李 銳,王文國,趙 琦,陳曉儀,徐 鶯

(1. 成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,四川 成都 610106;2. 農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究生物質(zhì)能技術(shù)研究中心,四川 成都 610041;3. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都 610064)

【研究意義】干旱是影響作物生長和限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個重要因素，現(xiàn)在全球范圍內(nèi)大約有1/3以上的土地處于干旱或半干旱狀態(tài)，極大浪費了土地資源，并且植物在生長過程中經(jīng)常會受到干旱的影響[1]。我國水資源短缺較嚴重，因此利用植物基因工程克隆抗旱基因，研究抗旱機理，培育耐旱作物新品系尤為重要。LEA3蛋白因其特殊的結(jié)構(gòu)(含有11-氨基酸基元序列)可作為滲透調(diào)節(jié)蛋白和脫水保護劑來參與植物的滲透調(diào)節(jié)。干旱發(fā)生時，植物體內(nèi)的LEA3蛋白大量表達可以緩解干旱造成的危害[2-4]。因此關(guān)于LEA3蛋白的抗旱功能研究廣受關(guān)注，并通過轉(zhuǎn)基因手段改良作物的抗逆功能[5-6]。金發(fā)草(Pogonatherumpaniceum)是一種耐旱性極強的植物，在我國及東南亞、大洋洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛分布，是進行抗旱基因克隆和抗旱機理研究的理想材料[7]?！厩叭搜芯窟M展】由于真核生物的可變剪接現(xiàn)象，金發(fā)草LEA3基因存在2個剪接體(PpLEA3.a和PpLEA3.b)，與PpLEA3.a相比，PpLEA3.b保留了以疏水性為主的第2個內(nèi)含子，該內(nèi)含子的存在改變了LEA蛋白的親水性，進而可能影響蛋白質(zhì)的功能，鑒于這2個剪接體在氨基酸序列和預(yù)測的空間結(jié)構(gòu)上都有較大的差異，筆者先前研究已經(jīng)通過釀酒酵母表達系統(tǒng)鑒定了這些差異在細胞內(nèi)產(chǎn)生的耐受性的差異，發(fā)現(xiàn)2個剪接體在不同非生物脅迫下抗逆能力存在差異，尤其在模擬干旱條件下，剪接體重組菌的生存能力大幅提高，且PpLEA3.a比PpLEA3.b表現(xiàn)出更強的耐受能力[8]?！颈狙芯壳腥朦c】為了進一步鑒定金發(fā)草LEA3 2個剪接體在植物體內(nèi)的功能以及功能之間的差異，本研究分別將2個剪接體基因構(gòu)建到植物高效表達載體中，利用遺傳轉(zhuǎn)化的方法獲得煙草的轉(zhuǎn)基因植株，對其T2代純合子的耐干旱能力進行研究，通過觀察轉(zhuǎn)基因煙草幼苗生長發(fā)育，測定保水力、丙二醛和葉綠素含量、相對電導(dǎo)率等與脅迫相關(guān)的生理指標，以檢測2個剪接體基因在煙草中的過表達能否增強轉(zhuǎn)基因植株對干旱脅迫的耐受能力?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以期深入了解金發(fā)草LEA3基因的抗旱能力及導(dǎo)致基因剪接體功能變化的原因，為進一步研究金發(fā)草LEA3基因異構(gòu)體的剪接異構(gòu)的生物學(xué)意義和金發(fā)草抗旱機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料與基因 煙草品種為本生煙(Nicotianabenthamiana)，金發(fā)草LEA3基因2個剪接體由四川大學(xué)生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室克隆保存。

1.1.2 菌株、載體與試劑 大腸桿菌(Escherichiacoli)Top10、農(nóng)桿菌LBA4404、植物表達載體pBI121由四川大學(xué)生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室保存。植物基因組DNA提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒購物天根生物科技公司。rTaq酶、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV以及DNA限制酶購于TaKaRa 。PCR引物(表1)合成和基因測序均由北京六合華大基因有限公司完成。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物表達載體pBI121-LEA3.a和pBI121-LEA3.b的構(gòu)建及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 本研究采用pBI121載體進行轉(zhuǎn)化煙草實驗。利用引物L(fēng)121-F和L121-R分別擴增四川大學(xué)生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室構(gòu)建并保存的2個剪接體的重組質(zhì)粒pMD19-T-PpLEA3.a和pMD19-T-PpLEA3.b，用XbaI和SmaI酶切PCR產(chǎn)物和pBI121質(zhì)粒，膠回收后，用T4連接酶在16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliTOP10，從而得到pBI121-PpLEA3.a和pBI121-PpLEA3.b植物表達載體，利用雙酶切和PCR驗證是否將目的基因插入到植物表達載體pBI121，最后測序驗證重組質(zhì)粒的正確性。將鑒定完全正確的重組Top10擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法[9]進行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化，經(jīng)組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因煙草。T0代種子經(jīng)消毒處理后用卡那霉素培養(yǎng)基進行抗性篩選，得到轉(zhuǎn)基因T1后代株系。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定 提取T1代轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA，用引物L(fēng)121-F和L121-R進行PCR檢測該基因是否整合到煙草基因組中。分別提取野生型煙草和T1代轉(zhuǎn)基因煙草的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行RT-PCR擴增，內(nèi)參基因為18S。選取篩選鑒定的陽性植株幼苗移栽到營養(yǎng)土中繼續(xù)生長以收獲T2代種子，從中篩選進而獲得純合轉(zhuǎn)基因株系，以此作為后續(xù)耐干旱脅迫生理特性研究對象。

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草耐干旱脅迫處理 隨機選取PpLEA3基因2個剪接體的T2代轉(zhuǎn)基因3個株系，以種子作為出發(fā)材料，待其長至高約0.7 cm時，挑選葉片為綠色、長勢一致的幼苗，移栽到含有甘露醇150 mM的MS培養(yǎng)基中進行脅迫處理，同期的野生型煙草幼苗為對照。40 d后調(diào)查煙草的高生長、幼苗鮮重情況，并進行各項生理指標測定，每個株系重復(fù)3次。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的相關(guān)生理指標檢測 離體葉片保水率測驗參照Klute[10]的方法進行；植物葉片相對電導(dǎo)率和丙二醛(MDA)含量的測定參照《現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南》[11]的方法；葉綠素含量采用丙酮提取法[12]測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)PpLEA3基因剪接體煙草的獲得及分子檢測

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法獲得轉(zhuǎn)基因煙草50株，其中PpLEA3.a轉(zhuǎn)基因煙草26株，PpLEA3.b轉(zhuǎn)基因煙草24株。對不同T0代株系種子進行卡那霉素抗性篩選，取陽性植株收獲T1種子，進一步對其進行抗性篩選，待植株長大后分別提取葉片DNA，以野生型煙草為對照，進行目的基因的基因組整合檢測分析(圖1)。所選擇的克隆株系均擴增出預(yù)期大小的特異性條帶，而野生型煙草未擴增出相應(yīng)片段，另外本研究還對這些株系進行了RT-PCR轉(zhuǎn)錄水平檢測(圖2)，在煙草內(nèi)參18S穩(wěn)定表達的情況下，野生型煙草沒有擴增出條帶，而選擇的克隆株系都擴增出了目標產(chǎn)物。以上結(jié)果說明PpLEA3基因的2個剪接體已分別整合入煙草基因組中，并通過穩(wěn)定遺傳在轉(zhuǎn)基因后代中進行有效的轉(zhuǎn)錄表達。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的耐干旱性脅迫分析

2.2.1 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因煙草生長狀況的影響 將轉(zhuǎn)PpLEA3.a基因煙草株系Ta(Ta-1，Ta-3，Ta-5)、轉(zhuǎn)PpLEA3.b基因煙草株系Tb(Tb-4，Tb-7，Tb-9)和野生型煙草(Wt)的T2代純系種子分別播種于MS培養(yǎng)基上，28 ℃光照培養(yǎng)箱中生長30 d后(圖3A，大約株高0.7 cm)，移栽到含有甘露醇150 mM的MS培養(yǎng)基中進行脅迫處理40 d，觀察其生長情況。由圖3 B可以看出，野生植株相對矮小，葉片萎蔫，生長畸形，而轉(zhuǎn)基因煙草的生長發(fā)育雖然也受到明顯的抑制，但整體受損情況要好很多。初步確認2個剪接體基因的分別導(dǎo)入增加了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性。同時對不同株系的平均株高和平均鮮重進行了比較分析，轉(zhuǎn)基因株系在含甘露醇150 mM的MS培養(yǎng)基上的平均株高和平均鮮重都比對照高(圖4)，且抵抗甘露醇能力大小為Ta>Tb>Wt。說明2個剪接體基因的分別導(dǎo)入改善了煙草在干旱脅迫下的生長狀況。

M：DNA 2000 marker；1：Wild type as the negative control；2-5: Transgenic type of PpLEA3.a；6-9: Transgenic type of PpLEA3.b圖1 轉(zhuǎn)PpLEA3基因2個剪接體煙草部分株系基因組DNA PCR鑒定Fig.1 DNA PCR detection in different transgenic tobacco lines

2.2.2 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因煙草保水力、丙二醛含量、葉綠素含量和相對電導(dǎo)率的影響 利用甘露醇模擬干旱環(huán)境對經(jīng)過脅迫后的各個煙草株系的葉片保水力進行了測定(圖5A)，與對照相比，轉(zhuǎn)基因煙草葉片保水能力有著較大的提高，說明轉(zhuǎn)化PpLEA3基因可提高植株的抗旱能力。轉(zhuǎn)PpLEA3.a基因煙草的平均保水率要高于轉(zhuǎn)PpLEA3.b基因煙草，表明2個剪接體對干旱抵抗力的大小為PpLEA3.a>PpLEA3.b。

在干旱等逆境因素作用下，植物細胞膜脂會由于胞內(nèi)過氧化物的過量產(chǎn)生而導(dǎo)致氧化作用的出現(xiàn)。造成植物細胞膜脂氧化傷害的因子非常多，而丙二醛(MDA)在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，MDA濃度的增加會損害植物細胞膜，并對植物細胞正常功能造成阻礙。研究表明，干旱脅迫可引起植物MDA含量顯著提高，因此MDA濃度的多少以及變化幅度可被看作植物抗逆強弱的標準之一[13]。對在同樣條件下脅迫生長的轉(zhuǎn)基因株系和野生型對照測定結(jié)果顯示(圖5B)，與野生型對照相比，轉(zhuǎn)基因煙草的MDA濃度較低，表明LEA3基因使轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性得到了提高，該基因的大量表達對細胞的膜系統(tǒng)起到了保護作用。很明顯，轉(zhuǎn)PpLEA3.a基因煙草的MDA平均濃度低于轉(zhuǎn)PpLEA3.b基因煙草，說明PpLEA3.a比PpLEA3.b表現(xiàn)出較強的耐干旱能力。

植物干物質(zhì)的積累主要來自葉片的光合作用，葉綠體作為光合作用的細胞器，是影響光合作用的主要因素之一，因此葉綠素含量可以直接反映植物的光合作用，也是衡量植物在干旱脅迫下耐干旱能力的重要生理指標之一[14]。比較轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草在150 mM甘露醇處理后的葉綠素含量可以發(fā)現(xiàn)(圖5 C)，轉(zhuǎn)基因株系均顯著高于野生型株系，轉(zhuǎn)PpLEA3.a基因煙草的總體平均葉綠素含量比轉(zhuǎn)PpLEA3.b基因煙草高27.4 %，表明干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因株系葉綠素合成的影響小于野生型株系，進一步說明轉(zhuǎn)PpLEA3基因煙草的耐干旱能力強于野生型對照，并且轉(zhuǎn)PpLEA3.a基因煙草擁有較強的干旱抵抗力。

Wt：Wild type；1-3: Transgenic type of PpLEA3.a；4-6: Transgenic type of PpLEA3.b圖2 轉(zhuǎn)PpLEA3基因2個剪接體煙草隨機株系RT-PCR檢測Fig.2 RT- PCR detection in different transgenic tobacco lines

Wt：Wild type；Ta-1, Ta-3, Ta-5：Transgenic type of PpLEA3.a；Tb-4, Tb-7, Ta-9：Transgenic type of PpLEA3.b圖3 T2代轉(zhuǎn)基因株系抗干旱表型分析Fig.3 Phenotypes of 30-old seedlings of Wt and transgenic tobacco (A) treated with 150 mM Mannitol on MS medium at 28 ℃ for 40 days (B)

相對電導(dǎo)率是反映植物膜系統(tǒng)受傷害程度的一個重要的理化指標，植物在干旱條件下細胞膜容易破裂，膜蛋白受傷害導(dǎo)致細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲而使相對電導(dǎo)率增大[15]。因此葉片的相對電導(dǎo)率可以作為衡量植物抗旱性的指標。從圖5D可以看出，各轉(zhuǎn)基因株系與野生型對照的相對電導(dǎo)率明顯不同，各轉(zhuǎn)基因株系均小于野生型株系，并且轉(zhuǎn)PpLEA3.a基因煙草的相對電導(dǎo)率平均水平比轉(zhuǎn)PpLEA3.b基因煙草低12.9 %。說明將PpLEA3基因?qū)霟煵菘稍谝欢ǔ潭壬暇S持細胞膜透性的穩(wěn)定，提高煙草的抗旱能力。

3 討 論

LEA蛋白是種子發(fā)育后期并伴隨脫水干燥過程而產(chǎn)生的一類小分子特異多肽，其中的第3組LEA蛋白可以在干旱脅迫條件下得到大量積累從而提高植物的抗旱性[3]。大量實驗表明LEA家族蛋白可以不同途徑不同機制來發(fā)揮抗逆功能[16]。在本研究中，利用轉(zhuǎn)基因的方法將來自金發(fā)草的LEA3基因2個剪接體分別轉(zhuǎn)化煙草并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，對轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性能進行分析發(fā)現(xiàn)2個剪接體的分別過表達改善了煙草的生長狀況，并且各項生理指標都優(yōu)于野生型對照煙草，表明轉(zhuǎn)金發(fā)草LEA3基因2個剪接體可以提高煙草的耐旱能力。結(jié)合先前研究發(fā)現(xiàn)，金發(fā)草LEA3基因2個剪接體在重組的釀酒酵母中都對干旱、鹽、冷等非生物脅迫具有一定的耐受能力[8]。因此，鑒于金發(fā)草LEA3蛋白存在可變剪接現(xiàn)象，本研究推測，當(dāng)金發(fā)草遭遇干旱逆境時，LEA3蛋白可能通過可變剪接現(xiàn)象進行響應(yīng)，依靠不同剪接體極強的親水能力增強金發(fā)草對水分脅迫的耐受性，本研究為金發(fā)草的抗旱機能研究提供了實驗依據(jù)。

Wt：Wild type；Ta-1, Ta-3, Ta-5：Transgenic type of PpLEA3.a；Tb-4, Tb-7, Ta-9：Transgenic type of PpLEA3.b圖4 轉(zhuǎn)基因株系及野生型對照在含150 mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上的生長量Fig.4 Growth analysis of transgenic tobacco lines and wild type tobacco

Wt：Wild type；Ta-1, Ta-3, Ta-5：Transgenic type of PpLEA3.a；Tb-4, Tb-7, Ta-9：Transgenic type of PpLEA3.b圖5 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因株系和野生型對照的相關(guān)生理指標分析 Fig.5 Detection of related physiological index between transgenetic tobacco line and wild type tobacco under drought stress

可變剪接作為真核生物控制基因表達的一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，可以使一個基因具有多個功能狀態(tài)[17]，就金發(fā)草LEA3蛋白而言，通過可變剪接產(chǎn)生的2個蛋白都具有抗旱功能，但抗旱能力存在差異，這可能是由于內(nèi)含子的保留導(dǎo)致PpLEA3.b較PpLEA3.a相比蛋白的親水能力降低所致，進一步說明序列的改變可以導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)的改變，最終導(dǎo)致功能上產(chǎn)生一定的差異。已有研究表明，可變剪接的發(fā)生受不同的細胞環(huán)境如細胞類型、發(fā)育階段和生理狀態(tài)等調(diào)節(jié)，在不同的環(huán)境下可變剪接方式可能存在不同[18]，本團隊已經(jīng)通過實驗研究確定了金發(fā)草LEA3基因可變剪接的抗旱功能，但其具體的調(diào)控機制仍然未知。隨著轉(zhuǎn)錄組、基因組等高通量實驗技術(shù)的發(fā)展，我們將結(jié)合生物信息學(xué)及實驗研究解析金發(fā)草LEA3基因可變剪接的調(diào)控機制，進而從分子水平揭示金發(fā)草抗旱機理。

4 結(jié) 論

本文首先利用轉(zhuǎn)基因法獲得了金發(fā)草LEA3基因2個剪接體的轉(zhuǎn)基因煙草植株，并通過干旱相關(guān)生理指標檢測法分析轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性能，結(jié)果顯示2個剪接體基因均從不同程度上提高了煙草的干旱能力，且抗旱能力大小為PpLEA3.a>PpLEA3.b，進一步說明2個剪接體親水能力和結(jié)構(gòu)上的改變可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草耐受力的不同。

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