周 瑚,任佐華,劉品克,張譯允,王恒滬,劉二明*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128;2. 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128;3. 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

【研究意義】稻瘟病是由稻瘟病菌(有性世代Magnaportheoryzae，無(wú)性世代Pyriculariaoryzae)引起的一種世界性重要水稻真菌性病害[1]，能侵染水稻組織的各個(gè)生育期，并可以寄生在小麥、大麥和粟等多種禾本科作物及雜草上[2-3]。目前，稻瘟病的防治以選育及推廣利用抗病品種為核心，以健康、合理搭配栽培等農(nóng)業(yè)措施為基礎(chǔ)，適當(dāng)利用化學(xué)農(nóng)藥防治為輔助的綜合策略[4]；但稻瘟病菌非常復(fù)雜易變，而且水稻品種在推廣種植3～5年后抗性表現(xiàn)易“喪失”?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)80年代末以來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以DNA多態(tài)性分析為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于稻瘟病菌的群體分析，DNA多態(tài)性指的是生物之間在DNA水平上的差異，它為植物病原真菌的種類鑒定提供了大量的遺傳標(biāo)記[5]。利用RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，Restriction Fragment Length Polymorphism)、RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，Random Amplified Polymorphic DNA)、AFLP(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，Amplified Fragment Length Polymorphism)、SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)、ISSR(inter-simple sequence repeat)和SSR(簡(jiǎn)單重復(fù)序列，Simple Sequence Repeat，SSR)等技術(shù)對(duì)稻瘟病菌進(jìn)行分析，研究其遺傳規(guī)律?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】SSR分子標(biāo)記技術(shù)因具有易檢測(cè)、多態(tài)性高、可重復(fù)性高、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[6]，因而成為分析稻瘟病菌遺傳多樣性的主要方法。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為解決水稻品種在推廣種植抗性表現(xiàn)易“喪失”、呈“感病化”的問(wèn)題，本研究利用SSR技術(shù)對(duì)2015年分離于湖南桃江病圃的92個(gè)稻瘟病菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，為湖南省水稻抗瘟性監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2015年6-7月在湖南省益陽(yáng)市桃江縣稻瘟病圃(N28°22′, E112°03′)內(nèi)采集普感稻瘟病品種“LTH”的葉瘟病樣，參照并改良張建書(shū)等[7]的挑取單孢方法，從病標(biāo)上共分離保存92個(gè)稻瘟病單孢菌株。

1.2 供試引物

由上海生工公司合成的14對(duì)SSR引物(表1)，分別為KMS02、KMS20、SMS17、A5、D4、D5、G5、FG01、FG02、FG03、MS355、MS363、MS677[8]、PYRM419[9]。

1.3 主要儀器

恒溫光照培養(yǎng)箱(GZX-250BS-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、顯微鏡(北京普瑞賽司儀器有限公司)、恒溫?fù)u床(Crystal)、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、震蕩渦旋儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)、恒溫水浴鍋(HH-6，上海浦東物理光學(xué)儀器廠)、微量分光光度計(jì)(BIOSPEC-NANO)、PCR擴(kuò)增儀(聯(lián)想生物科技有限公司)、水平電泳儀(北京六一儀器廠)、紫外凝膠成像系統(tǒng)儀(BIO-PRO 200E)。

1.4 主要試劑及培養(yǎng)基

DNA提取試劑盒(EasyPure Genomi DNA Kit)，2K DNA Marker，SYBR Green I染料，6×DNA Loading Buffer，山梨醇Buffer，(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限責(zé)任公司，北京)；TBE緩沖液；可溶性淀粉培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基[10]。

1.5 稻瘟病菌絲的培養(yǎng)

將用高粱粒保存的稻瘟病菌接種到可溶性淀粉平板培養(yǎng)基中，26 ℃，光暗交替(L/D=12h/12h)培養(yǎng)5 d左右，從最外緣刮去帶少量培養(yǎng)基的菌絲接種到盛有40 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)3～5 d。

1.6 DNA提取及濃度純度測(cè)定

用試劑盒法(北京)提取稻瘟病菌基因組DNA。將提取的DNA使用Nano Drop的Spectrophotometer檢測(cè)樣品DNA的OD260、OD280的值，通過(guò)OD260/OD280檢測(cè)DNA濃度(純DNA：OD260/OD280≈1.8，>1.9，表明有RNA污染；<1.6表明有蛋白質(zhì)、酚等污染)，并調(diào)整DNA純度為150 ng/μl。

表1 供試引物

1.7 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表2。PCR擴(kuò)增程序見(jiàn)表3。

1.8 瓊脂糖凝膠電泳

利用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。第1孔加入由3 μl Green I染料和7 μl Marker制成的混合液8 μl；第2孔加由3 μl染料、2 μl Loading Buffer和5 μl ddH2O制成的混合液8 μl；第3～25孔加入由3 μl 染料、2 μl Loading Buffer及5 μl PCR產(chǎn)物混合而成的上樣液8 μl。在110 V電壓強(qiáng)度下，35 min，條帶跑至膠的1/2～2/3處即可。電泳完成后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照記錄。

1.9 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)SSR引物擴(kuò)增電泳結(jié)果，將電泳圖片轉(zhuǎn)換為2進(jìn)制的數(shù)據(jù)(有條帶記的為1，無(wú)條帶的記為0)，應(yīng)用軟件DPS 7.05 Nei & Li最長(zhǎng)距離法處理數(shù)據(jù)得到聚類分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物對(duì)供試菌株的PCR擴(kuò)增

92個(gè)供試菌株能與14對(duì)用于分析的SSR引物特異性結(jié)合并有效擴(kuò)增，所得重復(fù)序列因引物不同而不同，電泳檢測(cè)后能較清晰表現(xiàn)出擴(kuò)增的多態(tài)性。KMS02、KMS20、SMS17、A5、D4、D5、G5、FG01、FG02、FG03、MS355、MS363、MS677、PYRM419分別對(duì)55、46、47、44、42、44、49、78、77、70、59、64、59、63個(gè)菌株擴(kuò)增出特異性亮帶，Marker條帶重復(fù)性良好，CK無(wú)條帶出現(xiàn)(圖1)。

表2 PCR擴(kuò)增體系

2.2 病圃稻瘟病菌群體遺傳譜系

利用14對(duì)SSR引物對(duì)92個(gè)稻瘟病菌單孢菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果轉(zhuǎn)換為0-1數(shù)據(jù)，通過(guò)數(shù)據(jù)分析軟件DPS 7.05進(jìn)行聚類分析，結(jié)果(圖1，表4)表明，在相似系數(shù)0.19，即差異系數(shù)0.81的水平，92個(gè)供試的稻瘟病菌單孢菌株被劃分在同一個(gè)宗譜內(nèi)；在相似系數(shù)0.70，即差異系數(shù)0.30的水平，供試的92個(gè)菌株被劃分為26個(gè)宗譜，統(tǒng)計(jì)各宗譜內(nèi)的菌株數(shù)可知XIX宗譜為優(yōu)勢(shì)宗譜，含有17個(gè)菌株，占總菌株數(shù)的18.48 %；IV宗譜中含有10個(gè)菌株，占總菌株數(shù)的10.87 %；XVIII宗譜中含有9個(gè)菌株，占總菌株數(shù)的9.78 %；其他23個(gè)宗譜內(nèi)各含1～5個(gè)菌株，共占總菌株數(shù)的60.87 %。從聚類分析圖譜看來(lái)，從湖南桃江病圃分離的稻瘟病菌遺傳差異較大，遺傳結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，個(gè)別菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表3 PCR反應(yīng)程序

M：已知分子量的DNA混合物；CK：ddH2O；1～23:供試菌株M: DNA Markerr; CK: ddH2O; 1-23:Tested strains圖1 引物FG03對(duì)部分菌株的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of some texted strains for primer FG03

宗譜Lineage菌株號(hào)Isolate菌株數(shù)Sum比例( %)PercentageI1,1422.17II17,6022.17III2011.09IV2,29,44,50,22,36,40,68,70,91010.87V23,31,48,38,3955.43VI7,37,24,7444.35VII15,4722.17VIII30,51,45,4944.35IX3,10,34,7244.35X33,8222.17XI1811.09XII32,4222.17XIII41,4322.17XIV1311.09XV4,66,19,8044.35XVI25,4622.17XVII28,67,35,5844.35XVIII26,91,92,64,78,71,73,77,7999.78XIX52,59,62,53,56,89,76,54,55,83,75,90,65,85,57,69,631718.48XX61,84,8833.26XXI611.09XXII11,2722.17XXIII12,81,86,8744.35XXIV511.09XXV2111.09XXVI8,1622.17

縱坐標(biāo)1～92為試驗(yàn)菌株編號(hào)，橫坐標(biāo)0.00～1.00為相似距離The number of Magnaporthe oryzae on the vertical and correlation distance on the horizontal圖2 92個(gè)稻瘟病菌菌株親緣關(guān)系樹(shù)狀圖Fig.2 Dendrograph constructed based on SSR primers indicating genetic relationship among 92 M. oryzae

3 討 論

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，SSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于稻瘟病菌種群結(jié)構(gòu)的遺傳多樣性分析，Zheng等(2000)[11]設(shè)計(jì)并篩選了446對(duì)SSR引物，其中313對(duì)引物具有較高的多態(tài)性；Brondani等(2008)[12]設(shè)計(jì)了24對(duì)SSR引物，用于稻瘟病菌遺傳多樣性的研究；毛建輝(2008)[13]對(duì)四川45個(gè)菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究表明在0.76相似水平上可被劃分為7個(gè)宗譜，優(yōu)勢(shì)宗譜內(nèi)的菌株所占比列為71.11 %；周燕(2016)[14]對(duì)黑龍江省20個(gè)地區(qū)181個(gè)菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究表明供試所有菌株在0.52相似水平上即可歸納在1個(gè)宗譜內(nèi)，在0.72相似水平上劃分成11個(gè)宗譜，其中7個(gè)宗譜內(nèi)的菌株為1～3株。

劉二明(2002)[15]對(duì)湖南129個(gè)菌株的稻瘟病菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究表明在0.72相似水平被劃分成4個(gè)遺傳宗譜，優(yōu)勢(shì)宗譜內(nèi)菌株所占比例為65 %，揭示了稻瘟病菌存在較大的變異潛能；李亞(2007)[16]對(duì)湖南230個(gè)菌株稻瘟病菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，表明在0.77相似水平上可被劃分成7個(gè)遺傳宗譜，其中Ⅳ和Ⅶ宗譜中分別只有1個(gè)和5個(gè)菌株；童建新(2012)[17]對(duì)湖南19個(gè)縣市的169個(gè)菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明在0.80相似水平上可被劃分成8個(gè)遺傳宗譜，優(yōu)勢(shì)宗譜內(nèi)菌株所占比例為66.86 %；毛銳(2015)[18]對(duì)湖南桃江病圃89個(gè)菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明在0.72相似水平上可被劃分成20個(gè)遺傳宗譜，優(yōu)勢(shì)宗譜內(nèi)菌株所占比例為20.20 %；劉翔(2016)[19]對(duì)湖南桃江病圃120個(gè)菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明在0.75相似水平上可被劃分成32個(gè)遺傳宗譜，優(yōu)勢(shì)宗譜內(nèi)菌株所占比例為16.67 %，其中27個(gè)宗譜內(nèi)的菌株為1～6株。

4 結(jié) 論

LTH是中國(guó)稻瘟病菌生理小種的鑒別品種之一，具有普感稻瘟病的特性。本研究所用的菌株均分離自LTH的葉瘟病樣，這使得稻瘟病菌群體能更真實(shí)地反應(yīng)稻瘟病菌自然種群的遺傳結(jié)構(gòu)；湖南桃江病圃是國(guó)家水稻區(qū)域試驗(yàn)長(zhǎng)江中游生態(tài)區(qū)抗稻瘟病鑒定基地，每年為全國(guó)科研、生產(chǎn)單位鑒定大量育種材料和生產(chǎn)品種，比較而言，該病圃的病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)比其它生態(tài)系的稻瘟病菌復(fù)雜，周益軍等[20]認(rèn)為水稻品種越豐富，稻瘟病菌的遺傳復(fù)雜性和多樣性的程度越高。本研究利用14對(duì)SSR引物對(duì)分離自桃江LTH上的92個(gè)菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明在0.70相似水平的92個(gè)供試菌株共被劃分為27個(gè)宗譜，綜合聚類分析圖譜看來(lái)，92個(gè)供試稻瘟病菌遺傳差異較大，個(gè)別菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜；源自同一水稻品種的稻瘟病菌遺傳多樣性也較為豐富，這進(jìn)一步了證明地域品種的多樣化，導(dǎo)致稻瘟病菌群體遺傳的多樣性。

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