裴鵬兵，吳潔瓊，梁宏豪，杜 虹,2,4

( 1.汕頭大學 理學院 生物系，廣東 汕頭 515063；2.汕頭大學 理學院，海洋生物研究所，廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室，廣東 汕頭 515063；3.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；4.汕頭大學 理學院，汕頭大學—馬爾凱理工大學藻類聯(lián)合研究中心，廣東 汕頭 515063 )

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦，具有個體大、生長快、營養(yǎng)需求低、抗病力強等優(yōu)點，是目前世界上三大養(yǎng)殖對蝦中單產(chǎn)量最高的對蝦品種之一。近年來，在凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中，病害尤其是細菌性疾病、水質(zhì)惡化等現(xiàn)象頻發(fā)[1]，像白斑病、紅腿病、軟殼病等[2-3]。水質(zhì)的好壞直接影響著對蝦腸道菌群組成，近幾年的研究表明[4-5]，細菌在蝦腸道中的作用受到越來越多的關(guān)注，其對宿主動物的腸道發(fā)育、營養(yǎng)、免疫應(yīng)答和疾病抗性發(fā)揮著重要作用。對蝦腸道內(nèi)的一些有益共生菌對疾病有一定的抗病性[6-7]，同時也存在著一些條件致病菌，二者共同維持著腸道菌群的動態(tài)平衡[8]。因此，研究對蝦腸道菌群動態(tài)分布對了解對蝦的健康和可持續(xù)養(yǎng)殖有著積極作用。楊鶯鶯等[9]利用純化培養(yǎng)法，從人工飼料飼養(yǎng)的對蝦腸道和養(yǎng)殖水體中共分離出71株細菌，而環(huán)境中99%的細菌是不可培養(yǎng)的，所以純化培養(yǎng)法不能全面地反映對蝦腸道菌群組成及多樣性。劉淮德等[10]應(yīng)用變性梯度凝膠電泳技術(shù)在凡納濱對蝦腸道中檢測出了12種細菌。王春忠等[3]采用構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫的方法對長毛對蝦(Penaeuspenicillatus)海水養(yǎng)殖環(huán)境以及蝦腸道微生物群落組成進行研究，檢測到對蝦腸道細菌優(yōu)勢種群為厚壁細菌(75.79%)、梭桿菌(13.68%)和γ-變形桿菌(10.53%)。Illumina Miseq高通量測序作為新一代測序技術(shù)，具有速度快、測序容量大、精確度高等特點[11]，能夠較為真實、全面地反映樣品中微生物群落組成的基本特征，廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域。

生物凈水柵——以聚酯為材質(zhì)通過纏繞成結(jié)而形成線性附著基質(zhì)作為微生物附著的載體[12]，微生物在其表面不斷聚集、生長、繁殖，逐漸形成一層結(jié)構(gòu)復雜的生物膜，生物凈水柵在池塘水產(chǎn)養(yǎng)殖上受到廣泛關(guān)注[13-14]。筆者以傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖(對照組)和添加生物凈水柵池塘養(yǎng)殖(試驗組)的凡納濱對蝦腸道為試驗對象，采用高通量測序技術(shù)對兩組對蝦腸道的菌群組成進行分析，比較兩組對蝦腸道菌群組成的差異，以期為生物凈水柵應(yīng)用于池塘養(yǎng)殖提供參考意見。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗實施的地點位于廣東省汕頭市西郊牛田洋養(yǎng)殖基地，設(shè)置一個添加生物凈水柵池塘(試驗組)和一個傳統(tǒng)池塘(對照組)，對照組未添加生物凈水柵，其他條件均一致。兩個池塘在養(yǎng)殖期間均不投藥和添加抗生素。對蝦的養(yǎng)殖時間為2015年6月23日至2015年12月19日，樣品采集時間是2015年10月31日，采樣日停止投喂飼料。凡納濱對蝦起始規(guī)格為(2.0±0.1) cm，兩個池塘投苗量均為200尾/m2。

每日7：00開始充氧，充氧3～4 h，并于10:00投喂飼料，投喂量視具體情況而定，前3周日投喂2次(第2次于18：00投喂)，之后每日投喂1次。當遇到惡劣天氣，如酷熱或臺風暴雨天氣時，分別采取補充水源(附近的溝渠水源)和及時排出雨水等措施。

1.2 試驗試劑、儀器

DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.? Stool DNA Kit)購自O(shè)mega公司、DNA Marker(λ-Hind Ⅲ digest)購自Takara公司、DNA Marker(D2000)購自Tiangen公司、Eppendorf高速冷凍離心機(5424R型)購自廈門市諾源泰儀器設(shè)備有限公司，Eppendorf舒適型恒溫混勻器(5355型)購自上海創(chuàng)奕科教設(shè)備有限公司，Scientz-48型高通量組織研磨器購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗材料

1.3.1 生物凈水柵

生物凈水柵由汕頭市阿科蔓環(huán)?？萍加邢薰旧a(chǎn)，材料為PET材質(zhì)。該生物凈水柵由多條線性生物基(直徑約5 cm)固定于單一繩子上而一排一排自然懸浮于水面上，使其遍布整個池塘。每組生物凈水柵之間間隔1 m，每組有20條生物基，自然懸浮高度為1.5 m，并且于投苗前將其安置池塘內(nèi)(圖1)。

圖1 生物凈水柵鋪設(shè)

1.3.2 凡納濱對蝦

試驗所用凡納濱對蝦取自廣東省汕頭市西郊牛田洋養(yǎng)殖基地，從蝦塘隨機捕撈體色正常、體表無損傷、大小均一的成熟期凡納濱對蝦，置于冰盒中保存，帶回實驗室立即處理。每組隨機取30尾蝦，隨機分為3個重復，分別命名為試驗組1、試驗組2、試驗組3、對照組1、對照組2、對照組3。在無菌條件下，先用無菌水漂洗試驗用凡納濱對蝦3次，再用75%的無水乙醇沖洗蝦體表3次，用滅菌的解剖刀剖開蝦體腔，用滅菌的鑷子小心取出蝦腸道，再置于0.9%的無菌生理鹽水中漂洗3次，隨后分別置于無菌離心管中，所有樣品均放置-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｈ∠嗤康奈r腸道，置于Scientz-48高通量組織研磨器中充分研磨，研磨后用無菌生理鹽水沖洗得到蝦腸道勻漿。

1.4 試驗方法

采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)(委托深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進行測序和生物信息學分析)，根據(jù)細菌16S rRNA基因V4區(qū)序列設(shè)計引物如下：正向引物515F 5′-GTGCCAGMGCCGCGGTAA-3′；反向引物806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，濾除低質(zhì)量的序列，剩余高質(zhì)量的整理過的數(shù)據(jù)方可用于后期分析。通過序列之間的重疊關(guān)系將序列拼接成標簽，利用uparse(v7.0.1090)軟件在97%相似度下將標簽聚成1個可操作分類單元，得到可操作分類單元的代表序列。然后通過可操作分類單元與數(shù)據(jù)庫比對，對可操作分類單元進行物種注釋，基于可操作分類單元和物種注釋結(jié)果進行樣品物種復雜度分析以及組間物種差異分析。樣品多樣性分析包括物種指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)。利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)做差異顯著性分析，設(shè)置差異顯著性水平α=0.05，當P<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 物種分類及豐度統(tǒng)計

2.1.1 可操作分類單元及其豐度統(tǒng)計

6個樣品獲得的有效序列條數(shù)分別為31 512(試驗組1)、31 351(試驗組2)、31 255(試驗組3)、31 411(對照組1)、30 367(對照組2)和31 329(對照組3)，共產(chǎn)生187 225條序列(表1)。6個樣品各產(chǎn)生的可操作分類單元數(shù)分別為214(試驗組1)、125(試驗組2)、118(試驗組3)、172(對照組1)、109(對照組2)和83(對照組3)，試驗組樣品平均可操作分類單元數(shù)約150，對照組樣品的平均可操作分類單元數(shù)約120(表1)。

表1 樣品可操作分類單元數(shù)統(tǒng)計

2.1.2 可操作分類單元維恩圖

基于試驗組和對照組樣品中所用的可操作分類單元做維恩圖，比較兩組對蝦腸道菌群的物種豐富度差異。兩組對蝦腸道樣品有效可操作分類單元總數(shù)為418個，共有的可操作分類單元數(shù)為117個，占試驗組樣品可操作分類單元總數(shù)的39.53%，占對照組樣品可操作分類單元總數(shù)的48.95%。其中試驗組樣品獨有可操作分類單元數(shù)為179個，對照組樣品獨有可操作分類單元數(shù)為122個，試驗組物種的獨有率達到60.47%，而對照組物種的獨有率為51.05%(圖2)。數(shù)據(jù)表明，兩組對蝦腸道菌群的物種豐富度存在差異，試驗組樣品的物種豐富度要高于對照組，即添加生物凈水柵池塘凡納濱對蝦腸道菌群豐富度比傳統(tǒng)池塘凡納濱對蝦腸道菌群豐富度高。所得可操作分類單元結(jié)果用R語言工具統(tǒng)計和作圖軟件做等級豐度曲線圖(圖3)。等級豐度曲線結(jié)果顯示，6個樣品中的試驗組1的物種豐富度最高，均勻度最低，表明該樣品中物種組成最豐富，但樣品中各物種所占比例差異較大。試驗組樣品中試驗組1、試驗組2、試驗組3的物種豐富度分別高于對照組樣品中對應(yīng)的對照組1、對照組2、對照組3，而試驗組1的均勻度最低(圖3)。整體上看，試驗組樣品的物種豐富度要比對照組樣品高，且均勻度要高于對照組(表2)。

圖2 兩組樣品的維恩圖

2.2 細菌多樣性指數(shù)

從各組樣品的多樣性指數(shù)(表2)可見，試驗組樣品的各項指數(shù)均高于對照組樣品，其中，試驗組樣品的Chao指數(shù)和Ace指數(shù)分別高于對照組樣品的26.34%、24.49%(P>0.05)，說明試驗組蝦腸道的細菌菌群豐富度高于對照組蝦腸道。試驗組樣品的Shannon指數(shù)高于對照組樣品的13.33%(P>0.05)，說明試驗組蝦腸道菌群多樣性高于對照組。

2.3 細菌菌群組成

對兩組樣品的有效序列進行歸類操作分析，統(tǒng)計不同分類單元所對應(yīng)的細菌門類及其相對豐度。試驗結(jié)果表明，兩組樣品之間的菌群結(jié)構(gòu)相似，結(jié)構(gòu)組成所占比例上存在一定的差異性。在門水平上，添加和未添加生物凈水柵池塘凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)主要由13個細菌門組成，分別為變形菌門、擬桿菌門、軟壁菌門、放線菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、厚壁菌門、疣微菌門、藍藻門、梭桿菌門、綠菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門。其中，試驗組樣品和對照組樣品均以變形菌門含量最高，分別占試驗組樣品中細菌總數(shù)的58.97%和對照組樣品中細菌總數(shù)的40.74%(表3，圖4a)。兩組樣品中另外兩大優(yōu)勢門類分別是擬桿菌門和軟壁菌門，兩者分別占試驗組樣品中細菌總數(shù)的26.90%和11.69%，在對照組樣品中的占比分別為28.46%和29.34%(表3)。梭桿菌門和綠菌門均在試驗組樣品中鑒定到，而在對照組樣品中并未鑒定出這兩個細菌門類，這可能跟添加生物凈水柵有關(guān)。另外，硝化螺旋菌門出現(xiàn)在了對照組樣品中而未出現(xiàn)在試驗組樣品中，硝酸螺旋菌門下的硝化螺旋菌屬作為硝化細菌，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽。

圖3 各樣品之間物種多樣性比較

樣品名稱物種指數(shù)Chao指數(shù)Ace指數(shù)Shannon指數(shù)Simpson指數(shù)試驗組152.33±53.52158.46±48.37161.24±46.352.04±0.650.26±0.11對照組121.33±45.76125.42±43.90129.52±43.801.80±0.230.23±0.02

表3 兩組樣品優(yōu)勢細菌門類及其相對豐度

注：表格中“/”表示未鑒定出.下同.

在屬水平上，添加和未添加生物凈水柵池塘凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)主要由弧菌屬(Vibrio)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、Cloacibacterium、黃桿菌屬(Flavobacterium)、紅桿菌屬(Rhodobacter)、Herbaspirillum、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)、短根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、Lutibacterium等細菌屬組成(表4，圖4b)。將兩組樣品中占比>1%的細菌屬定義為該組樣品的優(yōu)勢菌屬。在兩組樣品中，優(yōu)勢菌屬的構(gòu)成及所占比例有明顯不同，試驗組樣品的優(yōu)勢菌屬有弧菌屬、希瓦氏菌屬、Cloacibacterium、黃桿菌屬、紅桿菌屬，分別占該組樣品的70.83%、18.29%、1.97%、1.38%和1.06%，這5種優(yōu)勢菌屬共占據(jù)該組樣品的93.53%。對照組樣品的優(yōu)勢菌屬僅有弧菌屬和希瓦氏菌屬，分別占該組樣品的58.51%和37.67%，兩種優(yōu)勢菌屬共占據(jù)該組樣品的96.18%。在試驗組樣品中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢菌屬Cloacibacterium和紅桿菌屬在對照組樣品中并未發(fā)現(xiàn)，兩組樣品中共有的優(yōu)勢菌屬分別為弧菌屬和希瓦氏菌屬(表4)?？梢钥闯?，試驗組樣品中菌群結(jié)構(gòu)比對照組樣品中菌群結(jié)構(gòu)復雜，且優(yōu)勢菌屬也比對照組樣品多，這表明，添加生物凈水柵池塘凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)比傳統(tǒng)池塘凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)復雜，應(yīng)證了添加生物凈水柵池塘凡納濱對蝦腸道菌群多樣性高于傳統(tǒng)池塘凡納濱對蝦腸道菌群多樣性(表2)。

表4 兩組樣品優(yōu)勢細菌屬類及其相對豐度

3 討 論

3.1 細菌菌群豐富度分析

近十幾年來，一些學者對動物腸道菌群結(jié)構(gòu)進行了一系列研究。現(xiàn)有的技術(shù)中，純化培養(yǎng)法[8]只能研究1%可培養(yǎng)的細菌，99%不可培養(yǎng)的細菌將無法研究[18]，PCR-DGGE法[15-16]和16S rRNA基因克隆文庫法[17]研究菌群結(jié)構(gòu)的信息量不夠充分，也就不能全面反映腸道區(qū)系內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)及多樣性。近幾年興起的高通量測序技術(shù)(如Illumina測序和454測序)[19-20]則克服了這些缺陷，比較全面地揭示了腸道區(qū)系內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)及多樣性。本研究通過高通量測序技術(shù)，從兩組池塘凡納濱對蝦腸道中共檢測出16個細菌門105個細菌屬。

圖4 兩組樣品在門和屬水平上細菌菌群結(jié)構(gòu)及分布a表示兩組樣品在門水平上細菌菌群結(jié)構(gòu)及分布；b表示兩組樣品在屬水平上細菌菌群結(jié)構(gòu)及分布.

關(guān)于對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)及養(yǎng)殖環(huán)境微生物菌群結(jié)構(gòu)已有諸多報道[21-24]，而添加生物凈水柵池塘凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)還未見報道。筆者前期的研究結(jié)果顯示[12]，生物凈水柵作為一種附著基質(zhì)，能夠富集一些微生物和細菌，這些微生物和細菌聚集在一起形成一層生物膜。本研究中，試驗組凡納濱對蝦腸道菌群豐富度高于對照組。有研究表明[13]，凡納濱對蝦會以一些附著基質(zhì)作為棲息場所，并以該附著基質(zhì)上的微生物作為額外的食物來源。生物凈水柵上的微生物大多來源于水體環(huán)境[25]，水體環(huán)境微生物豐富度遠遠高于對蝦腸道菌群豐富度[26]。試驗組凡納濱對蝦腸道菌群有較高的豐富度，可能其腸道內(nèi)含有外界微生物。依托于包括生物凈水柵在內(nèi)的各種基質(zhì)或載體而發(fā)展起來的生物膜技術(shù)大多用于污水處理中[27]，目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖上也有著廣泛應(yīng)用。研究表明[28]，養(yǎng)殖水體中的氮、磷元素有賴于水體中大量的固氮細菌、硝化細菌和反硝化細菌，依靠生物凈水柵表面附著的生物膜建立了去除氮、磷元素的氨氧化細菌、硝化細菌等有益微生物。生物凈水柵不僅穩(wěn)定了水質(zhì)，而且增加了凡納濱對蝦腸道菌群豐富度。

3.2 細菌多樣性分析

在本研究中，試驗組對蝦腸道菌群多樣性高于對照組，添加生物凈水柵將有助于提高對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性。有研究表明[29-30]，由于生物基載體具備可供附著的棲息環(huán)境，水體中一部分營附著生活的細菌逐漸在生物膜上形成優(yōu)勢種群，生物膜上出現(xiàn)了難以在水體中形成優(yōu)勢種群的細菌。生物凈水柵作為可供微生物、細菌附著的生物基載體，其表面可能積累了一些優(yōu)勢細菌。而生物凈水柵又為凡納濱對蝦生長提供了棲息場所，那些優(yōu)勢種群的細菌就會成為凡納濱對蝦額外的食物來源，這就解釋了試驗組凡納濱對蝦腸道菌群多樣性高于對照組。

3.3 細菌菌群組成分析

有研究顯示[31]，不同養(yǎng)殖季節(jié)下，凡納濱對蝦腸道菌群中主要優(yōu)勢菌門類為放線菌門、未分類細菌門、變形菌門和擬桿菌門，分別占細菌總數(shù)的53.5%、22.4%、18.8%和4.32%。本試驗結(jié)果顯示，兩組凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)中均以變形菌門、擬桿菌門和軟壁菌門為優(yōu)勢細菌門類，分別占試驗組樣品細菌總數(shù)和對照組樣品細菌總數(shù)的58.97%、26.90%、11.69%和40.74%、28.46%、29.34%。本研究與前人的研究比較發(fā)現(xiàn)，對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)組成有一定的相似性，但在組成比例上存在差異，這可能與對蝦的養(yǎng)殖季節(jié)、棲息地不同有關(guān)，也可能與對蝦的生理狀態(tài)不同有關(guān)[32]。兩組凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)均以變形菌門為最大優(yōu)勢細菌門類，所占比例上試驗組高于對照組。變形菌門是細菌中最大的一門，試驗組凡納濱對蝦腸道內(nèi)存在的外界微生物可能大部分都屬于變形菌門類。

凡納濱對蝦腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能在對蝦生長中具有重要作用，是維持機體腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵因素[33]。相關(guān)研究表明[23]，工廠化養(yǎng)殖凡納濱對蝦腸道內(nèi)優(yōu)勢菌屬主要是不可培養(yǎng)細菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)和弧菌屬。Wang等[34]從野生的中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)中分離出47株菌屬，弧菌屬和發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)在整個腸道內(nèi)為優(yōu)勢菌屬。本試驗對池塘養(yǎng)殖的凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)研究顯示，兩組凡納濱對蝦腸道均以弧菌屬和希瓦氏菌屬為主要優(yōu)勢菌，研究的差異可能在于養(yǎng)殖模式、對蝦品種和養(yǎng)殖環(huán)境的不同，但均有弧菌屬的存在，這就表明弧菌屬是凡納濱對蝦腸道內(nèi)較為常見的菌屬。且有研究指出[9]，對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)組成受外部環(huán)境影響較大，以弧菌屬為常見菌屬。本研究中，試驗組凡納濱對蝦腸道內(nèi)優(yōu)勢菌屬為弧菌屬、希瓦氏菌屬、Cloacibacterium、黃桿菌屬和紅桿菌屬，對照組凡納濱對蝦腸道內(nèi)優(yōu)勢菌屬為弧菌屬和希瓦氏菌屬，兩組凡納濱對蝦腸道內(nèi)共有的優(yōu)勢菌為弧菌屬和希瓦氏菌屬。紅桿菌屬能夠抑制致病菌的存活，其廣泛地存在于生物絮凝團水體中[35,19]，在試驗組凡納濱對蝦腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)紅桿菌屬，而在對照組中并未發(fā)現(xiàn)。試驗組凡納濱對蝦腸道內(nèi)弧菌屬所占比例要高于對照組，有可能試驗組凡納濱對蝦腸道內(nèi)弧菌屬下大多都是有益菌，一些致病菌可能被抑制生長。造成兩組凡納濱對蝦腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)差異的可能因素是跟添加生物凈水柵有關(guān)。

4 結(jié) 論

以高通量測序技術(shù)為手段，比較了添加生物凈水柵池塘和傳統(tǒng)池塘凡納濱對蝦腸道細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，了解了凡納濱對蝦在這兩種養(yǎng)殖條件下對蝦腸道菌群的一般結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢菌群及相應(yīng)的比例。通過比較分析發(fā)現(xiàn)，添加生物凈水柵池塘凡納濱對蝦腸道菌群豐富度比傳統(tǒng)池塘組高，其菌群多樣性也高于傳統(tǒng)池塘。凡納濱對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性與添加和不添加生物凈水柵有著密切聯(lián)系，這也為今后池塘對蝦養(yǎng)殖提供了參考意見，為蝦塘的健康可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

[1] 溫崇慶, 何瑤瑤, 薛明,等.高通量測序分析DNA提取引起的對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)偏差[J].微生物學報,2016,56(1):130-142.

[2] 鄭天倫, 孔蕾, 朱凝瑜.浙江省南美白對蝦病害流行情況及防控對策[J].科學養(yǎng)魚,2011,3(12):48-49.

[3] 王春忠, 林國榮, 嚴濤,等.長毛對蝦海水養(yǎng)殖環(huán)境以及蝦腸道微生物群落結(jié)構(gòu)研究[J].水產(chǎn)學報,2014,38(5):706-712.

[4] Chaiyapechara S, Rungrassamee W, Suriyachay I,et al.Bacterial community associated with the intestinal tract ofP.monodonin commercial farms[J].Microbial Ecology,2012,63(7):938-953.

[5] Schryver P D, Vadstein O.Ecological theory as a foundation to control pathogenic invasion in aquaculture[J].ISME Journal,2014,8(12):2360-2368.

[6] Round J L, Mazmanian S K.The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease[J].Nature Reviews Immunology,2009,9(5):313-323.

[7] Sonnenburg J L, Chen C T, Gordon J I.Genomic and metabolic studies of the impact of probiotics on a model gut symbiont and host[J].PloS Biology,2006,4(12):2213-2226.

[8] 李繼秋, 譚北平, 麥康森.白斑綜合征病毒與凡納濱對蝦腸道菌群區(qū)系之間關(guān)系的初步研究[J].上海水產(chǎn)大學學報,2006,15(1):109-113.

[9] 楊鶯鶯, 李卓佳, 林亮,等.人工飼料飼養(yǎng)的對蝦腸道菌群和水體細菌區(qū)系的研究[J].熱帶海洋學報,2006,25(3):53-56.

[10] 劉淮德, 王雷, 王寶杰,等.應(yīng)用PCR-DGGE分析南美白對蝦腸道微生物多樣性[J].飼料工業(yè),2008,29(20):55-58.

[11] 秦楠, 栗東芳, 楊瑞馥.高通量測序技術(shù)及其在微生物學研究中的應(yīng)用[J].微生物學報,2011,51(4):445-457.

[12] 裴鵬兵, 杜虹, 黃曉穎,等.PET凈水柵對蝦池養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的影響研究[J].南方水產(chǎn)科學,2017,13(4):42-51.

[13] 江興龍, 鄧來富.凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)池塘生物膜低碳養(yǎng)殖技術(shù)研究[J].海洋與湖沼,2013,44(6):1536-1543.

[14] 江興龍.日本鰻鱺(Anguillajaponica)土池生物膜原位修復低碳養(yǎng)殖技術(shù)的研究[J].海洋與湖沼,2012,43(6):1134-1140.

[15] 張云鵬, 朱立穎, 肖朝耿,等.南美白對蝦體表與腸道細菌菌群結(jié)構(gòu)的DGGE分析[J].中國食品學報,2016,16(8):218-224.

[16] Liu H D, Wang L, Liu M,et al.The intestinal microbial diversity in Chinese shrimp (Fenneropenaeuschinensis) as determined by PCR-DGGE and clone library analyses[J].Aquaculture,2011,317(1/4):32-36.

[17] 李可, 鄭天凌, 田蘊,等.南美白對蝦腸道微生物群落的分子分析[J].微生物學報,2007,47(4):649-653.

[18] 楊坤杰, 王欣, 熊金波,等.健康和患病凡納濱對蝦幼蝦消化道菌群結(jié)構(gòu)的比較[J].水產(chǎn)學報,2016,40(11):1765-1773.

[19] Cardona E, Gueguen Y, Magre K,et al.Bacterial community characterization of water and intestine of the shrimpLitopenaeusstylirostrisin a biofloc system[J].BMC Microbiology,2016,16(1):1-9.

[20] Wu S G, Tian J Y, Gatesoupe F J,et al.Intestinal microbiota of gibel carp (Carassiusauratusgibelio) and its origin as revealed by 454 pyrosequencing[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2013,29(9):1585-1595.

[21] 吳金鳳, 熊金波, 王欣,等.腸道菌群對凡納濱對蝦健康的指示作用[J].應(yīng)用生態(tài)學報,2016,27(2):611-621.

[22] 孫振麗, 宣引明, 張皓,等.南美白對蝦養(yǎng)殖環(huán)境及其腸道細菌多樣性分析[J].中國水產(chǎn)科學,2016,23(3):594-605.

[23] 李玉宏, 柴鵬程, 胡修貴,等.應(yīng)用RFLP和DGGE技術(shù)分析工廠化養(yǎng)殖凡納濱對蝦腸道微生物群落特征[J].漁業(yè)科學進展,2014,35(2):83-89.

[24] Rungrassamee W, Klanchui A, Chaiyapechara S,et al.Bacterial population in intestines of the black tiger shrimp (Penaeusmonodon) under different growth stages[J].PloS One,2013,8(4):e60802.

[25] Zhao P, Huang J, Wang X H,et al.The application of bioflocs technology in high-intensive, zero exchange farming systems ofMarsupenaeusjaponicus[J].Aquaculture,2012,354/355(2):97-106.

[26] Wang C Z, Lin G R, Yan T,et al.The cellular community in the intestine of the shrimpPenaeuspenicillatusand its culture environments[J].Fisheries Science,2014,80(5):1001-1007.

[27] 劉晴, 楊蘭, 王東田,等.凈水污泥為載體的生物膜法在印染廢水處理中的應(yīng)用[J].環(huán)境工程學報,2017,11(1):188-196.

[28] 孫寓姣, 趙軒, 王蕾,等.灃河水系脫氮微生物群落結(jié)構(gòu)研究[J].生態(tài)環(huán)境學報,2014,23(9):1451-1456.

[29] Qiu C S, Zhang D D, Sun L P,et al.Purification of high ammonia wastewater in a biofilm airlift loop bioreactor with microbial communities analysis[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2015,31(1):49-57.

[30] Pang S, Zhang S H, Lv X Y,et al.Characterization of bacterial community in biofilm and sediments of wetlands dominated by aquatic macrophytes[J].Ecological Engineering,2016,97(1):242-250.

[31] Tang Y Y, Tao P Y, Tan J G,et al.Identification of bacterial community composition in freshwater aquaculture system farming ofLitopenaeusvannameireveals distinct temperature-driven patterns[J].International Journal of Molecular Sciences,2014,15(8):13663-13680.

[32] Xiong J B, Wang K, Wu J F,et al.Changes in intestinal bacterial communities are closely associated with shrimp disease severity[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2015,99(16):6911-6919.

[33] 張家松, 段亞飛, 張真真,等.對蝦腸道微生物菌群的研究進展[J].南方水產(chǎn)科學,2015,11(6):114-119.

[34] Wang X H, Li H R, Zhang X H,et al.Microbial flora in the digestive tract of adult penaeid shrimp (Penaeuschinensis)[J].Journal of Ocean University of Qingdao,2000,30(3):492-498.

[35] Cytryn E, Van R J, Schramm A,et al.Identification of bacteria potentially responsible for oxic and anoxic sulfide oxidation in biofilters of a recirculating mariculture system[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(10):6134-6141.