劉少偉，姜 歡，王曉龍，李夢紅，陳 玉，唐中元，胡 敏

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，吉林 長春 130021； 2.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院老年病科，吉林 長春 130021)

在正畸臨床治療中，應(yīng)用適當(dāng)?shù)牧χ悼梢允寡例X周圍的牙槽骨和牙周組織不斷發(fā)生適應(yīng)性改建從而使牙齒發(fā)生移動，但不當(dāng)?shù)臋C(jī)械壓力會導(dǎo)致受壓側(cè)牙骨質(zhì)發(fā)生病理性牙根外吸收。研究[1-2]表明：介導(dǎo)牙根外吸收的破牙骨質(zhì)細(xì)胞與介導(dǎo)骨吸收的破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)在形態(tài)、功能上相似。OC是由骨髓造血干細(xì)胞分化的單核-巨噬細(xì)胞經(jīng)過進(jìn)一步融合而成的多核細(xì)胞，其在骨吸收活動中起重要作用[3]。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵酶，參與了OC的分化、黏附及活性的調(diào)節(jié)等重要過程[4-6]。

1996年Wu等[7]首次從兔破骨細(xì)胞cDNA文庫中通過分子克隆的方法分離了一段獨(dú)特的PTP序列，稱之為破骨細(xì)胞蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTP-oc)，并證實(shí)PTP-oc是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的受體型跨膜PTP。PTP-oc主要表達(dá)于造血細(xì)胞[B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞(OC前體細(xì)胞)]和成熟OC中，其表達(dá)具有細(xì)胞類型特異性[8-10]。近年來學(xué)者[11-14]發(fā)現(xiàn)PTP-oc是破骨細(xì)胞形成中的關(guān)鍵因子，對OC的活性有重要的調(diào)控作用，其通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活c-src PTK活性以及c-src依賴的NF-κB 和JNK2信號通路[13]，并且可以正調(diào)節(jié)Rac-GTP酶活性，負(fù)調(diào)節(jié) Rho-GTP酶活性，差別性地調(diào)控Rac和Rho信號通路從而抑制EPHA4信號通路[15]。為了進(jìn)一步了解PTP-oc在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用機(jī)制，便于后期進(jìn)一步研究PTP-oc的功能，本研究首次制備兔抗多克隆抗體，并鑒定其效價(jià)和特異性。本課題組前期研究[16]已成功構(gòu)建pET28a-ΔPTP-oc重組質(zhì)粒，因此本研究采用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)菌中進(jìn)行原核蛋白表達(dá)，純化重組蛋白,免疫家兔制備多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑 pET28a-ΔPTP-oc重組質(zhì)粒、BL21(DE3)和RAW264.7細(xì)胞均由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院費(fèi)舍爾實(shí)驗(yàn)室提供。新西蘭大白兔由吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)，動物合格證號：SYXK(吉)2014-0012。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-bD-thiogalactopyranoside,IPTG,TaKaRa公司，日本)，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(Sigma公司，美國)，Costar96孔酶標(biāo)板(百金生物科技公司，中國)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(博奧森公司，中國)，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(TransGen Biotech公司，中國)，Protein A 瓊脂糖(Invitrogen公司，美國)。

1.2 重組蛋白質(zhì)的表達(dá) 將pET28a-ΔPTP-oc重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)中，挑菌，由吉林省庫美公司進(jìn)行鑒定。將鑒定正確、成功轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)菌種10 μL用1 mL LB液體培養(yǎng)基活化，過夜，第2天擴(kuò)大再培養(yǎng)至200 mL LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液吸光度(A)值達(dá)到0.4時(shí)采用0.1 mmol·L-1IPTG在16℃、24 h條件下誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)后菌體，采用20 mL PBS重懸后7 000 r·min-1離心10 min，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。收集離心后的菌體采用Extraction Buffer(50 mmol·L-1Tris-HCl,pH7.4，2 mmol·L-1EDTA，2 mmol·L-1β-巰基乙醇,20% glycerol)加入1 mmol·L-1苯甲脒,0.1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟,1 mmol·L-1抑肽素在冰水浴中進(jìn)行超聲破碎，破碎后菌液在4℃、130 000 r·min-1離心30 min獲取上清。

1.3 重組蛋白質(zhì)的純化 利用Q柱陰陽離子交換和Ni-NTA鎳離子親和層析純化上清獲得PTP-oc重組蛋白質(zhì)。使用Q柱陰陽離子交換的步驟：先用5倍柱體積的Equilibrate Buffer Q(50 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1EDTA、1 mmol·L-1β-巰基乙醇、20% 甘油,pH 7.4)平衡Q柱，上樣，使用含有不同濃度梯度NaCl的Elution Buffer Q(50 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1EDTA、1 mmol·L-1β-巰基乙醇、20% 甘油,pH7.4)洗脫重組蛋白，NaCl濃度依次為0.2、0.4和0.6 mol·L-1；對硝基苯磷酸鹽法(PNPP)檢測發(fā)現(xiàn)：當(dāng)NaCl濃度為0.6 mol·L-1時(shí)可使目的重組蛋白從Q柱洗脫。隨后將洗脫的重組蛋白再使用Ni-NTA鎳離子親和層析進(jìn)一步純化，步驟簡述如下：先用5倍柱體積的Equilibrate Buffer Ni(50 mmol·L-1Tris-HCl、20% 甘油，pH 7.4)平衡Ni-NTA柱，隨后將由Q柱純化后的重組蛋白上樣，使用Washing Buffer Ni(50 mmol·L-1Tris-HCl、20% 甘油、0.5 mol·L-1NaCl,pH 7.4)洗去雜蛋白，采用Elution Buffer Ni(50 mmol·L-1Tris-HCl、20% 甘油、50 mmol·L-1Imidazole,pH 7.4)洗脫目的蛋白，獲得純化的PTP-oc重組蛋白，所有操作均在4℃條件下進(jìn)行。純化后的蛋白采用SDS-PAGE鑒定。

1.4 PTP-oc多克隆抗體的制備 新西蘭大白兔在新環(huán)境下飼養(yǎng)1周后耳緣靜脈采血，作為陰性對照。將純化的PTP-oc重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分研磨，使其完全乳化。采用背部皮下多點(diǎn)注射，首次免疫蛋白為500 μg。在免疫后第14、21和28天，將PTP-oc 重組蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫蛋白為250 μg。在免疫第35天由兔耳緣靜脈取血，采用間接ELISA法對血清效價(jià)進(jìn)行檢測。

1.5 間接ELISA法檢測PTP-oc抗血清效價(jià) 將PTP-oc純化蛋白用包被液(0.05 mol·L-1碳酸鹽緩沖液，pH9.6)稀釋至10 mg·L-1，在96孔酶標(biāo)板中每孔加入100 μL，4℃過夜。以不加樣品孔為空白對照，加免疫前血清孔為陰性對照。次日去除包被液，PBST(0.01 mol·L-1PBS，含0.1% Tween20)振蕩洗滌3次，每次5 min；每孔加入300 μL含2% BSA的封閉液，37℃封閉2 h。去除封閉液，PBST振蕩洗滌3次，每次5 min。分別加入稀釋的免疫前血清及抗血清，選擇倍比稀釋，每孔加入100 μL，37℃孵育90 min。PBST振蕩洗滌3次，每次5 min；加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG (1∶5 000)，每孔加入100 μL，置于37℃孵育45 min。PBST振蕩洗滌3次，每次5 min；每孔加入TMD顯色液100 μL，37℃避光反應(yīng)20 min;隨后每孔加入100 μL終止液(0.5 mol·L-1硫酸)，終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀上讀數(shù)[17]。[(實(shí)驗(yàn)組A(450)值-空白組A(450)值]/[(陰性組A(450)值-空白組A(450)值]≥2.1 者為抗血清陽性。

1.6 PTP-oc多克隆抗體的純化 采用Protein A瓊脂糖純化血清中的抗體：采用1 mL Protein A瓊脂糖裝柱后，加入5 mL結(jié)合緩沖液(0.15 mol·L-1NaCl、0.02 mol·L-1Na2HPO4，pH 7.0)平衡，將血清用結(jié)合緩沖液稀釋(1∶5)，稀釋后將血清過柱，待血清全部流過柱子后用10 mL洗脫緩沖液(0.15 mol·L-1NaCl、0.02 mol·L-1Na2HPO4，pH 7.0)洗柱，隨后采用5 mL洗脫液(0.1 mol·L-1Glycine，pH 3.0)洗脫，洗脫結(jié)束后立即在每1 mL甘氨酸洗脫液中加入0.1 mL、1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，所得洗脫液中加入疊氮鈉后-80℃保存。純化后的抗血清應(yīng)用SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)鑒定，結(jié)果以條帶強(qiáng)弱顯示。

1.7 Western blotting法檢測RAW264.7細(xì)胞中PTP-oc的表達(dá) 收集由RANKL誘導(dǎo)第5天的RAW264.7細(xì)胞[18]，采用蛋白裂解液裂解后離心(13 000 r·min-1、30 min、4℃) 取上清液，進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(200 mA、80 min)上，采用 0.3% BSA 37℃封閉 2 h,用抗血清作為一抗(1∶7 000稀釋)，4℃條件下孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000 稀釋)，37℃孵育2 h，TBST洗膜3次后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化 通過Q柱陰陽離子交換和Ni-NTA鎳離子親和層析，所得樣品在30 000處顯示出單一條帶，與預(yù)測目的條帶大小一致，且純度較高，其純度可用于免疫家兔制備多克隆抗體。見圖1。

M:Protein marker；Lane 1:Supernatant after centrifugalization；Lane 2：Sediment after centrifugalization；Lane 3:Supernatant flowed through Q fast flow agarose；Lane 4:Sample flowed through Ni-NTA；Lane 5:Purified recombinant PTP-oc protein.

圖1 SDS-PAGE法檢測重組PTP-oc蛋白表達(dá)和純化電泳圖

Fig.1 Electropherogram of expression and purification of recombinant PTP-oc protein detected by SDS-PAGE method

2.2 PTP-oc抗血清效價(jià) 在第4次免疫1周后采用間接ELISA法對兔抗血清的效價(jià)進(jìn)行檢測，ELISA法檢測結(jié)果顯示：在第4次免疫后抗血清效價(jià)達(dá)到1∶32 000以上，表明重組蛋白質(zhì)PTP-oc經(jīng)過4次免疫家兔后誘導(dǎo)家兔機(jī)體產(chǎn)生了抗PTP-oc的特異性抗體，可對家兔取血分離血清。 見表1。

表1 間接 ELISA 法檢測兔PTP-oc抗血清效價(jià)

2.3 PTP-oc多克隆抗體純化 將經(jīng)Protein A瓊脂糖純化的血清中IgG經(jīng)過SDS-PAGE電泳，從電泳結(jié)果中可以看出純化后的IgG在50 000和25 000處具有2個特異性的條帶，與IgG 重鏈和輕鏈大小一致，制備的兔抗PTP-oc多克隆抗體的純化效果較好。見圖2。

M：Protein marker;Lane 1:PTP-oc polyclonal antibody.

Fig.2 Electropherogram of purification of PTP-oc polyclonal antibody detected by SDS-PAGE method

2.4 RAW264.7細(xì)胞中PTP-oc蛋白的表達(dá) 以兔抗血清作為一抗，Western blotting法檢測結(jié)果顯示：誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞在47 000處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，大小與預(yù)測的RAW264.7細(xì)胞中PTP-oc蛋白大小一致，說明制備的抗PTP-oc多克隆抗體特異性較好。見圖3。

3 討 論

牙根外吸收是臨床正畸治療過程中常見的并發(fā)癥之一，是由機(jī)械力引發(fā)的受壓側(cè)牙骨質(zhì)出現(xiàn)破牙骨質(zhì)細(xì)胞所導(dǎo)致的病理性吸收。在正畸壓力作用下，牙根周圍產(chǎn)生各種炎癥因子(白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子α等)，激活RANK和RANKL信號通路使得OC和破牙骨質(zhì)細(xì)胞分化成熟[19]，而這一過程中OC中酪氨酸的磷酸化起重要作用[20]。PTPs作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵酶，與蛋白酪氨酸激酶(PTKs)共同調(diào)控酪氨酸殘基的磷酸化，在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和增殖分化等過程中起至關(guān)重要的作用[21]。Wu等[7]首次證實(shí)：PTP-oc是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的受體型跨膜PTP，其相對較短，僅由405個氨基酸殘基組成，其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域很短，只有8個氨基酸，并且缺乏近N端的信號肽段，因此PTP-oc并不是典型的受體型PTP。PTP-oc與1種腎的受體型PTP,即GLEPP1[22](亦稱PTP-U2、PTPRO、CRYP2、PTPBK或PTPRO-FL)在跨膜區(qū)域和細(xì)胞中結(jié)構(gòu)域的序列相同，且兩者均是由PTPRO基因所調(diào)控，但是兩者的啟動子不同，遠(yuǎn)端的啟動子編碼GLEPP1，主要在腎、腦、脾和造血干細(xì)胞中表達(dá)，而近端啟動子編碼的是PTP-oc,主要表達(dá)于造血干細(xì)胞和成熟的OC[7]。

M:Protein marker；Lane 1:PTP-oc;A：PTP-oc polyclonal antibody；B：GAPDH.

圖3 Western blotting法檢測RAW264.7細(xì)胞中PTP-oc蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expression of PTP-oc protein in RAW264.7 cells detected by Western blotting method

Suhr等[11]使用反義寡聚脫氧核苷酸抑制兔OC中的PTP-oc，降低了OC的骨吸收能力；Amoui等[13]發(fā)現(xiàn)：在RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨樣細(xì)胞中過表達(dá)PTP-oc時(shí)，促進(jìn)了該細(xì)胞向OC的分化，并且增強(qiáng)了骨吸收能力。c-src PTK的活性對成熟OC的功能活性有重要影響[23]，c-src PTK的活性主要取決于其527位點(diǎn)酪氨酸的磷酸化狀態(tài)，當(dāng)527位點(diǎn)的酪氨酸被磷酸化時(shí)，其PTK活性受到抑制；當(dāng)527位點(diǎn)的酪氨酸去磷酸化時(shí)，其PTK活性被激活，從而調(diào)節(jié)OC的活性。PTP-oc可以使OC的c-src PY527去磷酸化[24]，從而激活c-src PTK的活性以及c-src依賴的NF-κB和JNK2信號通路的激活[13]，最終使得OC活化并增強(qiáng)了OC的骨吸收活動，即PTP-oc可以正向調(diào)節(jié)c-src PTK的活性。Lau等[15]發(fā)現(xiàn)：PTP-oc還可以通過去磷酸化EPHA4的關(guān)鍵磷酸酪氨酸殘基，使得EPHA4失活，從而抑制EPHA4信號通路，提高OC的活性。上述研究結(jié)果均顯示：PTP-oc對于破骨性吸收有重要的正向調(diào)節(jié)作用。Yang等[25]通過靶向敲除PTP-oc的啟動子，從而阻止了RANKL介導(dǎo)的OC的分化，說明PTP-oc在OC的分化過程中也起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)采用本課題組前期構(gòu)建的pET28a-ΔPTP-oc重組質(zhì)粒，成功轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。在純化重組蛋白時(shí)采用Q柱陰陽離子交換和Ni柱親和層析方法，這與本課題組前期研究[15]僅采用Ni-NTA鎳離子親和層析比較，獲得的重組蛋白純度有明顯的提高，利用純化的PTP-oc重組蛋白免疫家兔成功地制備了多克隆抗體，經(jīng)檢測鑒定后發(fā)現(xiàn)抗體的效價(jià)和特異性均較高，并采用Western blotting法檢測RAW264.7細(xì)胞中PTP-oc的表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)一步研究PTP-oc在OC中的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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