謝 戎， 劉成元， 李永洪， 何 珊，向箭宇

(1.四川省農業(yè)科學院水稻高粱研究所/農業(yè)部西南水稻生物學與遺傳育種重點實驗室,四川 德陽 618000；2.農業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，四川 成都 610066)

【研究意義】稻瘟病(Rice blast)和紋枯病(Rice sheath bight)是水稻生產上2種重要的真菌病害。稻瘟病在田間從水稻秧苗期開始以為害葉片為主，嚴重時造成化苗；灌漿后為害穗頸、枝梗及穎殼等，嚴重時造成穗頸折斷而大幅減產。紋枯病在田間從水稻分蘗盛期開始以為害葉鞘為主，逐步向上為害上部葉鞘及葉片，嚴重時造成上部葉片枯死及后期倒伏，也嚴重影響產量?！厩叭搜芯窟M展】稻瘟菌[Magnaporthegrisea(Hebert)Barr.]及紋枯菌(RhizoctoniasolaniKühn)侵染水稻的機制各不相同，前者為?；郧秩?，后者為非專化性侵染[1-4]。由于稻瘟菌與水稻品種的專化性互作，造成抗病品種在生產上使用3～5年后喪失其抗病性[5-6]。而紋枯菌寄主范圍寬、腐生性強，使得目前水稻中尚未發(fā)現(xiàn)對該病免疫或高抗的水稻種質[7-8]。大量研究表明，一些外源基因能誘導寄主在受到病菌侵染時產生系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance SAR)[9 -12]，這為培育抗稻瘟病、紋枯病的新品種提供了新的技術手段。前文對轉GO基因雜交后代株系對稻瘟病生理小種的抗譜進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)有的后代株系抗病頻率達80 %以上，明顯高于其親本[13]，但在田間的抗感反應需進一步觀察?！颈狙芯壳腥朦c】本文對轉GO基因雜交后代對稻瘟病和紋枯病的田間抗性進行了初步研究。【擬解決的關鍵問題】以便為新品種培育提供新的抗源，為抗病機制研究提供新材料。

表1 46個GO基因雜交后代組合來源及編號Table 1 Name and code of 46 transgenic rice filial generation with glucose oxidase gene

1 材料與方法

1.1 供試材料

46個GO基因雜交后代來源及編號見表1，2013年世代為F5，2015年為F7，2016年為F8。配制雜交組合的5個恢復系：明恢63、樂恢188、縉恢21、R473、H103來源于本課題親本圃。以LJH為稻瘟病對照，Lemont為紋枯病對照。

1.2 試驗方法

1.2.1 病圃自然誘發(fā)鑒定 試驗分別于2013、2015及2016年在本所敘永水尾稻瘟病圃進行。每年3月20日播種，地膜濕潤秧。將恢復系明恢63及普感品種LJH混合作為誘發(fā)品種，待誘發(fā)品種秧苗3葉1心時接種上年收集的病稻草。每個供試材料栽1行10窩，3～4苗/窩，栽培規(guī)格16.5cm × 19.8cm，兩廂供試材料之間栽2行誘發(fā)品種。待誘發(fā)品種充分發(fā)病時調查葉瘟，抽穗后20 d調查穗頸瘟，同時調查紋枯病發(fā)病情況。

1.2.2 調查標準 ⑴病葉率( %)= 病葉數(shù) / 調查總葉數(shù) × 100。葉瘟分級標準：每個材料調查30片葉，按下列標準記載每葉發(fā)病級別，計算病情指數(shù) %=∑(各級病葉數(shù) × 各級代表值)/ (調查總葉數(shù) × 最高級代表值) × 100(下同)。

0級：無病斑；1級： 針頭大小的褐點或無產孢中心的較大褐點；2級： 圓形至橢圓灰色壞死小斑，直徑1～2 mm，邊緣褐色，絕大多數(shù)病斑分布在下部葉片；3級： 病斑型同2級，絕大多數(shù)病斑分布在上部葉片；4級： 典型病斑，病斑長度3 mm以上，常局限于2條葉脈之間，侵染葉面積小于2 %；5級： 典型病斑，侵染葉面積2 %～10 %；6級： 典型病斑，侵染葉面積11 %～25 %；7級： 典型病斑，侵染葉面積26 %～50 %；8級： 典型病斑，侵染葉面積51 %～75 %，部分葉片枯死；9級： 典型病斑，侵染葉面積大于75 %，絕大多數(shù)葉片枯死。

⑵病穗率( %)= 病穗數(shù) / 調查總穗數(shù)×100。頸瘟分級標準：每個材料調查30穗，按下列標準記載每穗頸瘟級別，計算病情指數(shù)。

0級(免疫)： 全穗無??；1級(高抗)： 枝梗瘟，小于5 %谷粒受枝梗瘟影響；3級(抗)： 枝梗瘟，5 %～10 %左右谷粒受枝梗瘟影響；5級(中抗)： 枝梗瘟，10 %～25 %谷粒受害；7級(感)： 多個枝?；蛑髦０l(fā)病，25 %～50 %谷粒受害；9級(高感)： 主枝梗或穗頸發(fā)病，超過50 %谷粒受害。

⑶病稈率( %)= 發(fā)病莖數(shù) / 調查總莖數(shù)×100。紋枯病分級標準：每個材料調查30莖，按表2記載每莖發(fā)病級別，計算病情指數(shù)。

1.2.3 抗感級劃分 以3年中每個株系(材料)最高病級劃分該株系的抗(感)級(表2)。

2 結果與分析

2.1 46個轉GO基因雜交后代田間抗感株系分布

從圖1可以看出，田間中抗-高抗稻瘟病的株系占46個供試株系的23.9 %，高感株系比例大，占50.0 %；中抗-抗紋枯病的株系占15.2 %，中感株系比例大，占52.2 %。說明多數(shù)供試的轉GO基因雜交后代不抗稻瘟病和紋枯病，田間表現(xiàn)抗2種病害的株系出現(xiàn)頻率較低，但中抗及其以上病級的抗稻瘟病的株系比抗紋枯病的株系多8.7 %。

表2 紋枯病抗性分級Table 2 Classification of resistance to rice sheath blight

2.2 各株系對稻瘟病及紋枯病的田間抗性表現(xiàn)

2.2.1 年度間相同株系的抗性差異 從表3可以看出，不抗的株系年度間田間抗感反應變化較大，如株系J572，3年病穗率分別為56.1 %、5.0 %及40.0 %，病稈率分別為90.0 %、15.1 %及100 %；又如株系HR320，3年病穗率分別為4.3 %、11.2 %及85.0 %，病稈率88.9 %、20.0 %及80.0 %，2015年的發(fā)病程度明顯偏輕。但抗性較好株系年度間抗感反應變化較小，如對稻瘟病高抗株系HR332，3年病穗率分別為5.0 %、2.3 %及4.8 %；對紋枯病抗的株系HR337，3年病稈率分別為9.0 %、45.3 %及20.0 %。上述結果表明，田間抗性鑒定主要受年度間發(fā)病程度差異影響較大，僅1年的鑒定結果可靠性較差。

2.2.2 株系間的抗性差異 從表3可以看出， 對稻瘟病達到高抗的株系2個(HR321及HR332)，抗的株系3個(J668、J670及HR324)，中抗株系6個(J618、J669、J779、J792、HR333及HR336)，感病株系12個，高感株系23個；對紋枯病達到抗的株系2個(HR337及HR339)，中抗株系5個(HR332、HR333、HR334、HR336及HR338)，中感株系24個，感病株系9個，高感株系6個。

圖1 46個轉GO基因雜交后代田間病級分布Fig.1 Distribution of rice blast and sheath blight disease grade of 46 transgenic rice filial generation with glucose oxidase gene in the field

HR332既高抗稻瘟病，又中抗紋枯??；HR333及HR336對稻瘟病和紋枯病均表現(xiàn)為中抗；HR321高抗稻瘟病，中感紋枯??；J668、J670及HR324抗稻瘟病，感紋枯?。籎618、J669、J779及J792中抗稻瘟病，也對紋枯病表現(xiàn)為感病。HR337及HR339抗紋枯病，但感或高感稻瘟??；HR334及HR338均中抗紋枯病，但高感稻瘟病。由此看出，①在46個轉GO基因雜交后代株系中，同時抗稻瘟病和紋枯病的株系很少，只抗1種病害的株系相對較多。②株系間由于其遺傳背景不同，對病菌侵染后的抗性反應差異很大。

2.2.3 不同雜交組合間抗性株系比較 對不同雜交組合后代達中抗以上的株系進行歸類(表4)，日本晴(轉G)/蜀恢162、日本晴(轉G)/蜀恢162//樂恢188及日本晴(轉G)/蜀恢162//R473這3個組合后代出現(xiàn)了既抗稻瘟病又抗紋枯病的株系；日本晴(轉G)/蜀恢162//縉恢21后代出現(xiàn)只抗稻瘟病或抗紋枯病的株系；日本晴(轉G)/蜀恢162//明恢63及日本晴(轉G)/蜀恢162//H103這2個組合后代未出現(xiàn)抗紋枯病的株系。日本晴(轉G)/蜀恢162陽性單株(F2)后代[14]，經多代選擇穩(wěn)定的3個株系中，僅HR333既中抗稻瘟病又中抗紋枯病。

供試的5個親本中，明恢63、縉恢21、H103高感稻瘟病，樂恢188及R473感稻瘟病，其相應雜交組合后代中出現(xiàn)了中抗至高抗的株系，稻瘟病抗性較親本有顯著提高。樂恢188本身中抗紋枯病，其余4個親本中感紋枯病，日本晴(轉G)/蜀恢162//樂恢188、日本晴(轉G)/蜀恢162//明恢63及日本晴(轉G)/蜀恢162//H103這3個組合的后代紋枯病抗性未有所提高；日本晴(轉G)/蜀恢162//縉恢21及日本晴(轉G)/蜀恢162//R473其后代出現(xiàn)紋枯病抗性水平明顯提高的株系。顯然，GO基因的表達受遺傳背景的影響，在不同遺傳背景中，調控水稻發(fā)生抗病反應的程度也有較大差異。

表3 GO基因雜交后代對稻瘟病及紋枯病的田間抗性表現(xiàn)Table 3 Field resistance of transgenic rice filial generation with glucose oxidase gene to blast and sheath blight

續(xù)表3 Continued table 3

材料編號Material code年份Year葉瘟 Leaf blast穗頸瘟 Panicle neck blast紋枯病 Sheath blight病葉率 ( %)Rate of diseased leaf 病情指數(shù)Diseaseindex病穗率 ( %)Rate of diseasedpanicles 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessment病稈率 ( %)Rate of diseased stalk 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessmentJ659201358.858.840.029.3感S10091.1高感HS201525.02.837.125.543.912.72016--7.95.385.544.6J668201357.157.13.05.0抗R55.642.9中感MS201516.13.84.52.735.78.32016--6.35.970.037.8J669201339.039.03.02.0中抗MR20.017.1中感MS201520.05.011.58.330.76.72016--25.017.595.058.1J670201360.345.82.03.5抗R77.845.6中感MS201540.011.710.01.150.110.02016--8.34.460.520.7J688201378.752.810082.4高感HS50.038.9中感MS201515.02.865.115.020.63.32016--25.010.410045.0J715201358.936.32.02.0高感HS33.333.3中感MS201531.15.645.221.730.57.82016--93.548.610055.8J735201354.833.787.583.3高感HS62.562.5感S201520.63.380.030.035.25.02016--7.53.975.050.9J737201343.734.872.742.4高感HS100100高感HS201530.06.75.00.635.08.32016--10.25.960.327.9J779201331.725.015.010.7中抗MR10046.7中感MS20152.34.425.06.155.59.42016--10.56.795.050.9J792201351.335.814.312.2中抗MR100100高感HS201540.98.913.78.545.335.22016--14.113.210061.2J793201346.833.230.024.3感S10076.0感S201550.09.220.02.275.019.42016--10.213.560.131.6J794201352.6.33.64.55.1高感HS10064.4感S201542.111.125.917.450.515.62016--10064.810062.1J848201352.133.92.02.0高感HS40.040.0感S201544.511.332.316.123.716.12016--10074.710071.1HR320201341.932.04.32.4高感HS88.969.1感S

續(xù)表3 Continued table 3

材料編號Material code年份Year葉瘟 Leaf blast穗頸瘟 Panicle neck blast紋枯病 Sheath blight病葉率 ( %)Rate of diseased leaf 病情指數(shù)Diseaseindex病穗率 ( %)Rate of diseasedpanicles 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessment病稈率 ( %)Rate of diseased stalk 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessment201515.03.911.27.420.02.22016--85.044.680.042.3HR321201344.234.02.02.0高抗HR81.342.2中感MS20155.00.64.72.815.13.92016--2.81.581.850.4HR323201323.515.942.934.9感S90.567.8感S201550.013.930.08.945.512.82016--34.723.180.140.5HR324201318.414.12.16.2抗R10064.4感S201515.03.33.62.333.219.72016--5.94.270.045.0HR325201343.525.610043.1高感HS72.365.6感S201541.210.615.03.940.15.62016--15.012.210057.6HR326201324.519.823.516.8高感HS40.018.9中感MS201545.610.610056.731.111.12016--22.316.785.048.3HR327201343.533.0.3.72.1高感HS16.67.2中感MS201562.522.210052.290.041.52016--45.034.775.427.5HR3282013----高感HS--中感MS201550.015.610056.522.32.32016--30.022.585.157.2HR329201340.026.011.07.8感S12.48.4中感MS201580.935.010.13.35.00.62016--31.518.075.344.6HR33020135.813.618.018.0感S9.03.0中感MS201585.127.250.013.335.511.72016--30.09.065.845.1HR331201349.438.97.53.4感S11.010.8中感MS201571.626.150.012.265.017.22016--15.04.165.055.2HR332201349.533.05.06.2高抗HR15.16.7中抗MR201535.111.12.35.410.13.32016--4.83.271.534.2HR333201318.614.412.511.1中抗MR13.04.2中抗MR201537.59.425.02.840.06.72016--25.015.850.026.1HR334201344.630.876.541.0高感HS30.122.0中抗MR201560.218.375.218.345.315.0

續(xù)表3 Continued table 3

材料編號Material code年份Year葉瘟 Leaf blast穗頸瘟 Panicle neck blast紋枯病 Sheath blight病葉率 ( %)Rate of diseased leaf 病情指數(shù)Diseaseindex病穗率 ( %)Rate of diseasedpanicles 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessment病稈率 ( %)Rate of diseased stalk 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessment2016------HR335201350.028.910.66.7感S10074.3感S201585.031.150.012.275.442.82016--15.17.710.81.8HR336201352.132.48.45.5中抗MR40.732.0中抗MR201560.520.623.711.337.328.22016------HR337201357.140.395.082.0高感HS9.08.4抗R201585.328.910096.745.317.22016--10081.020.07.2HR338201342.128.39.310.3高感HS9.610.0中抗MR201535.010.665.147.225.05.02016--10079.245.623.9HR339201350.536.05.02.3感S48.65.0抗R201510035.630.011.07.24.82016--50.032.410.16.3HR340201377.358.818.511.9感S10093.3高感HS201555.015.622.830.520.02.22016--33.221.69.95.4LJH (CK1)201384.462.596.983.0高感HS88.922.3感S201585.153.671.367.567.849.52016--93.279.090.165.8Lemont (CK2)201350.220.747.523.8感S89.969.2高感HS201540.326.932.919.677.152.02016--29.420.010081.0明恢63Minghui63201344.237.858.325.3高感HS30.422.5中感MS201550.133.239.925.020.112.82016--40.831.455.943.0樂恢188Lehui188201327.917.243.130.0感S42.015.9中抗MR201532.424.031.112.922.825.42016--33.723.533.624.6縉恢21Jinhui21201342.525.255.229.4高感HS44.928.5中感MS201532.618.441.430.234.020.32016--45.122.755.544.7R473201326.811.641.228.3感S39.242.7中感MS201530.521.621.513.222.515.32016--29.421.049.723.9H103201349.230.250.227.1高感HS33.948.1中感MS201544.123.530.522.513.720.62016--21.518.248.133.6

Note: HR—High resistant；R—Resistant；MR—Middle resistant；MS—Middle Susceptible；S—Susceptible；HS—High susceptible. ‘-’mean lack of observation data.

Note: HR: High resistant；R: Resistant；MR: Middle resistant. ‘-’ mean lack of observation data.

3 討 論

前文[13]中，轉GO基因后代株系HR320和HR332對稻瘟病生理小種的抗病頻率>80 %，但HR320在2013年及2015年病圃中表現(xiàn)抗稻瘟病，但2016年病穗率達85 %，表現(xiàn)感病，而HR332在3年鑒定中均表現(xiàn)高抗，由此看出，僅憑1年抗譜測定結果或一年田間試驗結果對一個材料的抗性尚不能做出準確的判斷。經抗譜測定結并合田間鑒定表明，HR332是一個新的高抗稻瘟病抗源材料。經過3年觀察，遺傳背景不同的3個株系HR332、HR333及HR336對稻瘟病和紋枯病均有一定抗性(表3)。目前水稻中紋枯病的抗源很少[7-8]，本文中，HR337在3次田間鑒定中的紋枯病病指分別為8.4 %、17.2 %、及7.2 %，HR339分別為5.0 %、4.8 %及6.3 %，達到抗紋枯病的水平，可作為紋枯病抗源在育種中利用。

葡萄糖氧化酶存在于一些細菌和真菌中，專一催化β-D-葡萄糖氧化生成過氧化氫和葡萄糖酸。H2O2一方面能直接抑制和殺死病原菌，另一方面作為二級信使能激活和調控植物受病原菌侵染后引發(fā)的一系列防御反應，如誘發(fā)植物膜脂過氧化形成抗性病斑，增強細胞壁結構，誘導植保素合成等。由于不同寄主基因型與病原菌組合不同，產生防御反應所啟動的信號傳導途徑就不同，導致不同遺傳背景寄主防御反應的作用和表現(xiàn)特點也不同[14-19]。本文中，轉GO基因雜交后代出現(xiàn)既抗稻瘟病又抗紋枯病的株系，僅抗稻瘟病不抗紋枯病的株系，或僅抗紋枯病不抗稻瘟病的株系等多種類型的抗性表現(xiàn)(表3)，這為研究其抗病機制提供了新材料。

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