鐘文強(qiáng) 孟慶玲 喬軍 陳英 貢莎莎 王熙鳳 黃運(yùn)福 才學(xué)鵬

摘要：【目的】深入了解捕食線蟲性真菌幾丁質(zhì)酶的生物學(xué)功能，為今后以少孢節(jié)叢孢菌重組幾丁質(zhì)酶AO-379研發(fā)線蟲病生物防控制劑打下基礎(chǔ)?！痉椒ā靠寺∩冁吖?jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶AO-379基因的全長序列，利用signalP4.1 server、InterPro、ExPASy等在線分析軟件對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-AO-379，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并以SDS-PAGE和Western blotting檢測分析表達(dá)獲得的融合蛋白。【結(jié)果】少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-379基因全長1475 bp，含有1個1203 bp的開放閱讀框（ORF），編碼400個氨基酸。幾丁質(zhì)酶AO-379基因序列與少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 24927）幾丁質(zhì)酶基因序列的同源性為97.08%，其推導(dǎo)氨基酸的同源性為98.75%。幾丁質(zhì)酶AO-379屬于糖苷水解酶18家族，具有SXGG和VDGFDLDFE兩個催化區(qū)保守序列。其中，SLGGS位于第127～131位，為底物結(jié)合位點(diǎn)；VDGFDLDFE位于第173～181位，為水解酶催化活性位點(diǎn)。經(jīng)大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白AO-379相對分子質(zhì)量為60.0kD，且能與抗少孢節(jié)叢孢菌多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)?！窘Y(jié)論】少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-379可在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)，且獲得的融合蛋白AO-379能與抗少孢節(jié)叢孢菌多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，可用于研發(fā)線蟲病生物防控制劑。

關(guān)鍵詞：少孢節(jié)叢孢菌；幾丁質(zhì)酶AO-379；克?。环肿犹卣?；原核表達(dá)

0引言

【研究意義】線蟲病對畜牧業(yè)的危害日益凸顯，家畜感染后可引起病畜消瘦、生產(chǎn)性能下降、機(jī)能代謝紊亂，甚至死亡，給畜牧業(yè)的生產(chǎn)和管理帶來諸多困擾，全球每年因線蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失超過1570億美元（Abad et al，2008）。雖然化學(xué)驅(qū)蟲藥物的應(yīng)用使得家畜線蟲病得到短暫而有效的控制，但長期使用極易帶來耐藥性、藥物殘留及環(huán)境污染等弊端。因此，亟需尋找一種新型藥物以解決家畜線蟲病對畜牧業(yè)帶來的危害及化學(xué)藥物對環(huán)境造成的污染等問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】捕食線蟲性真菌是家畜寄生線蟲的自然天敵，在滲透、固定和降解線蟲的過程中發(fā)揮著重要作用，理論上可用這類真菌為原料研發(fā)防治線蟲病的生物制劑（Paraud and Chartier，2003；Terrill et al，2004）。在線蟲的誘導(dǎo)下，捕食線蟲性真菌會產(chǎn)生復(fù)雜的菌絲體，如黏性網(wǎng)、黏性球和收縮環(huán)，同時分泌一些水解酶。在菌絲機(jī)械力和水解酶（幾丁質(zhì)酶、絲氨酸蛋白酶和膠原蛋白酶等）的協(xié)同作用下，真菌菌絲侵入線蟲體內(nèi)而發(fā)揮殺滅線蟲的作用（Yang et al，2011；Andersson et al，2013；Lianget al，2013；Zhao et al，2015；趙海龍等，2017）。少孢節(jié)叢孢菌（Arthrobotrys oligospora）是捕食線蟲性真菌的代表菌，其與宿主線蟲間的相互作用已得到廣泛應(yīng)用（Nordbring-Hertz，2004）。幾丁質(zhì)（Chitin）是線蟲體壁和蟲卵外殼的主要成分（Tikhonov etal，2002），是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的高分子生物多聚體，但來源于致病性真菌的幾丁質(zhì)酶能催化幾丁質(zhì)β-1，4糖苷鍵水解（趙海龍等，2017）。現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)，捕食線蟲性真菌幾丁質(zhì)酶可參與線蟲表皮侵入和宿主細(xì)胞壁的降解（Tikhonov et al，2002；Nordbring-Hertz，2004；Tiffin，2004），是捕食線蟲性真菌發(fā)揮捕食線蟲功能的一種重要功能蛋白。張成敏等（2009）研究表明，厚垣普奇尼亞菌系產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶能消解南方根結(jié)線蟲卵殼，特別是胚前發(fā)育期的未成熟卵，起到抑制蟲卵孵化或殺死蟲卵的作用。趙海龍等（2015）研究證實(shí)，少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶AO-801和AO-483均具有典型的幾丁質(zhì)酶催化區(qū)保守序列SXGGW和DGXDXDWE，屬于糖苷水解酶18家族幾丁質(zhì)酶，與昆蟲病原真菌幾丁質(zhì)酶的親緣關(guān)系最近，推測其在侵入宿主的過程中發(fā)揮著相似功能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶編碼蛋白分子特征及表達(dá)分析的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶AO-379基因進(jìn)行克隆測序及原核表達(dá)分析，旨在深入了解捕食線蟲性真菌幾丁質(zhì)酶的生物學(xué)功能，為下一步以少孢節(jié)叢孢菌重組幾丁質(zhì)酶AO-379研發(fā)線蟲病生物防控制劑打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1分離株和大腸桿菌DH5a菌株由石河子大學(xué)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存提供；2xTaqPCR反應(yīng)試劑和DNA Marker購自北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pMD 19-T載體和Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。YPSSA培養(yǎng)基（0.8g酵母提取物、可溶性淀粉、4.0g瓊脂，加蒸餾水至200 mL）經(jīng)高壓滅菌后傾注于滅菌玻璃培養(yǎng)皿，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank已發(fā)表的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 2492）AO-379（AOL_s00004g379）mRNA序列，利用Primer 5.0設(shè)計幾丁質(zhì)酶AO-379基因的特異性引物，上、下游引物分別引入EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。AO-379-F：5'-GGAATTCATGTT-GTTCAAATATAT-3'（下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)）；AO-379-R：5'-CCCTCGAGGCTTAGTTGGACAAGAAGCCC-3'（下劃線部分為xho I酶切位點(diǎn)），引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3幾丁質(zhì)酶AO-3795因克隆

將少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1分離株接種于YPSSA培養(yǎng)基上，在20℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周后取適量菌絲，按照真菌DNA提取試劑盒說明提取XJ-A1分離株基因組DNA，用特異性引物（AO-379-F/AO-379-R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在此基礎(chǔ)上，提取XJ-A1分離株總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20.0μL：PCR Mixtiure 8.0μL，上、下游引物各0.5μL，cDNA模板2.0μL，ddH₂0 9.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃50 s，63℃40 s，72℃100 s，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收。

1.4序列測定及結(jié)構(gòu)域分析

分別回收PCR和RT-PCR基因片段，與pMD19-T載體4℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐抗性培養(yǎng)基篩選后挑取單一菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和EcoR I、Xho I雙酶切鑒定。將陽性質(zhì)粒送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序，然后利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）、ExPASy（http：//www.expasy.org/tools/）等在線分析軟件對幾丁質(zhì)酶AO-379基因全長和cDNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.5原核表達(dá)載體構(gòu)建

用EcoR I和Xho I對重組質(zhì)粒pMDT-AO-379和pET32a載體分別進(jìn)行雙酶切，回收pET32a和A0-379雙酶切片段，在T4 DNA連接酶作用下4℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性培養(yǎng)基上3 7℃過夜培養(yǎng)，挑取單一菌落，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定篩選出陽性重組表達(dá)載體（pET32a-AO-379）。

1.6目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

以重組表達(dá)載體pET32a-AO-379轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐抗性篩選，挑取陽性克隆接種于含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD為0.6～0.8，加入IPTG（終濃度1 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.7重組蛋白SDS-PAGE分析及Western blotting鑒定

分別誘導(dǎo)表達(dá)4、6和8 h后收集菌體，對重組菌的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，并于表達(dá)量最高時收集菌體進(jìn)行Westem blotting鑒定，其中，一抗為小鼠抗少孢節(jié)叢孢菌多克隆抗體（自備），二抗為HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG。

2結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR和PCR擴(kuò)增結(jié)果

以少孢節(jié)叢孢菌提取的總RNA為模板，分別經(jīng)RT-PCR和PCR擴(kuò)增后，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約1200 bp（圖1-A），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約1500 bp（圖1-B），均與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 AO-379基因測序結(jié)果及分子特征分析結(jié)果

少孢節(jié)叢孢菌AO-379基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果（圖2）表明，AO-379基因全長1475 bp，含有2個內(nèi)含子序列，分別位于第247～446和739～810位核苷酸，內(nèi)含子具有保守的5'-GT和3'-AG端，符合真菌內(nèi)含子的特征；含有1個1203 bp的開放閱讀框（ORF），編碼由400個氨基酸組成的多肽。幾丁質(zhì)酶AO-379的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲（coil）、a-螺旋（alpha-helix）和β-折疊（beta-sheet）為主要結(jié)構(gòu)元件，分別占61.9%、26.6%和11.5%。幾丁質(zhì)酶AO-379基因序列與少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 24927）序列的同源性為97.08%，其推導(dǎo)氨基酸的同源性為98.75%。ExPASy分析發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶AO-379含有多個保守結(jié)構(gòu)域，屬于糖苷水解酶18家族，具有SLGGS和VDGFDLDFE兩個高度保守的區(qū)域，其中VDGFDLDFE區(qū)域還是幾丁質(zhì)酶的特征序列。SLGGS位于第127～131位，為底物結(jié)合位點(diǎn)；VDGFDLDFE位于第173～181位，為水解酶催化活性位點(diǎn)。幾丁質(zhì)酶AO-379氨基酸序列信號肽位于第1～21位，且存在一個幾丁質(zhì)酶插入?yún)^(qū)域，位于第254～315位（圖3）。

2.3幾丁質(zhì)酶遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

由基于幾丁質(zhì)酶AO-379氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）可看出，真菌幾丁質(zhì)酶可分成三大類。來自曲霉真菌的7個幾丁質(zhì)酶聚為一個分支（第1類），是由分子量約50.0 kD的幾丁質(zhì)酶組成；來自內(nèi)寄生真菌和昆蟲病原真菌的幾丁質(zhì)酶形成另一分支（第Ⅱ類），由分子量約38.0 kD的幾丁質(zhì)酶組成；少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-379與Dactylellina haptotyla幾丁質(zhì)酶親緣關(guān)系最近，屬于第Ⅲ類；而真菌Thielavia terrestris NRRL和Pyronema omphalodes P29029分別形成一個獨(dú)立的分支，預(yù)測其分子量為43.0和38.7 kD（http：//us.ex-pasy.org/tools/protparam.html）。

2.4重組表達(dá)載體pET32a-A0-3 79的鑒定結(jié)果

重組表達(dá)載體pET32a-AO-379經(jīng)PCR擴(kuò)增可獲得與預(yù)期結(jié)果一致的目的基因條帶；經(jīng)雙酶切鑒定也得到大小約1200 bp的插入片段條帶（圖5），與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組表達(dá)載體pET32a-AO-379構(gòu)建成功。測序結(jié)果證實(shí)，插入片段為少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-379基因。

2.5融合蛋白AO-379的誘導(dǎo)表達(dá)情況

SDS-PAGE分析結(jié)果表明，在60.0 kD附近出現(xiàn)目的蛋白條帶（圖6），其分子量與預(yù)期結(jié)果相符，說明重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4～8h，均能表達(dá)獲得融合蛋白AO-379。Western blotting鑒定結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量60.0kD處可見特異性反應(yīng)條帶（圖6），即表達(dá)獲得的融合蛋白AO-379能與抗少孢節(jié)叢孢菌多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-379可在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)。

3討論

幾丁質(zhì)是一種氨基多糖（Kumar，2000；Tharana-than and Farooqahmed，2003），其結(jié)構(gòu)成分堅(jiān)硬且具有極強(qiáng)的抗性，對甲殼類生物體抵抗外界不良環(huán)境起關(guān)鍵性作用（Su et al，2017）。幾丁質(zhì)廣泛分布于線蟲蟲卵及其表皮上，因此尋找一種能降解幾丁質(zhì)的生物防控制劑代替化學(xué)藥物，對解決家畜線蟲病害及減少化學(xué)藥物對環(huán)境造成的污染等問題具有重要意義（Khan et al，2004）。捕食線蟲性真菌可通過機(jī)械力和水解酶（幾丁質(zhì)酶、蛋白酶和膠原酶等）的協(xié)同作用進(jìn)入線蟲體內(nèi)，從而降解線蟲和蟲卵體壁幾丁質(zhì)酶能破壞幾丁質(zhì)中的β（1-4）鍵，并將其完全水解成N-乙酰基-β-D-葡萄糖，因此推測幾丁質(zhì)酶是真菌穿透、附植和消化線蟲過程中的關(guān)鍵毒性因子（Yang et al，2007；Huang et al，2012）。1994年，Tunlid等從少孢節(jié)叢孢菌中分離純化獲得絲氨酸蛋白酶PII，并證實(shí)其對線蟲角質(zhì)層具有降解作用。之后，幾丁質(zhì)酶的研究得到深入開展，目前已從Magnaporthe oryzae，Trichoderma reesei，Mythica ac-ridus和Metarhizium anisopliae等幾種致病真菌中鑒定出15、18、21和30等幾丁質(zhì)酶（De031 et al，2005；Seidl et al，2005；Gao et al，2011），從非致病真菌構(gòu)巢曲霉和N.crassa的基因組中也分別鑒定出10種幾丁質(zhì)酶（Pusztahelyi et al，2006；Tzelepis et al，2012）。此外，Yang等（2013）從少孢節(jié)叢孢菌的基因組中鑒定出編碼幾丁質(zhì)酶的16個ORF，且發(fā)現(xiàn)在缺乏碳和氮的條件下，幾丁質(zhì)酶AO-190和AO-379分別上調(diào)2.33和1.64倍，說明幾丁質(zhì)酶在少孢節(jié)叢孢菌侵染線蟲的過程中發(fā)揮重要作用。

目前，有關(guān)真菌幾丁質(zhì)酶的研究已有較多報道，并證明其具有重要的生物學(xué)功能（馮俊麗和朱旭芬，2004；Khan et al，2004；Tiffin，2004；趙海龍等，2015），但構(gòu)建其原核表達(dá)載體的研究鮮有報道。本研究對少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-379基因進(jìn)行克隆和原核表達(dá)分析，結(jié)果表明，幾丁質(zhì)酶AO-379基因序列與少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 24927）幾丁質(zhì)酶基因序列的同源性為97.08%，其推導(dǎo)氨基酸的同源性為98.75%，說明捕食線蟲性真菌少孢節(jié)叢孢菌不同分離株間存在一定差異。幾丁質(zhì)酶AO-379結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析結(jié)果表明，不同來源的真菌幾丁質(zhì)酶具有相似結(jié)構(gòu)域，從N端到C端含有幾丁質(zhì)酶催化域、幾丁質(zhì)結(jié)合域及C端區(qū)域等結(jié)構(gòu)域，且N端催化區(qū)的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）殘基高度保守，與馮俊麗和朱旭芬（2004）、趙海龍等（2015）的研究結(jié)論一致。本研究的少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO一379屬于糖苷水解酶18家族，含有1個高度保守的SLGGS底物結(jié)合位點(diǎn)和1個高度保守的VDGFDLD-FE水解酶催化活性位點(diǎn)；遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-379與Dactylelina hap-totyla幾丁質(zhì)酶親緣關(guān)系最近；SDS-PAGE分析及Western blotting鑒定結(jié)果表明，少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-379可在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)，且獲得的融合蛋白AO-379能與抗少孢節(jié)叢孢菌多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，可用于研發(fā)線蟲病生物防控制劑。

4結(jié)論

少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-379可在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)，且獲得的融合蛋白AO-379能與抗少孢節(jié)叢孢菌多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，可用于研發(fā)線蟲病生物防控制劑。