金 明，巴華杰，朱愛(ài)華，馬 駿，石津瑋，劉亞楠 ，林子清

（1.常州市公安局物證鑒定所，江蘇 常州 213003；2.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；3.中國(guó)刑警學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，遼寧 沈陽(yáng) 110035）

聯(lián)苯胺試驗(yàn)為案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)可疑血痕常用的預(yù)檢驗(yàn)方法之一[1-2]，因其靈敏度高、檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、結(jié)果判斷明確等優(yōu)點(diǎn)，已成為現(xiàn)場(chǎng)可疑血痕篩選的首選方法[3]。已有研究[4]顯示，聯(lián)苯胺試驗(yàn)對(duì)血痕中的DNA有顯著的破壞作用，聯(lián)苯胺試驗(yàn)后的血痕不能再進(jìn)行STR分型檢驗(yàn)。因此在實(shí)際操作中多用濾紙轉(zhuǎn)移部分可疑血痕進(jìn)行聯(lián)苯胺試驗(yàn)，以避免聯(lián)苯胺試驗(yàn)對(duì)血痕DNA的破壞。然而，實(shí)踐中常會(huì)遇到需要對(duì)聯(lián)苯胺試驗(yàn)顯現(xiàn)后的潛隱血指掌紋中的血痕繼續(xù)進(jìn)行STR分型檢驗(yàn)，此時(shí)就無(wú)法避免聯(lián)苯胺試驗(yàn)及相關(guān)試劑對(duì)血痕中DNA的破壞，從而影響后續(xù)的STR分型檢驗(yàn)。隨著近年來(lái)DNA提取方法的不斷改進(jìn)，DNA提取的效率和質(zhì)量不斷提升。同時(shí)，STR分型復(fù)合擴(kuò)增試劑盒的靈敏度和抗抑制能力也得到了不斷的改善?？梢?jiàn)，有必要對(duì)聯(lián)苯胺試驗(yàn)后的血痕能否進(jìn)行常規(guī)STR分型檢驗(yàn)進(jìn)行重新評(píng)估，這對(duì)于實(shí)際案件中聯(lián)苯胺試驗(yàn)后血痕（特別是聯(lián)苯胺試驗(yàn)顯現(xiàn)指掌紋后的血痕）的STR分型檢驗(yàn)具有重要的指導(dǎo)意義。本研究擬探討聯(lián)苯胺試驗(yàn)對(duì)DNA提取產(chǎn)生的影響，以發(fā)現(xiàn)對(duì)DNA提取影響較小的血痕預(yù)檢驗(yàn)方法和潛隱血指掌紋顯現(xiàn)方法，為實(shí)際案件中聯(lián)苯胺試驗(yàn)后的血痕DNA檢驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本

一名女性志愿者提供的外周靜脈血2mL，EDTA抗凝，于采集血樣后1h內(nèi)，分別吸取1μL滴于血樣采集卡（天津諾維萊博科技有限公司）上，室溫自然干燥12h，制成濾紙血痕970份，其中對(duì)照組10份，實(shí)驗(yàn)組960份。

1.2 聯(lián)苯胺試驗(yàn)

采用血痕預(yù)檢驗(yàn)試劑盒（北京布蘭特警用裝備有限公司）對(duì)血痕進(jìn)行聯(lián)苯胺試驗(yàn)。順序加入試劑盒內(nèi)的A（冰醋酸）、B（四甲基聯(lián)苯胺乙醇飽和溶液）、C（3%過(guò)氧化氫溶液）3種液體各10μL。

1.3 DNA提取

對(duì)照組10份濾紙血痕不進(jìn)行聯(lián)苯胺試驗(yàn)，直接采用Chelex-100 DNA提取純化試劑盒（天津諾維萊博科技有限公司）提取DNA。

將實(shí)驗(yàn)組960份濾紙血痕分成16組，每組60份。1～8組采用Chelex-100 DNA提取純化試劑盒提取DNA，即Chelex-100法；9～16組采用硅珠提取純化DNA試劑盒（天津諾維萊博科技有限公司）提取DNA，即硅珠法。兩種方法的8組樣本分為4個(gè)亞組，提取前的處理分別為聯(lián)苯胺試驗(yàn)（順序加A、B、C液）、只加A液、只加B液、只加C液。加完液體后又分為立即提取DNA和室溫通風(fēng)干燥1 h后再進(jìn)行DNA提取。

兩種商品化試劑盒的操作方法參照說(shuō)明書進(jìn)行，Chelex-100法加入 Chelex-100懸液量為 100 μL，硅珠法洗脫液用量為20μL。

1.4 復(fù)合擴(kuò)增及分型檢驗(yàn)

取模板 DNA 1μL，采用 AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)AB公司，含有15個(gè)STR基因座）進(jìn)行擴(kuò)增，體系為10 μL，在9700型PCR儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行擴(kuò)增，熱循環(huán)參數(shù)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，循環(huán)數(shù)為28次。以9947A和去離子水為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物用3500xl基因分析儀（美國(guó)AB公司）進(jìn)行檢測(cè)，采用GeneMapperTMID-X v1.3軟件分析數(shù)據(jù)。STR基因座檢出的標(biāo)準(zhǔn)為：基因座能正確分型，譜峰清晰，判型準(zhǔn)確，峰值大于150RFU，雜合子兩個(gè)峰高比例大于70%，無(wú)丟峰，無(wú)或少雜峰等干擾判型的因素[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。各組STR基因座檢出數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 STR基因座檢出數(shù)的比較

各組樣本的STR基因座檢出情況見(jiàn)表1。

對(duì)照組采用Chelex-100法提取DNA，獲得完整15個(gè)STR基因座分型結(jié)果。

聯(lián)苯胺試驗(yàn)和只加A液后立即采用Chelex-100法提取DNA，均未獲得STR分型結(jié)果，STR基因座檢出數(shù)低于其余14組（P〈0.05）；聯(lián)苯胺試驗(yàn)干燥后行Chelex-100 法提取 DNA，獲得（4.70±1.96）個(gè) STR 基因座，STR基因座檢出數(shù)高于聯(lián)苯胺試驗(yàn)后立即行硅珠法提取 DNA［（3.80±1.34）個(gè) STR 基因座，P〈0.05］，但低于聯(lián)苯胺試驗(yàn)干燥后行硅珠法提取DNA［（12.90±1.49）個(gè)STR基因座，P〈0.05］和加A液后立即行硅珠法提取DNA［（9.40±2.09）個(gè) STR 基因座，P〈0.05］；聯(lián)苯胺試驗(yàn)干燥后行硅珠法提取DNA有13例（21.7%）獲得完整15個(gè)STR基因座分型結(jié)果，且其STR基因座檢出數(shù)均高于其余獲得部分STR基因座的實(shí)驗(yàn)組（2、9、11 組，P〈0.05），但均低于獲得完整 15 個(gè) STR 基因座分型結(jié)果的實(shí)驗(yàn)組（4～8、12～16 組，P〈0.05）。

2.2 案例應(yīng)用

某年2月26日21：23，在某村一出租屋內(nèi)發(fā)生一起兩人被殺死一人被捅傷的惡性案件。嫌疑人在作案后從臥室窗戶逃走時(shí)，在窗沿上留下了一枚潛血指紋。經(jīng)聯(lián)苯胺試驗(yàn)顯現(xiàn)，提取到了一枚具有比對(duì)條件的殘缺指紋，并在指紋庫(kù)中比中了龔某，成功鎖定了嫌疑人。為了增加案件證據(jù)的強(qiáng)度，對(duì)血指紋上的血跡進(jìn)行了提取，采用硅珠法提取潛隱血的DNA，成功獲得了單一女性的DNA分型結(jié)果，并與女死者的DNA分型結(jié)果一致，為案件的起訴提供了強(qiáng)有力的證據(jù)支撐。

表1 各組樣本的STR基因座檢出情況 （n=60）

3 討 論

聯(lián)苯胺試驗(yàn)除用于血痕預(yù)檢驗(yàn)外，還常用于現(xiàn)場(chǎng)潛隱血指掌紋的顯現(xiàn)。但聯(lián)苯胺試驗(yàn)對(duì)血痕DNA具有較大的破壞作用[4]，在進(jìn)行潛隱血指掌紋檢驗(yàn)時(shí)，較難決定采用聯(lián)苯胺試驗(yàn)顯現(xiàn)潛隱血指掌紋和直接提取潛隱血指掌紋上血痕的先后順序。如果先行聯(lián)苯胺試驗(yàn)顯現(xiàn)指掌紋有可能會(huì)影響血痕的后續(xù)STR分型檢驗(yàn)，如果先行指掌紋上血痕的提取，必然會(huì)損壞指掌紋的顯現(xiàn)。因此，進(jìn)一步評(píng)估聯(lián)苯胺試驗(yàn)及相關(guān)試劑對(duì)現(xiàn)有DNA提取方法和STR分型檢驗(yàn)的影響程度具有重要的意義。

本研究比較了聯(lián)苯胺試驗(yàn)及相關(guān)試劑對(duì)不同DNA提取方法的提取效率及STR分型檢驗(yàn)的影響。研究結(jié)果顯示：聯(lián)苯胺試驗(yàn)后立即進(jìn)行檢驗(yàn)，硅珠法的STR基因座檢出數(shù)高于Chelex-100法，但均未獲得有效的DNA分型結(jié)果。進(jìn)行干燥處理后再行檢驗(yàn)，兩種方法的STR基因座檢出數(shù)均有大幅度提升，特別是硅珠法有21.7%的樣本獲得了完整15個(gè)STR基因座分型結(jié)果，其余的最少也獲得了10個(gè)STR基因座分型結(jié)果，已經(jīng)能夠滿足現(xiàn)有DNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)及個(gè)體識(shí)別的需要。這表明聯(lián)苯胺試驗(yàn)中的試劑不僅會(huì)損傷血痕中的DNA片段，其中的易揮發(fā)試劑還會(huì)對(duì)DNA提取效率產(chǎn)生較大的影響。進(jìn)一步比較聯(lián)苯胺試驗(yàn)中3種試劑單獨(dú)對(duì)STR分型檢驗(yàn)的影響，結(jié)果顯示：?jiǎn)为?dú)加入A液后立即檢驗(yàn)會(huì)對(duì)后續(xù)的STR分型檢驗(yàn)產(chǎn)生顯著影響，但加入A液后干燥處理及單獨(dú)加入B、C液對(duì)后續(xù)的DNA檢驗(yàn)均無(wú)顯著影響。表明A液對(duì)DNA提取效率會(huì)產(chǎn)生主要的影響，其原因可能為：A液（冰醋酸）呈弱酸性，順序加入A、B、C液或A液后會(huì)使DNA提取體系呈酸性，在酸性環(huán)境中，Chelex-100樹(shù)脂鰲合金屬離子的能力降低或喪失，不能有效防止核酸酶對(duì)DNA的降解作用，酸性環(huán)境也會(huì)大幅減弱硅珠對(duì)DNA片段的吸附能力，從而降低DNA的提取效率。單獨(dú)加入A液后室溫通風(fēng)干燥1h再進(jìn)行檢驗(yàn)，兩種方法均能獲得完整15個(gè)STR基因座分型結(jié)果，表明冰醋酸已揮發(fā)完全，不再對(duì)DNA提取體系產(chǎn)生影響，DNA的提取效率也得到了恢復(fù)。

本研究結(jié)果還表明：?jiǎn)为?dú)加入B、C液不會(huì)對(duì)血痕DNA片段產(chǎn)生顯著損傷，也不會(huì)對(duì)DNA提取及后續(xù)STR分型檢驗(yàn)產(chǎn)生顯著的影響，但順序加入A、B、C液干燥處理后進(jìn)行檢驗(yàn)，硅珠法的STR基因座檢出數(shù)遠(yuǎn)低于對(duì)照組，Chelex-100法的檢驗(yàn)結(jié)果更是無(wú)法應(yīng)用于實(shí)際。可見(jiàn)，聯(lián)苯胺試驗(yàn)3種試劑與血痕反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)可能對(duì)血痕中DNA產(chǎn)生了較大程度的損傷或?qū)NA提取效率產(chǎn)生了影響，在冰醋酸揮發(fā)完全后，依舊對(duì)后續(xù)DNA檢驗(yàn)造成較大的影響。聯(lián)苯胺試驗(yàn)的原理為血紅蛋白或血紅素的過(guò)氧化酶活性使過(guò)氧化氫釋放出新生態(tài)的氧，使無(wú)色的四甲基聯(lián)苯胺氧化成四甲基聯(lián)苯胺藍(lán)。因此，推測(cè)是生成的四甲基聯(lián)苯胺藍(lán)對(duì)血痕中的DNA造成了損傷或者影響了DNA的提取效率，該原理有待進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。

朱傳紅等[4]曾對(duì)血痕聯(lián)苯胺試驗(yàn)后DNA含量的變化及對(duì)STR分型檢驗(yàn)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果顯示聯(lián)苯胺試驗(yàn)對(duì)后續(xù)STR分型影響較大，認(rèn)為血痕聯(lián)苯胺試驗(yàn)后不能再進(jìn)行STR分型檢驗(yàn)，本研究結(jié)論與其并不一致。原因可能為：（1）其研究中未采用硅珠法提取DNA，不同的DNA提取方法導(dǎo)致DNA提取效率存在差異；（2）兩研究中聯(lián)苯胺試驗(yàn)后放置的時(shí)間不同（本研究進(jìn)行聯(lián)苯胺試驗(yàn)后室溫通風(fēng)放置1h再進(jìn)行DNA提取，其研究采用室溫放置30min～24h在不同時(shí)間段進(jìn)行DNA提?。?，可能導(dǎo)致后續(xù)的DNA提取及統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)存在差異；（3）其研究中樣本例數(shù)偏少（每組僅6例），且未考慮聯(lián)苯胺試驗(yàn)中每種試劑對(duì)DNA提取效率的影響。但朱傳紅等[4]的研究也發(fā)現(xiàn)，不同的DNA提取方法對(duì)聯(lián)苯胺試驗(yàn)處理的血痕進(jìn)行DNA提取后的DNA含量有著顯著的影響，本研究結(jié)論與其一致。因此，筆者認(rèn)為血痕聯(lián)苯胺試驗(yàn)后進(jìn)行干燥處理，并采用硅珠法提取DNA，完全可以滿足實(shí)際案件的需要。

綜上所述，聯(lián)苯胺試驗(yàn)對(duì)血痕的后續(xù)DNA檢驗(yàn)有較大的影響，Chelex-100法不適合聯(lián)苯胺試驗(yàn)后血痕的DNA檢驗(yàn)，聯(lián)苯胺試驗(yàn)后干燥處理及采用硅珠純化的方法可有效提升聯(lián)苯胺試驗(yàn)后血痕的STR基因座檢出數(shù)，以達(dá)到實(shí)際案件的需要。本研究?jī)H比對(duì)了聯(lián)苯胺試驗(yàn)及相關(guān)試劑短期（立即檢驗(yàn)和室溫干燥1 h）對(duì)血痕DNA檢驗(yàn)的影響，后續(xù)將在本研究的基礎(chǔ)上，在更多的時(shí)間點(diǎn)對(duì)聯(lián)苯胺試驗(yàn)及相關(guān)試劑對(duì)血痕DNA檢驗(yàn)的影響進(jìn)行研究，并對(duì)聯(lián)苯胺試驗(yàn)影響血痕DNA檢驗(yàn)的原理進(jìn)行深入的探討。

[1]羅凱，李明謙，曾途.隱性血痕在命案現(xiàn)場(chǎng)中的運(yùn)用[J].廣西警官高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2007（S1）：61-63.

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[5]巴華杰，林子清，劉亞楠，等.5種免提取試劑盒檢驗(yàn)濾紙血痕結(jié)果的比較[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2013，28（1）：49-51.