張俊平 王英強

摘 要：? qRT-PCR技術具有定量準確、靈敏度高、重復性好等特點，被廣泛用于基因表達分析。內參基因的穩(wěn)定性對于準確分析實驗結果非常重要。該研究以黃花大苞姜（Caulokaempferia coenobialis）花粉母細胞時期（PMC）、四分體時期（TET）、成熟花粉時期（MP）的花藥組織為材料，基于3個階段花藥轉錄組表達譜數(shù)據(jù)以及常用傳統(tǒng)內參基因，篩選出Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase （GAPDH）、Malate dehydrogenase （MDH）、α-tubulin3 （TUA3）、β-tubulin7 （TUB7）和Actin6 （ACT6）作為候選內參基因，進行qRT-PCR分析;并運用BestKeeper、geNorm和Normfinder軟件綜合分析5個候選內參基因在黃花大苞姜花藥發(fā)育過程中的表達穩(wěn)定性。結果表明：MDH和TUB7的表達最穩(wěn)定，ACT6的穩(wěn)定性最差;分別以MDH和TUB7作為內參，分析GBE1在黃花大苞姜花藥發(fā)育中的表達模式，并與該基因在花藥轉錄組中的表達模式做相關系數(shù)分析，3種表達模式結果一致，進一步驗證了MDH和TUB7的表達穩(wěn)定性。這說明MDH和TUB7適合作為qRT-PCR分析黃花大苞姜花藥發(fā)育過程中相關基因表達模式的內參基因。該研究結果為黃花大苞姜花藥發(fā)育分子機制相關研究奠定了基礎，也為姜科花藥發(fā)育相關內參基因的選擇提供了參考。

關鍵詞： 黃花大苞姜， 花藥， 內參基因， qRT-PCR， BestKeeper， geNorm， Normfinder

中圖分類號：? Q943.2

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2018）01-0076-08

Selection of reference genes for quantitative real-time PCR during anther development of Caulokaempferia coenobialis （Zingiberaceae）

ZHANG Junping1， WANG Yingqiang1， 2*

（ 1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development， College of Life Sciences， South China Normal University， Guangzhou 510631， China; 2. Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring College of Life Sciences， South China Normal University， Guangzhou 510631， China ）

Abstract：? Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） has been widely used in gene expression analysis with quantitative accuracy， high sensitivity and good repeat ability. The stability of the reference genes is very important to accurate analysis of the target genes expression. Anther tissues from pollen mother cells stage （PMC）， tetrad stage （TET） and mature pollen stage （MP） of Caulokaempferia coenobialis （Zingiberaceae） were used to select reference genes. According to the developing anther transcriptome expression profile data and traditional reference genes reported， Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase （GAPDH）， Malate dehydrogenase （MDH）， alpha tubulin3 （TUA3）， beta tubulin7 （TUB7） and Actin6 （ACT6） were selected as candidate reference genes for qRT-PCR analysis. The expression stability of five candidate reference genes during the anther development was comprehensive analysis by BestKeeper， geNorm and Normfinder software. The results showed that the expression of MDH and TUB7 were the most stable， and the ACT6 was the worst. The expression patterns of GBE1 during anther development was obtained based on MDH and TUB7 as reference gene respectively. And the expression stability of MDH and TUB7 was further verified by correlation coefficient analysis （Pearson） with the anther transcriptome expression profile data. The results showed that MDH and TUB7 could serve as qRT-PCR reference gene to analyse the gene expression pattern related to anther developing in C. coenobialis. The study would provide research fundamental data for molecular mechanism research of anther development in C. coenobialis， and reference for the selection of reference genes in other Zingiberaceae species during anther development.

Key words： Caulokaempferia coenobialis， anther， reference gene， quantitative realtime PCR（qRT-PCR）， BestKeeper， geNorm， Normfinder

黃花大苞姜（Caulokaempferia coenobialis）是中國特有的姜科大苞姜屬植物，具有獨特的花粉滑動自花授粉機制（Wang et al， 2004， 2005），花粉呈粘液狀，與擬南芥、水稻的干性花粉顯著不同。因此，其花藥發(fā)育相關的研究，對于了解和補充精密的花藥發(fā)育分子機制具有重要意義。但目前關于黃花大苞姜花藥發(fā)育的相關研究卻尚還未見有報道。? qRT-PCR技術具有定量準確、特異性強、靈敏度高及高通量等優(yōu)點，被廣泛用于基因表達分析（Nolan et al， 2006; Huggett et al， 2005）。但由于RNA提取質量、逆轉錄效率等因素無法完全統(tǒng)一，目的基因表達準確性會受到一定影響，因此不能真實反映基因的表達情況，需要內參基因來矯正和標準化，而一個好的內參可以消除這些影響（Vanguilder et al， 2008; Derveaux et al， 2010）。因此，篩選特定條件下最適內參基因對于準確分析目的基因的表達情況至關重要。

本研究基于黃花大苞姜花粉母細胞時期（Pollen mother cell stage，PMC）、四分體時期（Tetrad stage， TET）和成熟花粉時期（Mature pollen stage， MP）的花藥轉錄組數(shù)據(jù)，結合已經(jīng)報道的植物qRT-PCR內參基因（胡瑞波等，2009;牙庫甫江等，2011）。篩選出了表達相對穩(wěn)定的5個基因Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Malate dehydrogenase（MDH）、α-tubulin3（TUA3）、β-tubulin7（TUB7）和Actin6（ACT6）作為候選內參基因，進行qRT-PCR分析。并運用BestKeeper（Pfaffl et al， 2004）、Normfinder（Andersen et al， 2004）和geNorm（Vandesompele et al， 2002）軟件綜合分析5個候選內參基因在黃花大苞姜花藥發(fā)育過程中的表達穩(wěn)定性，以篩選出表達最穩(wěn)定的內參基因，為開展黃花大苞姜花藥發(fā)育相關基因的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以黃花大苞姜不同發(fā)育階段的花藥組織為材料，于5—7月采自廣東惠州南昆山自然保護區(qū)。收集花粉母細胞時期、四分體時期和成熟花粉時期的花藥組織，液氮速凍后，于-80 ℃保存，直至提取RNA。每個發(fā)育階段取3個生物學重復，共9個樣品?；ㄋ幇l(fā)育階段經(jīng)醋酸洋紅壓片，顯微觀察確定。

1.2 總RNA提取和反轉錄cDNA合成

用Omega BioTek公司的Plant RNA Kit（America）試劑盒，參照說明書方案二（用于次生代謝物多的植物組織）提取花藥組織的總RNA。RNase-free DNase 1（Takara Bio， Japan）去除RNA中的DNA。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和Nano-100超微量分光光度計用于檢測RNA的純度和完整性。cDNA的合成采用PrimeScriptTM Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaKa， Japan）試劑盒，取1.6 μg RNA，參照說明書反轉錄生成cDNA的第一條鏈，產(chǎn)物-20 ℃保存。

1.3 內參基因的選擇及特異性引物設計

結合已經(jīng)報道的常用內參基因，以及其在本實驗室3個階段發(fā)育花藥的轉錄組數(shù)據(jù)中的表達情況，以基因在3個花藥發(fā)育階段的表達量（FPKM）差異倍數(shù)均小于2為標準。最終確定表達量差異較小的GAPDH、MDH、TUA3、TUB7、ACT6基因作為候選內參基因。特異性引物的設計采用NCBI內嵌的Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設計，根據(jù)熒光定量引物設計原則，以及SYBR Premix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑對引物的要求選擇最優(yōu)引物，并將引物對轉錄組數(shù)據(jù)庫比對，確定引物的專一性。引物信息見表1。

1.4 候選內參基因的qRT-PCR反應

采用BIO-RAD公司的CFX96TM Real-Time PCR Detection System進行熒光定量PCR反應，定量試劑采用SYBR Premix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）試劑盒（Takara Bio， Japan）。反應體系：cDNA 0.25 μL; SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL; Primer F（10 μmol·L-1）0.8 μL; Primer R（10 μmol·L-1）0.8 μL;加ddH2O補至20 μL體系。每個樣品設3次技術重復。反應程序：預變性95 ℃ 30 s，40個循環(huán);95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。生成溶解曲線，用于判斷擴增特異性。

1.5 引物擴增效率計算

等量取所有樣品的cDNA，混合均勻后稀釋5個梯度，每個梯度5倍，即模板濃度分別為初始濃度的1、1/5、1/52、1/53、1/54倍。每個反應設3個重復。用Bio Rad CFX Manager軟件分析進行數(shù)據(jù)分析。以模板濃度的對數(shù)值為橫坐標，以 Ct值為縱坐標繪制標準曲線，得到斜率K和相關系數(shù)R2。通過公式E=（5-1/k_1）×100%，計算引物擴增效率（E）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用BestKeeper、geNorm和Normfinder 3個軟件對5個候選內參基因在黃花大苞姜花藥發(fā)育過程中的表達穩(wěn)定性進行分析。BestKeeper軟件可直接采用基因表達Ct值進行分析，而geNorm和Normfinder軟件需將Ct值經(jīng)ΔCt方法轉換后才能用于數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 RNA質量檢測

3個發(fā)育階段的黃花大苞姜花藥組織提取總RNA后，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性和純度，結果顯示RNA電泳條帶清晰，無可見污染（圖1）。Nano-100檢測RNA的濃度和純度，結果表明A260/280均在2.0～2.1之間，表明RNA完整性好。A260/230在1.9～2.1之間，表明純度較高，可用于后續(xù)實驗。

2.2 擴增效率與擴增特異性分析

以5倍為濃度梯度稀釋5個梯度，qRT-PCR獲得的GAPDH、MDH、TUA3、TUB7、ACT6的標準曲線斜率、擴增效率和相關系數(shù)（R2）見表1。5個候選內參基因中除ACT6擴增效率有點低只有77.8%，相關系數(shù)（R2）僅有0.889之外，GAPDH、MDH、TUA3、TUB7的引物擴增效率E均大于100%，相關系數(shù)（R2）均大于0.990，符合qRT-PCR對引物擴增效率的要求。溶解曲線分析結果表明，5個候選內參基因的溶解曲線均呈現(xiàn)明顯單一的主峰，相同樣品間的曲線重復性良好（圖2），說明引物的特異性良好，可用于后續(xù)實驗。

2.3 候選內參基因的表達水平分析

Ct值與基因的表達量呈反比，Ct值越大，基因的表達量越低;反之，Ct值越小，代表基因的表達量越高。5個候選內參基因在黃花大苞姜花藥發(fā)育3個階段的Ct值見圖3，5個候選內參基因在黃花大苞姜不同花藥發(fā)育階段中表達的Ct值在18～27之間，其中ACT6和TUB7的表達量較低，GAPDH的表達量最高。

2.4 候選內參基因表達穩(wěn)定性分析

BesterKeeper軟件是基于內參基因Ct值的標準差（SD）和調節(jié)系數(shù)標準差SD（±x - fold）來評判基因的表達穩(wěn)定性，直接對基因表達Ct值進行分析。SD值越小，表達越穩(wěn)定，程序默認臨界值為1，當SD值大于1時，認為該基因表達不穩(wěn)定。分析結果顯示，ACT6的SD值大于1，其余均小于1（表2），表明除ACT6之外，其余4個候選內參均符合作為內參基因的標準，表達最穩(wěn)定的是TUB7。5個候選內參基因的穩(wěn)定性排序依次為TUB7>MDH>GAPDH>TUA3>ACT6。

geNorm V3.5軟件是基于平均表達穩(wěn)定值M來確定候選內參基因的穩(wěn)定性。qRT-PCR實驗獲得的Ct值，需經(jīng)ΔCt方法轉換后方可用于分析。 M值越大，基因的表達穩(wěn)定性越低，M值越小，基因的表達越穩(wěn)定。一般認為，M值等于1.5為基因表達穩(wěn)定的界限，M值大于1.5的基因， 不宜作為內參基因。本研究5個候選內參基因的M值均小于不穩(wěn)定的是ACT6。5個候選內參基因的表達穩(wěn)定性依次為MDH/TUB7>GAPDH>TUA3>ACT6（圖4：A）。此外，geNorm軟件還可以通過計算候選內參基因的配對變異值Vn/n+1來分析最適內參基因數(shù)。

軟件默認Vn/n+1臨界值為0.15，即當Vn/n+1<0.15時，n個內參基因即可滿足內參基因的要求。圖4：B結果顯示V3/4<0.15，即需要3個內參基因MDH、TUB7和GAPDH組合來作為內參基因。

NormFinder是基于組內方差和組間方差來計算基因表達穩(wěn)定性的，基因表達的Ct值也需要經(jīng)ΔCt方法轉換后方可用于分析。穩(wěn)定值越大，代表基因的表達穩(wěn)定性越差，反之，穩(wěn)定性值越小代表，基因表達越穩(wěn)定。圖5結果表明ACT6的表達穩(wěn)定性最差，GAPDH的表達穩(wěn)定性最高。5個候選內參基因的表達穩(wěn)定性依次為GAPDH>TUA3>MDH>TUB7>ACT6。

2.5 內參基因穩(wěn)定性的驗證

綜合考慮BestKeeper、geNorm和Normfinder 3個軟件的分析結果，認為MDH和TUB7在黃花大苞姜花藥發(fā)育中表達相對最穩(wěn)定。分別以MDH和TUB7作為內參基因，以PMC時期作為對照，采用ΔΔCT法，對黃花大苞姜花藥發(fā)育過程中與淀粉和蔗糖代謝相關的1，4-α-葡聚糖支鏈酶基因（1，4-alpha-glucan branching enzyme，GBE1）在花藥發(fā)育過程中的相對表達模式進行分析。并與花藥轉錄組中該基因的表達模式（FPKM）兩兩做相關系數(shù)分析（Pearson），來驗證篩選出的表達相對較穩(wěn)定的內參基因的可靠性。結果表明，以MDH或TUB7作為內參基因獲得的GBE1在花藥發(fā)育中的表達模式，與該基因在轉錄組中的表達模式相關系數(shù)r分別為0.966和0.946，它們兩個之間的相關系數(shù)r為0.998，表明3種途徑獲得的GBE1在黃花大苞姜花藥發(fā)育中的表達模式一致，因此認為MDH和TUB7可作為分析黃花大苞姜花藥發(fā)育過程中相關基因表達模式的內參基因。

3 討論與結論

qRT-PCR技術已被廣泛用于研究基因表達的研究，但是定量結果的準確性與內參基因的穩(wěn)定性表達密切相關，而并不存在所謂恒定表達的內參基因（牙庫甫江等，2011;Huis et al， 2010; Chen et al， 2011）。Mallona et al（2010）篩選矮牽牛葉和花發(fā)育中表達穩(wěn)定的內參基因，NormFinder、BestKeeper、geNorm和qBasePlus 4種軟件綜合分析結果顯示，EF1a在Mitchell品系中最穩(wěn)定，CYP在V30品系中最穩(wěn)定，GAPDH在兩個品系中都最不穩(wěn)定。Xu et al（2014）對中國白菜花蕾發(fā)育中qRT-PCR內參基因進行篩選，geNorm分析結果顯示可育系與不育系花蕾發(fā)育過程中表達最穩(wěn)定的是TUB和GAPDH。Jin et al（2013）分析了不同色系瓜葉菊花發(fā)育過程中的8個候選內參基因的表達穩(wěn)定性，結果表明在所有樣本中SAND和ACT最穩(wěn)定，但是在不同色系中的結果有所不同，藍色和粉紅色品系中SAND和ACT最穩(wěn)定，TIP41和ACT在白色系中最穩(wěn)定，PP2A和ACT在洋紅色系中最穩(wěn)定。而本研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)常用內參基因GAPDH、MDH、TUA3、TUB7、ACT6，在黃花大苞姜花藥發(fā)育過程中表達最穩(wěn)定的基因是MDH和TUB7，最不穩(wěn)定的基因是ACT6。因此篩選特定條件下，穩(wěn)定表達的內參基因對于準確分析目的基因的表達非常重要（Bustin et al， 2010）。

NormFinder、BestKeeper和geNorm軟件是目前最常用于評估內參穩(wěn)定的軟件，但是由于采用不同的算法（Pfaffl et al， 2004;Andersen et al， 2004;Vandesompele et al， 2002），對內參基因穩(wěn)定性的分析結果會有一些差異，目前已經(jīng)有基于這些軟件的研究與分析，并得到了穩(wěn)定表達的內參基因（李晗等，2016;劉文哲等，2016;蘇曉娟等，2013;劉艷霞等，2016）。本研究也采用了這3個軟件對GAPDH、MDH、TUA3、TUB7、ACT6在黃花大苞姜花藥發(fā)育中的表達穩(wěn)定性進行了分析。BestKeeper分析結果顯示，除了ACT6以外，其余4個基因均符合作為內參的要求，MDH和TUB7的表達最穩(wěn)定，ACT6的表達穩(wěn)定性最差。geNorm分析認為5個候選內參基因都符合作為內參的標準，MDH和TUB7的表達最穩(wěn)定，ACT6的表達穩(wěn)定性最差。而NormFinder則分析認為表達最穩(wěn)定的基因是GAPDH和TUA3，ACT6表達穩(wěn)定性最差，但是MDH與TUB7的穩(wěn)定性值與最穩(wěn)定的GAPDH的差異不大。本研究選擇了表達較為穩(wěn)定的MDH和TUB7分別作為內參基因分析GBE1在黃花大苞姜花藥發(fā)育中的表達模式，并與該基因在花藥發(fā)育轉錄組中的表達模式做相關系數(shù)分析，該基因的3種表達模式結果一致。因此，認為MDH和TUB7可作為qRT-PCR分析黃花大苞姜花藥發(fā)育相關基因表達情況的內參基因。

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