68-70.

[11]田強,張彩,吳子健. 幾丁質(zhì)酶生產(chǎn)菌的誘變育種及搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品科學,2007,28(9):405-409.

[12]張敏,胡曉,萬津瑜,等. 高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的枯草芽孢桿菌誘變育種及發(fā)酵條件研究[J]. 中國農(nóng)學通報,2010,26(11):279-283.

[13]Xia JL,Xiong J,Zhang RY,et al. Production of chitinase and its optimization from a novel isolate serratia marcescens,XJ-01[J]. Indian Journal of Microbiology,2011,51(3):301-306.

[14]Silva AFD,García-Fraga B,López-Seijas J,et al. Characterization and optimization of heterologous expression in escherichia coli,of the chitinase encoded by the chia,gene of bacillus halodurans,c-125[J]. Process Biochemistry,2014(49):1622-1629.

[15]張云波,劉海濤,趙雅坤. 一株高效石油降解菌的紫外微波復合誘變改良[J]. 化學與生物工程,2013,30(7):71-73.

[16]李志西,杜雙奎. 實驗優(yōu)化設計與統(tǒng)計分析[M]. 北京:科學出版社,2010:143-177.

[17]梁飛豹. 應用統(tǒng)計方法[M]. 北京:北京大學出版社,2010:274.

[18]施騰鑫,黃秀菁,劉嘉,等. 黏質(zhì)沙雷氏菌胞外幾丁質(zhì)酶的純化及特性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38(7):114-119.

[19]王慧敏,祖國仁,尹璐,等. 響應面法優(yōu)化海洋細菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)條件[J]. 中國釀造,2012,31(2):103-106.

[20]陶勇. 一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細菌的鑒定、酶的性質(zhì)及其基因的克隆與表達[D]. 成都:四川大學,2006.

[21]Singh AK,Chhatpar HS. Purification and characterization of chitinase fromPaenibacillussp. D1[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2011,164(1):77-88.

[22]Wang K,Yan PS and Cao LX. Chitinase from a novel strain ofserratiamarcescensjpp1 for biocontrol of aflatoxin:molecular characterization and production optimization using response surface methodology[J]. Biomed research international,2014(3):482623.