馬小康，吳小嫚，胡樂琴

( 上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，農(nóng)業(yè)部淡水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 農(nóng)業(yè)部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306 )

魚類腸道含有大量微生物，部分微生物接受宿主腸道環(huán)境及本身遺傳特征等因素的定向選擇[1]而定殖下來，成為腸道固有菌群，與宿主及外界環(huán)境之間形成一個相對穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)[2]；其余微生物變化是動態(tài)的，隨著魚類的生長階段、生活水環(huán)境及餌料組成等變化而發(fā)生改變[3]。研究表明，魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)與數(shù)量變化會直接影響魚體的營養(yǎng)與免疫，特別是對外源致病菌的拮抗競爭[4-5]，而菌群失衡更會導(dǎo)致機(jī)體免疫下降及疾病爆發(fā)等[6]，對魚類腸道菌群進(jìn)行更好的調(diào)控和維持顯得極為重要。

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)多為集約化和高密度養(yǎng)殖模式，加上抗生素的濫用，對魚體腸道菌群穩(wěn)態(tài)造成極大負(fù)擔(dān)，而益生菌作為一類通過改善宿主腸道微生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用的活菌物質(zhì)，能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)由抗生素或其他因素造成的腸道菌群紊亂，幫助恢復(fù)穩(wěn)態(tài)[7-8]。在飼料中施用益生菌作為一種有效方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用[9]，但多采用在飼料中直接添加益生菌，用益生菌發(fā)酵飼料較少。飼料發(fā)酵后除益生菌外，還有代謝產(chǎn)物[10]，對畜禽類腸道形態(tài)及菌群結(jié)構(gòu)有明顯改善[11]，但在水生生物中應(yīng)用稀少。筆者以金鯽(Carassiusauratusred var.)幼魚為試驗(yàn)對象，采用16S rDNA高通量測序手段，一方面，利用復(fù)合益生菌制備2種活菌飼料，研究2種活菌飼料對金鯽幼魚腸道及養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)的影響，鑒定核心菌群變化，為益生菌在魚類飼料應(yīng)用中提供參考；另一方面，研究飼料、養(yǎng)殖水體及腸道三者菌群進(jìn)化關(guān)系，分析腸道菌群關(guān)鍵影響因子，為微生態(tài)調(diào)控研究提供一定幫助。

1 材料與方法

1.1 活菌飼料制備

試驗(yàn)所用菌種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)購自廣東微生物菌種保藏中心，分別進(jìn)行菌種活化和小規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，離心收集菌體，用無菌水制成菌懸液，1∶1比例混合備用?；A(chǔ)飼料配方為魚粉40%，小麥粉20%，豆粕20%，玉米粉10%，麥麩6%，魚油2%，預(yù)混料2%。原料粉碎后過60目篩按配方比例稱量質(zhì)量混勻，逐級擴(kuò)大法添加微量組分，制備完成后分為3份：第1份用無菌水調(diào)節(jié)原料含水量40%，記為基礎(chǔ)飼料A1；第2份按3%比例加入復(fù)合菌懸液，用無菌水調(diào)節(jié)原料含水量40%(水和菌液)，記為活菌飼料B1；第3份同樣按3%比例加入復(fù)合菌懸液，用無菌水調(diào)節(jié)原料含水量40%(水和菌液)，以此為發(fā)酵底物裝入帶發(fā)酵呼吸膜袋密封，固體發(fā)酵3 d，溫度30 ℃，記為活菌發(fā)酵飼料C1。所有濕基飼料均通過小型手搖顆粒機(jī)制粒，陰干后4 ℃保存，取0.5 g飼料經(jīng)無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，取一定量稀釋液涂布到平板上，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，確保飼料中枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌活菌含量達(dá)到108cfu/g。

1.2 試驗(yàn)魚及分組

試驗(yàn)所用金鯽幼魚取自上海浦東觀賞魚養(yǎng)殖基地同一批魚種，平均體質(zhì)量為(8.49±0.26) g。試驗(yàn)魚暫養(yǎng)2周后隨機(jī)挑選規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯的魚270尾，分成3組，每組3個重復(fù)(每個重復(fù)30尾)，放入圓形循環(huán)水桶(養(yǎng)殖水體積200 L)中，投喂3種飼料，即基礎(chǔ)飼料(基礎(chǔ)組A)、活菌飼料(活菌組B)和活菌發(fā)酵飼料(發(fā)酵組C)。試驗(yàn)周期為8周，日投喂2次，日投飼量為魚體質(zhì)量的2%(根據(jù)魚的攝食情況進(jìn)行調(diào)節(jié))。水源為曝氣自來水，水溫20～25 ℃，pH 7.4～8.0，溶解氧≥6 mg/L，單循環(huán)水充氣，定期排污。

1.3 樣品采集與處理

1.3.1 生長狀況測定

試驗(yàn)前后，分別對基礎(chǔ)組和試驗(yàn)組采樣，每組取30尾，計(jì)算平均體質(zhì)量。

1.3.2 測序樣品采集與處理

試驗(yàn)開始前，采集15尾魚腸道混合樣品，標(biāo)記CK。試驗(yàn)結(jié)束禁食后，分別對基礎(chǔ)組和試驗(yàn)組采樣，每組采集5 g飼料，分別標(biāo)記A1、B1、C1；3 L混合水樣，分別標(biāo)記A2、B2、C2；15尾魚腸道混合樣品，分別標(biāo)記A3、B3、C3。處理時稱取1 g飼料研缽磨碎，置于15 mL離心管中，加入1～3 mL TE緩沖液穩(wěn)定細(xì)菌DNA；在水桶中心離水面15 cm處取水樣，用0.22 μm濾膜過濾，剪碎濾膜置于15 mL離心管中，加入1～3 mL TE緩沖液備用；在無菌操作臺中用75%酒精擦洗魚體表面，解剖魚體，用75%酒精棉球擦拭腸道外壁，剔除腸道外脂肪，分離出腸道，無菌生理鹽水沖洗數(shù)遍后置于研磨管中，加入1～3 mL TE緩沖液研磨至勻漿液，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中備用。

1.4 樣品細(xì)菌總DNA提取

樣品細(xì)菌基因組總DNA選用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit提取，嚴(yán)格按照說明書操作，所有樣品總DNA均重復(fù)提取2次以上并混合在一起，以避免偏差。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，確定PCR反應(yīng)DNA量。PCR引物為融合Miseq測序平臺的V3～V4通用引物341F：CCCTACACGACGCTC-TTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGGCWG-CAG，805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACT ACHVGGGTATCTAATCC，反應(yīng)體系為2×Taq master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F(1 μmol/L) 1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，H2O 30 μL。擴(kuò)增體系為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，69 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，引入Illumina橋式PCR兼容引物，體系如上。每個樣品3個重復(fù)，將同一樣品PCR產(chǎn)物混合后進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測后純化回收。每個樣品DNA量取10 ng，按1∶1等量混合后測序。測序工作由生工生物工程(上海股份有限公司)完成，測序平臺為Illumina MiSeq測序系統(tǒng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 19.0對生長數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，運(yùn)用LSD法進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示顯著差異。菌群分析中，將樣本序列聚類，基于可操作分類單元在97%相似水平下進(jìn)行Alpha多樣性分析，計(jì)算香儂指數(shù)、辛普森指數(shù)、物種豐富度指數(shù)及覆蓋率。采用RDP classifier軟件對樣品菌群門、屬進(jìn)行分類，計(jì)算樣品群落結(jié)構(gòu)比例。除去未分類的，篩選相對豐度大于0.5%的優(yōu)勢菌屬，費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)菌屬豐度差異顯著性(P<0.05)。通過UniFrac加權(quán)距離矩陣分析樣品Beta多樣性，進(jìn)行進(jìn)化樹分析、熱度圖分析和主成分分析。

2 結(jié) 果

2.1 2種活菌飼料對生長性能的影響

投喂2種活菌飼料8周后金鯽幼魚生長情況見表1。由表1可見，攝食活菌飼料(B)的魚，質(zhì)量增加率顯著提高5.15%(P<0.05)；攝食活菌發(fā)酵飼料(C)的魚，質(zhì)量增加率顯著降低3.44%(P<0.05)。

表1 活菌飼料對金鯽生長的影響

注:表中同行肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

2.2 2種活菌飼料對菌群多樣性指數(shù)的影響

在97%水平上對所有樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析(表2)，與A組相比，試驗(yàn)組對應(yīng)樣品菌群物種豐度均出現(xiàn)不同程度下降，C組較明顯；B組飼料菌群多樣性變低，水體無明顯變化，腸道多樣性變高；C組3個樣品菌群多樣性均出現(xiàn)明顯降低。說明試驗(yàn)組樣品菌群物種豐度和多樣性出現(xiàn)不同變化，2種活菌飼料均對腸道及水體菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，C組飼料影響較大。

2.3 2種活菌飼料對菌群結(jié)構(gòu)組成的影響

2.3.1 飼料菌群結(jié)構(gòu)

飼料樣品中優(yōu)勢菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門(表3)，優(yōu)勢菌屬(相對豐度>0.5%，下同)17種(圖1)，主要為芽孢桿菌屬、立克次體屬(Rickettsia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)及乳球菌屬(Lactococcus)等。與A1相比，B1、C1中嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌大量繁殖，菌屬相對豐度顯著增加(P<0.05)，立克次體屬、不動桿菌屬及假單胞菌屬等相對豐度顯著降低(P<0.05)，菌群結(jié)構(gòu)明顯變化，3組飼料樣品菌群結(jié)構(gòu)差異顯著。

2.3.2 養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)

水體樣本中優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門和梭桿菌門(表3)，優(yōu)勢菌屬21種(圖2)，主要為多核桿菌屬(Polynucleobacter)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、假單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、不動桿菌屬及鯨桿菌屬(Cetobacterium)等。與A2相比，B2、C2中多核桿菌屬、微小桿菌屬等相對豐度明顯增加(P<0.05)，黃桿菌屬等相對豐度明顯降低(P<0.05)，其他菌屬相對豐度也出現(xiàn)不同變化，其中B2主要是物種豐度降低，如黃桿菌屬、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)等幾乎消失，多樣性無明顯變化；而C2中物種豐度和多樣性均明顯降低，菌群結(jié)構(gòu)得到簡化。

表2 金鯽幼魚腸道、飼料及水體樣品菌群多樣性指數(shù)

表3 金鯽幼魚腸道、飼料及水體優(yōu)勢細(xì)菌門類及相對豐度 %

2.3.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)

腸道樣品中優(yōu)勢菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、浮霉菌門及梭桿菌門(表3)，優(yōu)勢菌屬14種(圖3)，主要為氣單胞菌屬、微小桿菌屬、假單胞菌屬、檸檬酸桿菌屬、不動桿菌屬、鯨桿菌屬等。與CK相比，A3、B3及C3均發(fā)生不同變化，說明腸道菌群結(jié)構(gòu)因飼料和水體菌群的不同而發(fā)生改變。與A3相比，B3中氣單胞菌屬相對豐度明顯降低(P<0.05)，其他菌屬如微小桿菌屬、假單胞菌屬等相對豐度顯著增加(P<0.05)，菌群多樣性升高，物種豐度無明顯變化；C3中假單胞菌屬、不動桿菌屬等幾乎消失，氣單胞菌屬、微小桿菌屬及檸檬酸桿菌屬等優(yōu)勢地位得到加強(qiáng)，物種豐度和多樣性均明顯降低，菌群結(jié)構(gòu)趨于簡化。

2.4 菌群進(jìn)化關(guān)系分析

A組中CK與A3聚類，A1與A2聚類；B組中CK與B3聚類，B1與B2聚類；C組中C2與CK先聚類，之后依次與C1、C3聚類。A、B組中水體與飼料關(guān)系最近，C組中水體與初始腸道關(guān)系最近，與飼料及末期腸道關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

圖1 飼料樣品中屬水平細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及分布

圖2 水體樣品中屬水平細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及分布

圖3 金鯽幼魚腸道樣品中屬水平細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)及分布

圖4 各組樣品之間聚類圖

A2、B2、C2顏色偏紅，與其他樣品顏色差別明顯，進(jìn)化樹距離最短，說明不同組相同樣品中水體菌群之間相似性最高(圖5)。之后距離由近到遠(yuǎn)依次為A1、B1、C1(顏色偏黃)、CK、B3、A3、C3(顏色偏藍(lán))，說明與水體距離由近到遠(yuǎn)依次為飼料、腸道，但顏色顯示相似性均不高。圖中腸道與飼料距離較近，且顏色無明顯差別，說明腸道與飼料菌群間相似性較高。

同組不同樣品之間，腸道距離飼料較近，距離水樣較遠(yuǎn)，說明腸道與飼料菌群主成分相似性比水體高(圖6)。綜合上述菌群結(jié)構(gòu)與分布變化，B1、C1遠(yuǎn)離A1，不在同一聚集區(qū)域，說明與A1相比，B1主成分發(fā)生變化，主要為菌群多樣性降低，物種豐度無明顯變化；C1距離A1較遠(yuǎn)，說明C1主成分明顯變化，主要為菌群物種豐度和多樣性同時降低。同理，與A2相比，B2主要為菌群物種豐度降低，多樣性無明顯變化；C2主要為菌群物種豐度和多樣性共同降低。圖中CK、A3、B3及C3不同程度分散開來，與CK相比，其余腸道樣品主成分均發(fā)生變化。同理，與A3相比，B3主要為菌群多樣性增加，物種豐度無明顯變化；而C3偏離腸道樣品聚集區(qū)域，主要為菌群物種豐度和多樣性明顯降低。比較不同組相同樣品間距離長短，以物種豐度和多樣性為樣本菌群兩種變化水平，發(fā)現(xiàn)與A組相比，B組3個樣品均只發(fā)生單一水平明顯變化；而C組3個樣品均發(fā)生兩種水平明顯變化，說明同一微生態(tài)中飼料、水體及腸道三者菌群變化可能存在動態(tài)關(guān)聯(lián)。

圖5 金鯽幼魚腸道、飼料及水體間距離熱度顏色塊代表距離值，顏色越紅表示樣本間距離越近，越藍(lán)則表示距離越遠(yuǎn).

圖6 金鯽幼魚腸道、飼料及水體主成分分析

3 討 論

3.1 飼料菌群多樣性變化

芽孢桿菌和乳酸菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較廣泛的微生態(tài)制劑菌屬，其中應(yīng)用最多的有枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌，兩種菌促進(jìn)魚類生長的研究較多[12-13]，但將兩種菌一起復(fù)配的研究較少。本研究中試驗(yàn)組飼料菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，這與兩種菌的加入和對其他細(xì)菌的競爭抑制有直接關(guān)系，其中活菌發(fā)酵飼料菌群物種豐度和多樣性明顯降低，芽孢桿菌屬與乳桿菌屬占絕對優(yōu)勢地位，總量高達(dá)97.38%，這與飼料經(jīng)過厭氧發(fā)酵有關(guān)，一方面枯草芽孢桿菌與嗜酸乳桿菌協(xié)同性高，大量繁殖創(chuàng)造厭氧酸環(huán)境，抑制其他細(xì)菌生長；另一方面代謝產(chǎn)物如乳酸能抑制和殺死一些細(xì)菌。本試驗(yàn)中立克次體屬、不動桿菌屬及假單胞菌屬等相對豐度明顯變低，原因可能與此有關(guān)。立克次體屬是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的人畜共患病原菌屬[14]，假單胞菌屬中許多菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被證實(shí)和病原菌有關(guān)[15-16]，不動桿菌屬中多為病原菌[17]，其中鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)曾導(dǎo)致鱖魚(Sinipercachuatsi)爆發(fā)性死亡[18]；而嗜酸乳桿菌及枯草芽孢桿菌均為水產(chǎn)益生菌[19]。因此，益生菌處理一定程度上提高了飼料生態(tài)質(zhì)量。本試驗(yàn)中，活菌飼料促進(jìn)了魚體生長，而活菌發(fā)酵飼料卻產(chǎn)生抑制效果，有研究[20]顯示，發(fā)酵飼料添加量控制在一定范圍內(nèi)才會促進(jìn)水產(chǎn)動物生長，添加量較高時，大部分水產(chǎn)動物生長都會受到一定程度的抑制，原因可能是發(fā)酵組全部使用發(fā)酵飼料投喂，導(dǎo)致腸道菌群多樣性顯著降低。

3.2 養(yǎng)殖水體菌群多樣性變化

養(yǎng)殖末期，試驗(yàn)組水體中多核桿菌屬和微小桿菌屬等相對豐度明顯增加，黃桿菌屬等相對豐度明顯降低，其中黃桿菌屬是柱狀病、白頭白口病的病原體[21]。一方面可能與益生菌的抑菌作用有關(guān)，另一方面可能與益生菌對有機(jī)物的分解有關(guān)，增加了水體中無機(jī)氮磷含量，抑制了部分異養(yǎng)菌。與基礎(chǔ)組相比，活菌組水體菌群多樣性未發(fā)生明顯變化，主要是物種豐度減少，這與部分研究結(jié)果一致，直接施菌對水體菌群多樣性改變有限[22-23]；而發(fā)酵組水體菌群物種豐度和多樣性均明顯降低，這可能與飼料經(jīng)過發(fā)酵有關(guān)。目前施菌會明顯降低水體菌群多樣性的研究僅見于蛭弧菌(Bdellovibrio)[24]，蛭弧菌具有較寬的裂解譜，一方面能大量裂解病原菌，甚至能攻擊產(chǎn)生耐藥性的致病菌株[25]；另一方面，蛭弧菌能穿透生物膜對深藏在生物膜中的致病菌進(jìn)行攻擊，克服抗生素不能有效控制生物膜內(nèi)致病菌的缺點(diǎn)，高效控制病原菌的繁殖[26]，推測活菌發(fā)酵飼料可能具有類似于蛭弧菌的控菌作用，能同時對水體菌群物種豐度和多樣性產(chǎn)生影響。

3.3 腸道菌群多樣性變化

在魚類腸道菌群研究中，多數(shù)學(xué)者將腸道內(nèi)容物作為研究對象，對定殖在腸道黏膜層上的菌群研究較少。其實(shí)，腸道黏膜層與內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)之間有較大差異，腸道黏膜層上的菌群結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，應(yīng)作為腸道菌群研究的重點(diǎn)對象[27]。本研究對整個腸道菌群測序結(jié)果顯示，變形菌門和厚壁菌門在金鯽幼魚腸道中占絕對優(yōu)勢地位，為常駐菌門。研究顯示厚壁菌門在腸道中主要是對碳水化合物和蛋白質(zhì)的水解[28]，與魚類營養(yǎng)吸收關(guān)系密切，值得深入研究。本試驗(yàn)中金鯽幼魚腸道菌群結(jié)構(gòu)因飼料和水體菌群的不同而發(fā)生改變，但飼料與水體優(yōu)勢菌群、甚至兩種益生菌均未在腸道中大量出現(xiàn)，進(jìn)一步說明魚類腸道菌群的定殖是基于宿主的定向選擇，不是隨機(jī)遷入的。與基礎(chǔ)組相比，養(yǎng)殖末期活菌組魚腸道菌群中氣單胞菌屬相對豐度明顯降低，部分菌屬相對豐度變高，物種豐度無明顯變化，推測活菌飼料能促進(jìn)魚腸道菌群均勻度增加，提高多樣性，進(jìn)而促進(jìn)魚體生長。養(yǎng)殖末期發(fā)酵組腸道菌群中假單胞菌屬、不動桿菌屬等相對豐度明顯變低，優(yōu)勢菌屬變?yōu)闅鈫伟鷮佟ⅥL桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、微小桿菌屬等。有研究表明氣單胞菌屬是淡水魚類腸道有益菌[19]；鯨桿菌屬能夠發(fā)酵多肽、碳水化合物，還能產(chǎn)生維生素B12，對營養(yǎng)吸收有重要作用[29]；檸檬酸桿菌屬是一類纖維素降解菌屬[30]，而微小桿菌屬是一類重要的產(chǎn)蛋白酶菌屬[31]，推測活菌發(fā)酵飼料能增強(qiáng)部分腸道有益菌豐度優(yōu)勢，一定程度上簡化腸道菌群結(jié)構(gòu)。

3.4 飼料、水體及腸道菌群進(jìn)化分析

本研究發(fā)現(xiàn)水體菌群結(jié)構(gòu)受飼料和腸道菌群的一定影響，與飼料關(guān)系較近；而腸道菌群結(jié)構(gòu)明顯受飼料菌群的影響，關(guān)系密切，這與Moran等[32]結(jié)論相一致，認(rèn)為魚類腸道菌群結(jié)構(gòu)與宿主對食物的選擇密切相關(guān)。而Romero等[33]卻認(rèn)為水環(huán)境對魚類腸道菌群定殖起到關(guān)鍵作用，這可能與魚種、地域及環(huán)境因子的不同有關(guān)。本試驗(yàn)條件下水環(huán)境受外界因素干擾較少，且無底泥影響，養(yǎng)殖環(huán)境相對穩(wěn)定，金鯽幼魚腸道菌群與飼料關(guān)系密切，水體次之，同時飼料、水體及腸道三者菌群變化可能存在動態(tài)關(guān)聯(lián)，如試驗(yàn)組飼料菌群發(fā)生明顯變化，造成腸道和水體菌群發(fā)生相同水平明顯變化，相互調(diào)節(jié)達(dá)到整體動態(tài)平衡，這可能為微生態(tài)調(diào)控研究提供一定幫助。

利用嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌對基礎(chǔ)飼料進(jìn)行不同處理得到兩種活菌飼料，一定程度上提高了飼料生態(tài)質(zhì)量。其中活菌飼料對金鯽幼魚腸道及水體菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，提高了魚體生長性能；而活菌發(fā)酵飼料對金鯽幼魚腸道及水體菌群結(jié)構(gòu)影響較顯著，但抑制了魚體生長，這可能與發(fā)酵飼料的使用比例有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

[1] Yan Q Y, Li J J, Yu Y H, et al. Environmental filtering decreases with fish development for the assembly of gut microbiota[J]. Environmental Microbiology, 2016, 18(12):4739-4754.

[2] Spanggaard B, Huber I, Nielsen J, et al. The microflora of rainbow trout intestine: a comparison of traditional and molecular identification[J]. Aquaculture, 2000, 182(1/2):1-15.

[3] Zhang M, Liu N, Qian C, et al. Phylogenetic and functional analysis of gut microbiota of a fungus-growing higher termite:Bacteroidetesfrom higher termites are a rich source β-glucosidase genes[J]. Microbial Ecology, 2014, 68(2):416-425.

[4] Fujimura K E, Slusher N A, Cabana M D et al. Role of the gut microbiota in defining human health[J]. Expert Review of Anti-Infective Therapy, 2010, 8(4):435-454.

[5] 李艷宇, 任盟, 張叢堯, 等. 紅鰭東方鲀稚魚腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015, 34(10):652-656.

[6] Dimitroglou A, Merrifield D L, Carnevali O, et al. Microbial manipulations to improve fish health and production—a mediterranean perspective[J]. Fish & Shellfish Immune, 2011, 30(1):1-16.

[7] Gomez-Gil B, Roque A, Turnbull J F. The use and selection of probiotic bacteria for use in the culture of larval aquatic organisms[J]. Aquaculture, 2000, 191(1/3):259-270.

[8] 張雯, 鐘雷, 李南充, 等. 微生態(tài)制劑對池養(yǎng)建鯉體成分、血清指標(biāo)、消化酶活性以及腸道菌群組成的影響[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015, 34(12):769-777.

[9] Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, et al. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2000, 64(4):655-671.

[10] Niba A, Beal J, Kudi A, et al. Bacterial fermentation in the gastrointestinal tract of non-ruminants: influence of fermented feeds and fermentable carbohydrates[J]. Tropical Animal Health and Production, 2009, 41(7):1393-1407.

[11] 張俊, 朱建津, 劉江英, 等. 益生菌發(fā)酵產(chǎn)物對肉雞腸道形態(tài)和腸道屏障功能的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2016, 28(10):1657-1662.

[12] 程遠(yuǎn), 黃凱, 黃秀蕓, 等. 飼料中添加枯草芽孢桿菌對吉富羅非魚幼魚生長性能、免疫力和抗氧化功能的影響[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報, 2014, 26(6):1503-1512.

[13] 張羽. 乳酸桿菌對斑馬魚免疫力和繁殖性能的影響[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2013.

[14] Raoult D, Roux V. Rickettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases[J]. Clinical Microbiology Reviews, 1997, 10(4):694-719.

[15] Driscoll J A, Brody S L, Kollef M H. The epidemiology, pathogenesis and treatment ofPseudomonasaeruginosainfections[J]. Drugs, 2007, 67(3):351-368.

[16] Cai J, Lin S, Wu B. Characterization ofPseudomonasaeruginosaassociated with diseased postlarval abalone in Shenzhen, China[J]. Aquaculture International, 2009, 17(5):449-458.

[17] Bergogne B E, Towner K J.Acinetobacterspp.as nosocomical pathogens: microbiological, clinical, and enidemiological features[J]. Clinical Microbiology Reviews, 1996, 9(2):148-165.

[18] 湯雅殊, 陸承平. 動物源不動桿菌的藥敏試驗(yàn)[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1997, 20(3):120-123.

[19] Nayak S K. Role of gastrointestinal microbiota in fish[J]. Aquaculture Research, 2010, 41(11):1553-1573.

[20] Refstie S, Sahlstrom S, Brathen E et al. Lactic acid fermentation eliminates indigestible carbohydrates and antinutritional factors in soybean meal for Atlantic salmon (Salmosalary)[J]. Aquaculture, 2005, 246(1/4):331-345.

[21] 李存玉, 徐永江, 柳學(xué)周, 等. 池塘和工廠化養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)的比較分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2015, 39(2):245-255.

[22] Wu D X, Zhao S M, Peng N, et al. Effects of a probiotic (BacillussubtilisFY99-01)on the bacterial community structure and composition of shrimp (Litopenaeusvannamei, Boone) culture water assessed by denaturing gradient gel electrophoresis and high-throughput sequencing[J]. Aquaculture Research, 2016, 47(3):857-869.

[23] Tamminen M, Karkman A, Corander J, et al. Differences in bacterial community composition in Baltic Sea sediment in response to fish farming[J]. Aquaculture, 2011, 313(1):15-23.

[24] Li H, Chen C, Sun Q, et al.Bdellovibrioand like organisms enhanced growth and survival ofPenaeusmonodonand altered bacterial community structures in its rearing water[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(20):6346-6354.

[25] Dwidar M, Monnappa A K, Mitchell R J. The dual probiotic and antibiotic nature ofBdellovibriobacteriovorus[J]. Bmb Reports, 2012, 45(2):71-78.

[26] Kadouri D, O′Toole G A. Susceptibility of biofilms toBdellovibriobacteriovorusattack[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(7):4044-4051.

[27] 周志剛, 石鵬君, 姚斌, 等. 基于PCR-DGGE指紋圖譜川紋笛鯛及圓白鯧消化道壁優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)比較分析[J]. 水生生物學(xué)報, 2007, 31(5):682-688.

[28] Backhed F, Ley R E, Sonnenburg J L, et al. Host-bacterial mutualism in the human intestine[J]. Science, 2005, 307(5717):1915-1920.

[29] Tsuchiya C, Sakata T, Sugita H. Novel ecological niche ofCetobacteriumsomerae, an anaerobic bacterium in the intestinal tracts of freshwater fish[J]. Letters in Applied Microbiology, 2008, 46(1):43-48.

[30] Wu S, Wang G, Angert E R, et al. Composition, diversity, and origin of the bacterial community in grass carp intestine[J]. PloS One, 2012, 7(2):e30440.

[31] Kasana R C, Yadav S K. Isolation of a psychrotrophicExiguobacteriumsp. SKPB5 (MTCC7803) and characterization of its alkaline protease[J]. Current Microbiology, 2007, 54(3):224-229.

[32] Moran D, Turner S J, Clements K D. Ontogenetic development of the gastrointestinal microbiota in the marine herbivorous fishKyphosussydneyanu[J]. Microbial Ecology, 2005, 49(4):590-597.

[33] Romero J, Navarrete P. 16S rDNA-based analysis of dominant bacterial populations associated with early life stages of coho salmon (Oncorhynchuskisutch)[J]. Microbial Ecology, 2006, 51(4):422-430.