王 婷,樊俊苗,張浩宇,樊瑋鑫,杜 方*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學 實驗教學中心，山西 太谷 030801)

自古以來，花香就吸引了人們的注意并且滲入到了生活的很多方面，被廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)療等眾多領域。近年來，有關學者分別對玫瑰[1]、桂花[2]、菊花[3]、蘭花[4-5]、梅花[6]和百合[7]等植物的花香進行了研究。百合是世界上知名的切花花卉，品種豐富、香型多樣，有墨香、濃香、淡香和無香4種香型[8]，是開展花香研究的優(yōu)良材料。

國內(nèi)外已經(jīng)初步開展了百合花香的研究工作?，F(xiàn)已探明百合花瓣是主要的釋香部位[9-10]，其香氣成分隨著百合花的開放程度以及晝夜節(jié)律發(fā)生規(guī)律性的變化[10-12]，單萜類化合物是有香百合花香揮發(fā)物的主要成分，其中月桂烯、羅勒烯和芳樟醇含量較高[11,13]。與有香百合相比，無香百合中單萜類化合物的釋放量很低或檢測不到[10,13]。

單萜類化合物主要通過4-磷酸-2-甲基赤蘚糖途徑合成，單萜合酶是該生物合成途徑最后一步的關鍵酶[14-16]，單萜合酶基因的表達水平是影響單萜化合物含量的主要因素[17-18]?，F(xiàn)今，已從仙女扇[19]、擬南芥[20]、姜花[21]、六出花[22]等中克隆得到羅勒烯、芳樟醇、香葉醇等多個單萜類合酶基因，發(fā)現(xiàn)這些單萜合酶基因表達與萜烯產(chǎn)物合成有直接關系。目前，已從岷江百合、西伯利亞、羅馬廣場和Belladonna花瓣中克隆到LreTPS、Li-mTPS2、LiLiS、LiMyS和LhTPS等單萜合酶基因[9,23-25]。同時，對單萜合酶基因的表達規(guī)律研究表明，百合單萜合酶基因在花被片中表達量最高，在葉片中也有一定表達，在雄蕊和柱頭中微量表達[24]。東方百合西伯利亞芳樟醇合酶基因和月桂烯合酶基因的表達量高于亞洲百合羅馬廣場，且這2種單萜合成酶基因的表達規(guī)律隨花朵的開放程度表現(xiàn)出先增加后減少的規(guī)律[23]。

雖然百合花香研究已取得了一些進展，但對百合單萜合酶基因的研究僅局限于少數(shù)種和品種中，且對于花香揮發(fā)性成分的分析和基因的研究是獨立進行的，尚不清楚主要致香成分與相關基因的關聯(lián)性。為此，選取了4種香型百合共13個品種的花瓣作為試驗材料，檢測每個品種在花朵發(fā)育的4個時期單萜揮發(fā)物的種類和含量；并從中選取不同雜種系的6種材料，研究LhTPS基因在品種間和花朵發(fā)育時期中的表達水平，以確定單萜合酶基因與單萜類揮發(fā)物釋放的關聯(lián)性，為進一步開展百合花香育種研究提供指導。

1 材料和方法

1.1 材料

材料選自山西農(nóng)業(yè)大學園藝站露地種植的百合共計13種，包括2種東喇百合(Orienpet hybrids)：羅賓娜(墨香)、木門(墨香)；2種喇叭百合(Trumpet hybrids)：完美(墨香)、橙星(濃香)；4種東方百合(Oriental hybrids)：新娘(濃香)、蒙娜麗莎(濃香)、索邦(濃香)、西伯利亞(濃香)；2種麝亞百合(Longiflorum×Asiatic hybrids)：亮鉆(淡香)、金石(淡香)；1種新鐵炮百合(Liliumformolongi‘Julius’)：朱麗葉(淡香)；2種亞洲百合(Asiatic hybrids)：塞西爾(淡香)、小重瓣(無香)。根據(jù)花被片張開程度將百合花發(fā)育階段分為4個時期：顯色期(花被片已充分顯色但未張開)、初開期(花被片略張開，花藥未散粉)、盛開期(花被片完全張開，花藥已散粉)、衰敗期(花被片開始萎蔫，花藥停止散粉)。在17：00—19：00時間段采集13個品種、4個時期健康植株的花被片，每朵花取一半用于揮發(fā)性成分測定，另一半用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱以備RNA提取。

1.2 頂空固相微萃取

稱取百合花瓣約1.5 g，置于15 mL固相微萃取專用頂空瓶中，用已老化好的萃取頭(Supelco公司，50/30 μm PDMS/DVB/CAR)50 ℃頂空萃取15 min。自動進樣，在進樣口解析5 min。

1.3 GC-MS分析

利用山西農(nóng)業(yè)大學實驗教學中心共享平臺的GC-MS分析儀進行分析。

GC(Trace ISQ型號，Thermo公司)工作條件：色譜柱規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm(柱長×柱內(nèi)徑×柱膜厚)，公司為Thermo，型號為DB-5MS。載氣為He，流速為1 mL/min。程序升溫過程：起始溫度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min的速度升至270 ℃，保持6 min。

MS(Trace ISQ型號，Thermo公司)工作條件：電離方式為El；電離電壓為70 eV；質(zhì)譜掃描范圍：45～600 amu；離子源溫度為280 ℃；接口溫度為280 ℃。

采用Xcalibur軟件系統(tǒng)，使用NIST譜庫檢索定性。各化合物成分絕對含量用峰面積表示。

1.4 總RNA提取與反轉錄

選擇木門、橙星、索邦、亮鉆、朱麗葉、小重瓣6個品種提取花瓣總RNA。RNA的提取根據(jù)GenStar公司的TRIGene 總RNA提取試劑盒說明書進行，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，用NanoDrop 2000C光度計檢測RNA濃度和純度，質(zhì)量合格的RNA保存于-80 ℃超低溫冰箱。

按照GenStar公司的StarScript Ⅱ cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書反轉錄cDNA，將得到的cDNA溶液稀釋至100 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.5 引物的設計

以GenBank中LhTPS基因( KR998333 )序列為模板，采用primer 3(http://primer3.ut.ee/)在線設計引物(正向引物：5’-AGACTCGCAAGGGTTCAAGG-3’；反向引物：5’-CGTACAAGCTCAGCAGTCCT-3’)，交由生工生物工程有限公司合成。

1.6 實時熒光定量PCR

以GAPDH為內(nèi)參基因(正向引物：5’-TGATAAGTTTGGGATTGTCGAGGG-3’；反向引物：5’-TTTCTGAGTAGCAGTGATGGCGTG-3’)，利用TaKaRa公司 qRT-PCR試劑盒配置20 μL反應體系，包括 SYBR Ⅱ 10 μL、雙蒸水7 μL、cDNA 1 μL、Primer 1.6 μL、ROX 0.4 μL；在7500 Real Time PCR System運行qRT-PCR試驗，每個樣本重復3次。反應程序如下：95 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(熒光)，共40個循環(huán)；溶解曲線條件為95 ℃ 15 s，54 ℃ 1 min，從54 ℃每30 s上升0.4直到95 ℃，95 ℃ 30 s(熒光)，54 ℃ 15 s。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用HemI 1.0軟件以單萜化合物檢測得到的峰面積繪制百合單萜類化合物含量熱圖，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，采用SAS和LSD法進行統(tǒng)計分析及多重比較，利用Origin 6.0軟件繪制斷層圖并進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 百合單萜類物質(zhì)的釋放規(guī)律

13種百合4個時期單萜類物質(zhì)的組成和釋放規(guī)律如圖1所示。每種百合檢測到的單萜化合物種類各不相同，在這13種百合4個時期中，共鑒定出34種單萜化合物，含量大于1%的如圖1所示，共18種。萜烯化合物中含量較高的是羅勒烯、芳樟醇和1,8-桉葉素。除無香型小重瓣無羅勒烯釋放外，其他百合花香揮發(fā)物中均含有較多羅勒烯，平均含量為56.2%，芳樟醇次之，含量為18.7%。值得關注的是，東喇百合和喇叭百合的釋放物中，1,8-桉葉素的含量最高，占單萜總釋放量的93.93%，超過了羅勒烯的含量，推測這是形成這些百合特殊麝香氣味的重要化合物。無香百合小重瓣僅在初開期檢測到芳樟醇一種單萜類化合物。由此推測，可以根據(jù)單萜化合物的成分對百合的香型進行分類。

在有香百合中，單萜類物質(zhì)的釋放與花的發(fā)育時期之間均表現(xiàn)出一定的相關性。同一個品種4個時期的百合所檢測到的單萜化合物種類相近，含量不同。羅賓娜、完美、金石、朱麗葉4個品種在初開期單萜化合物種類和含量達到最高，隨著發(fā)育進程，在盛開期和衰敗期依次減少；其余的8個有香百合品種隨發(fā)育進程釋放的單萜化合物種類和含量依次增加，在盛開期達到最高值，隨后釋放量減少。可以看出，即便是同一個雜種系，不同品種的百合在發(fā)育過程中單萜類物質(zhì)的成分及含量的變化規(guī)律也可能不同，但整體上單萜類化合物的成分和含量保持著先增加后減少的變化規(guī)律。

1表示顯色期，2表示初開期，3表示盛開期，4表示衰敗期；藍色表示低水平含量，綠色表示中等水平含量，紅色表示高水平含量。其他表示相對含量小于1% 的單萜類化合物

2.2 LhTPS基因在花瓣4個發(fā)育時期不同品種中的表達特征

在顯色期和盛開期，LhTPS基因在墨香型百合木門和濃香型百合橙星、索邦中的表達量皆顯著高于清香型百合亮鉆、朱麗葉和無香型百合小重瓣中LhTPS基因的表達量(圖2)。在初開期，LhTPS基因在墨香型百合木門和濃香型百合橙星中的表達量顯著高于其他4種百合中LhTPS基因的表達量。在衰敗期，墨香型百合木門中LhTPS基因的表達量顯著高于在其他5種百合中的表達量。

同一時期不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

LhTPS基因在木門和橙星中，初開期和盛開期的表達量都顯著高于顯色期和衰敗期，其中，在木門的盛開期比初開期顯著高表達，在橙星初開期和盛開期的表達差異不顯著；在小重瓣的初開期中比其他3個時期顯著高表達；在索邦、亮鉆和朱麗葉中沒有明顯的表達規(guī)律(圖3)。

同一品種不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)

2.3 LhTPS基因的表達水平與單萜化合物含量的相關性分析

使用Origin 6.0對5種有香百合中對LhTPS基因的相對表達量與各單萜類物質(zhì)依次進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，在盛開期時，LhTPS基因表達水平與羅勒烯和芳樟醇2種化合物的含量顯著相關，相關系數(shù)分別為0.968和0.934，其中LhTPS基因表達水平與羅勒烯的含量極顯著相關(圖4)。由此可見，LhTPS基因的表達對于羅勒烯和芳樟醇2種化合物的合成具有重要的作用。

圖4 LhTPS基因的表達水平與羅勒烯和芳樟醇含量的相關性

3 結論與討論

通過研究13種百合4個時期單萜類物質(zhì)的組成和含量發(fā)現(xiàn)，有香百合釋放的單萜類化合物種類和含量都較無香百合釋放的多，此結果與Kong等[7,10]、張輝秀等[13]、Hu等[26]從不同香型百合揮發(fā)物的成分所檢測出的結果相一致。此外，各個品種隨其發(fā)育進程也表現(xiàn)出了一定的規(guī)律：單萜化合物的種類和含量隨發(fā)育進程先增大后減小，在初開期或盛開期達到了最高值，這不僅與白天堂百合[11]和西伯利亞百合[12]隨發(fā)育時期表現(xiàn)出的規(guī)律相一致，在其他植物如水仙[27]和紫藤[28]的不同開花期也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律。同時，與張輝秀等[13]、Kong等[10]報道結果一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)在東方百合、麝香百合、新鐵炮百合和有香的亞洲百合中，羅勒烯是百合的關鍵致香成分，個別東方百合除羅勒烯外也含有大量的芳樟醇，而東喇百合和喇叭百合則釋放出較多的1,8-桉葉素。不同的揮發(fā)性化合物的含量和種類使得百合成為香味富有變化的芳香植物，提供了百合作為模式花香植物研究的可能性。

不同百合品種其LhTPS基因表達量不同。從整體上來說，墨香型和濃香型百合的LhTPS基因表達水平高于淡香型和無香型百合。唐彪等[23]從濃香型的西伯利亞和淡香型的羅馬廣場百合花瓣中克隆得到芳樟醇合酶基因Li-LiS和月桂烯合酶基因Li-MyS，發(fā)現(xiàn)在花蕾、半開、盛開、衰敗4個花期中，西伯利亞花瓣2個單萜合成酶基因表達水平均高于羅馬廣場，這與本研究在顯色期、初開期、盛開期的研究結果相一致。但在本試驗中，發(fā)現(xiàn)在衰敗期時，除墨香型百合木門中LhTPS基因的表達量顯著高于在其他5種百合中的表達量外，其余香型百合中LhTPS基因的表達量并沒有顯著差異，這可能與本試驗所采用的百合品種有關，有待繼續(xù)進行試驗檢測結果。

木門、橙星和小重瓣的單萜合酶基因表達水平隨發(fā)育進程表現(xiàn)出先增加后減少的規(guī)律，這與唐彪等[23]發(fā)現(xiàn)的芳樟醇合酶基因和月桂烯合酶基因這2種單萜合成酶基因的表達規(guī)律隨花朵的開放程度表現(xiàn)出先增加后減少的規(guī)律相一致。但是，奇怪的是，索邦、亮鉆和朱麗葉的單萜合酶基因表達水平?jīng)]有明顯的變化規(guī)律，可能與其參與調(diào)控的關鍵酶和底物供應水平有關。

LhTPS基因的表達水平與單萜化合物含量的相關性分析表明，在盛開期時，LhTPS基因與羅勒烯的合成極顯著相關，與芳樟醇的合成顯著相關。羅勒烯在所有有香百合中均被檢測到，芳樟醇是個別東方百合花香化合物中主要的致香成分，因此，LhTPS基因在研究百合花香分子育種等方面具有很大的研究價值，需要繼續(xù)進行基因功能驗證?；ㄏ愦x調(diào)控復雜，因此需要繼續(xù)同時結合代謝路徑關聯(lián)性以及調(diào)控分析探索百合花香調(diào)控的機制。

單萜類物質(zhì)含量的高低，被認為是百合香味差異的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著百合花朵的開放，其香氣成分中單萜類物質(zhì)的含量表現(xiàn)出先增加后減少的規(guī)律，有香百合的主要單萜類成分為羅勒烯和芳樟醇，但喇叭百合和東喇百合中的單萜類成分主要是1,8-桉葉素和羅勒烯。喇叭百合、東喇百合和東方百合的LhTPS基因表達水平高于麝香百合和亞洲百合。盛開期時，LhTPS基因的表達水平與羅勒烯和芳樟醇2種化合物的合成具有顯著關聯(lián)性，因此LhTPS基因在研究百合花香分子育種等方面具有很大的研究價值，本研究為百合花香育種研究奠定了基礎。

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