駱 婷,夏 虹,馮定勝,高 友,王一丁*(.四川師范大學生命科學學院，四川 成都 600；.四川師范大學投資管理有限公司，四川 成都 60068)

【研究意義】土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，數(shù)量龐大且種類豐富，在形成土壤結構、分解有機質及礦物質、固氮、調節(jié)植物生長等方面發(fā)揮著重要作用[1]。土壤微生物資源的開發(fā)利用對于生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的提升、農產品質量的保障和土壤可持續(xù)利用等都至關重要[2]。隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展，土壤微生物資源的相關研究已成為當前熱點，且研究重點多在功能性菌株的篩選與應用。【前人研究進展】當前，多種功能性降解菌(如有機磷降解菌[3]、蛋白降解菌[4-5]、淀粉酶產生菌[6-8]、纖維素降解菌[9-10]、油脂降解菌[11-12]等)已廣泛應用于農業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、食品及環(huán)保等各個領域。但是，相比于土壤微生物的豐富性，已知功能性菌株的數(shù)量微乎其微，大量土壤微生物的篩選及功能鑒定有待進一步加強?！颈狙芯壳腥朦c】森林土壤表面覆蓋大量枯枝落葉，其降解與土壤微生物的群落結構和多樣性緊密相關[13]，目前森林土壤微生物的研究主要集中在土壤微生物參與凋落物降解的動態(tài)變化[14-16]，這點在高山、亞高山森林土壤微生物的研究中尤為突出，而對森林土壤中功能性降解菌的篩選、應用研究涉及甚少。高山森林土壤每年會出現(xiàn)長達5～6個月的季節(jié)性凍融期，土壤凍結導致不耐低溫的細菌類群死亡或休眠，部分耐受低溫的細菌類群得以存活并保持一定的活性；高山森林土壤的凍結在一定程度上提高了土壤細菌的優(yōu)勢度[17]，其中可能存在產酶活性很高的降解菌屬。【擬解決的關鍵問題】本研究采集四川汶川的高山森林土壤，通過稀釋涂布平板法、透明圈法等對能夠同時降解纖維素、淀粉、蛋白質、油脂及過氧化氫(H2O2)的多功能資源菌株進行分離、篩選及鑒定，以期對土壤微生物資源的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源 2015年12月，采集四川汶川海拔2950 m(E103°0′19.08″，N30°51′50.66″)森林下覆蓋腐爛落葉的土壤樣品，封于塑料袋中，標記采樣日期、地點，冷藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①富集培養(yǎng)基。馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L，pH自然；②分離培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0；③篩選培養(yǎng)基。淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏5 g/L，可溶性淀粉2 g/L，瓊脂20 g/L；油脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，花生油10 g/L，1.6 %中性紅水溶液1 mL/L，瓊脂20 g/L，pH 7.2；脫脂牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然；剛果紅培養(yǎng)基[18]：羧基纖維素鈉2.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，七水硫酸鎂0.25 g/L，硫酸銨1.0 g/L，剛果紅0.1 g/L，瓊脂20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與純化 稱取土壤樣品10 g，放入150 mL PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃和100 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。吸取上清液進行10倍梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7稀釋液各100 μl涂布于分離培養(yǎng)基平板上，每個處理重復3次，然后置于28 ℃中倒置培養(yǎng)48 h。根據菌落形態(tài)、顏色、質地、形狀、邊緣等初步統(tǒng)計分離細菌的種類，并將分離到的細菌轉接到分離培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)[19]。

1.2.2 多功能菌株的篩選 將分離出的菌株分別點種到剛果紅培養(yǎng)基、脫脂牛奶培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基平板上，設置3個重復，28 ℃培養(yǎng)1～3 d后，根據菌落生長情況及菌落周圍變化進行相關功能的鑒定[5,8,20]。菌株在篩選培養(yǎng)基生長且在菌落周圍形成透明水解圈，表明該菌株具備纖維素、蛋白質及淀粉的降解能力，同時透明圈的大小在一定程度上反映了菌株降解能力的強弱；因此，本研究以“透明圈直徑/菌落直徑的比值(D)”初步判定菌株的纖維素、蛋白質、淀粉的降解能力，從而進行功能菌株的初步篩選。

將分離出的菌株點種到油脂培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況及菌落周圍是否產生紅色斑點，若產生紅色斑點則表明菌株有降解油脂的能力[21]。油脂水解產生的脂肪酸致使培養(yǎng)基pH降低，培養(yǎng)基中的中性紅指示劑使培養(yǎng)基從淡紅色轉變?yōu)樯罴t色，從而在菌落周圍形成深紅色的水解圈，水解圈越大，則紅色斑點越多，可根據水解圈大小或紅色斑點數(shù)量初步判斷菌株降解油脂的能力。

在無菌操作臺上，使用高溫滅菌的牙簽挑取少量菌體分別涂抹在滴有1滴3 % H2O2的載玻片上，肉眼觀察是否產生氣泡并依據氣泡產生的速率簡單判定菌株分解H2O2的能力。同時，以不接菌的空白滅菌牙簽放入H2O2中觀察氣泡產生情況作為對照。

篩選并保存能夠同時降解蛋白質、纖維素、油脂、淀粉和H2O2的菌株。

1.2.3 菌株的鑒定 形態(tài)學鑒定。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[22]，對篩選得到的多功能菌株進行常規(guī)形態(tài)學觀察，從而進行初步的鑒定。

分子生物學鑒定。離心收集發(fā)酵培養(yǎng)的菌體，按照康為世紀(北京)生物科技有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒的標準操作流程提取總DNA.用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增細菌16S rDNA 基因片段。PCR反應體系(25 μl)：Mix 9.5 μl；引物27F、1429R及模板DNA各1 μl；雙蒸水12.5 μl。PCR反應擴增條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.反應產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，由擎科生物有限公司進行序列測定。測序結果在NCBI上GenBank中進行BLAST比對，然后用MEGA5.1軟件進行序列相似性分析，以Neighbor-joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap進行檢驗，重復1000次。

表1 森林土壤可培養(yǎng)細菌的多項降解功能鑒定Table 1 Identification of several degradation functions of bacteria in forest soil

注：“﹢”表示可降解；“﹣”表示不可降解。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離及多功能菌株的初步篩選

森林土壤樣品經富集培養(yǎng)，通過稀釋涂布法分離、純化，共得到40株可培養(yǎng)細菌，標記為N1～N40。

采用透明圈等方法對細菌N1～N40分別進行多項功能鑒定，由表1可知，40株細菌全部都能分解過氧化氫；纖維素降解菌、蛋白降解菌、淀粉降解菌和油脂降解菌分別有37、26、35、25株，能夠同時降解纖維素、蛋白質、淀粉、油脂及過氧化氫的菌株共21株。

透明圈的大小能在一定程度上反映菌株的降解能力。由表2可知，經剛果紅培養(yǎng)基平板篩選得到37株纖維素降解菌，其透明圈直徑與菌落直徑的比值在1.0～9.2，其中比值大于5的有菌株N3、N8、N14、N21、N32，菌株N14的透明圈直徑與菌落直徑的比值最大為9.2。經脫脂牛奶培養(yǎng)基平板篩選得到的26株蛋白質降解菌，透明圈直徑與菌落直徑的比值在1.3～4.5，其中菌株N12的比值最大為4.5，降解能力最強。從淀粉培養(yǎng)基平板上篩選到的35株淀粉降解菌，其透明圈直徑與菌落直徑的比值在1.3～4.3，其中菌株N32的比值最大為4.3。部分菌株的降解效果見圖1。

表2 纖維素、蛋白質、淀粉降解菌透明圈直徑與菌落直徑的比值大小Table 2 The diameter ratio of the transparent circle to the colony of cellulose, protein, starch decomposing microorganisms

續(xù)表2 Continued table 2

菌株編號D1D2D3菌株編號D1D2D3N87.02.22.0N291.5﹣3.6N92.72.81.3N305.01.54.0N112.0﹣﹣N314.0﹣3.3N121.64.51.7N326.52.44.3N131.0﹣﹣N334.01.82.0N149.22.51.3N342.51.81.7N152.0﹣2.6N354.51.63.6N164.02.61.4N363.01.31.9N182.01.82.0N372.0﹣2.0N193.32.02.4N384.0﹣2.2N203.02.03.2N392.71.31.8N216.71.93.1N405.01.53.0N223.21.53.0

注：D1，纖維素降解菌透明圈直徑與菌落直徑的比值；D2，蛋白降解菌透明圈直徑與菌落直徑的比值；D3，淀粉降解菌透明圈直徑與菌落直徑的比值。

通過將不同菌株點種到油脂培養(yǎng)基上，依據菌落周圍顏色是否變紅，共篩選到25株油脂降解菌。各降解菌株在油脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，菌落周圍出現(xiàn)紅色斑點(表3)，其中菌株N12、N16、N19、N20菌落周圍深紅色水解圈較大(圖2)，初步判斷這4株菌的油脂降解能力較強；其余菌株菌落周圍的深紅色水解圈較小，或紅色斑點緊挨著菌苔不形成水解圈。

在無菌操作臺上，不接菌的空白高溫滅菌牙簽在H2O2中不產生氣泡；使用高溫滅菌的牙簽挑取少量菌體分別涂抹在滴有1滴3 % H2O2中，先后出現(xiàn)不同數(shù)量的氣泡(表3)，其中菌株N9在H2O2中產生的氣泡速率最快(圖3)，初步判斷菌株N9分解H2O2的能力較強。

2.2 森林土壤多功能菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 從森林土壤中共分離到可培養(yǎng)細菌40株，其中篩選出能夠同時降解纖維素、蛋白質、淀粉、油脂和H2O2的多功能菌株21株，21株可培養(yǎng)多功能細菌的菌體形態(tài)特征見表4。

A.剛果紅培養(yǎng)基；B.脫脂牛奶培養(yǎng)基；C.淀粉培養(yǎng)基A. Congo red medium; B. Skim milk medium; C. Starch medium圖1 菌株在選擇培養(yǎng)基上的降解效果Fig.1 The degradation effect of the strains on the selection medium

表3 菌株對油脂和過氧化氫的降解結果Table 3 The result of bacteria degrading oil and hydrogen peroxide

注：“﹣”表示無；“﹢”表示少；“﹢﹢”表示多；“﹢﹢﹢”表示很多。

2.2.2 菌株系統(tǒng)發(fā)育分析 通過對21株可培養(yǎng)多功能細菌進行16S rDNA基因測序，并將測序結果在GenBank中用blast進行同源性比對，比對結果見表5。其中，菌株N19與芽孢桿菌屬Bacillussp.(HM567046.1)、N21與解淀粉類芽孢桿菌Paenibacillusamylolyticus(AB115960.1)的序列相似率達99 %，構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)后位于同一分支上，結合其菌體特征可知，菌株N19、N21分別屬于芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬。N8和N34與 泛菌屬Pantoeasp.(KJ865571.1)的序列相似性最大，但只達66 %，這就顯示出采樣區(qū)森林土壤微生物種群可能存在新的物種資源[23]。另外，從圖3可知，其他17株多功能細菌均屬于假單胞菌屬，其中， N3、N14和N20；N23、N39和N40；N12、N16、N22和N30分別位于同一分支，相互之間親緣關系高達99 %，可以確定它們分別屬于同一個種，但其各自之間的形態(tài)特征有所不同(表4)，可見它們很可能是同一個種下的不同菌株[24]；N26與惡臭假單胞菌Pseudomonasputida(KF285966.1)、N32與Pseudomonasvranovensis(KC246044.1)、N36與米氏假單胞菌Pseudomonasmigulae(KP762559.1)的序列相似率達97 %以上，構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)后，分別位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支上；N24與Pseudomonassp.(JQ977479.1)達100 %，構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)后位于同一分支上。

D.油脂降解；E.過氧化氫降解D. Oil degradation;E. Hydrogen peroxide degradation圖2 部分菌株的油脂降解和過氧化氫降解結果Fig.2 The result of some bacteria degrading oil and hydrogen peroxide

表4 21株土壤可培養(yǎng)多功能細菌的形態(tài)特征Table 4 Morphological characteristics of 21 Soil cultured bacteria

綜上所述，經16S rDNA基因測序及同源性比對分析，21株可培養(yǎng)多功能資源菌歸屬于4個屬，其中絕大多數(shù)屬于假單胞菌屬(17株，80.95 %)，表明假單胞菌屬是采樣區(qū)森林土壤的絕對優(yōu)勢菌群。

表5 森林土壤可培養(yǎng)多功能細菌測序比對結果Table 5 The result of blast by Genbank of the multifunctional strains in forest soil

續(xù)表5 Continued table 5

菌株編號相似菌株相似度登錄號N21Paenibacillus amylolyticus99AB115960.1N22Pseudomonas sp. CCOS 86499LT009706.2N23Pseudomonas sp. GT 4-0499KM253092.1N24Pseudomonas sp. Bma1100JQ977479.1N26Pseudomonas putida98KF285966.1N30Pseudomonas sp. CCOS 86499LT009706.2N32Pseudomonas vranovensis99KC246044.1N33Pseudomonas sp. EA_S_5499KJ642298.1N34Pantoea sp. MSc-166KJ865571.1N35Pseudomonas sp.strain Hc02598KY465519.1N36Pseudomonas migulae99KP762559.1N39Pseudomonas sp.AT-A-S699KU671213.1N40Pseudomonas sp.AT-A-S699KU671213.1

圖3 森林土壤多功能細菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic tree of the multifunctional strains in forest soil

3 討 論

土壤作為最豐富的菌種資源庫，所含微生物數(shù)量巨大，以細菌居多[25]。馬麗艷木·阿木東等[26]使用LB和TSA兩種培養(yǎng)基從新疆沙雅縣極端干旱的胡楊林土壤中共分離出57株可培養(yǎng)細菌，分別屬于13個屬，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)為主要的優(yōu)勢細菌屬。何小麗等[27]采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，從上海市大蓮湖池杉林濕地土壤中共分離得到20個菌落形態(tài)不同的菌株，分別屬于9個屬，其中芽胞桿菌屬(Bacillus)和不動桿菌屬(Acinetobacter)細菌是優(yōu)勢菌。由此可見，因環(huán)境差異，不同類型不同地區(qū)土壤中的可培養(yǎng)細菌種類數(shù)量、優(yōu)勢菌群不盡相同。此外，李淼等[28]采用NM、TSA、R2A 3種培養(yǎng)基從我國高海拔凍土區(qū)的4個土壤樣品中分離得到102株細菌，經16S rRNA 基因部分序列分析表明它們歸屬于5個屬，其中優(yōu)勢菌群為假單胞菌屬(Pseudomonas)。相比之下，本文研究結果表明了該地區(qū)高山森林土壤具有較高的可培養(yǎng)細菌多樣性，并且在分解枯枝落葉中發(fā)揮重要作用的優(yōu)勢菌群與我國其他高海拔地區(qū)的研究結果[28]一致，這可能與這類細菌適應低溫環(huán)境有關。本研究只選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進行細菌分離，可能導致獲得細菌的數(shù)量和種屬有限，采用更多的培養(yǎng)基或改良培養(yǎng)基等進一步分離土壤微生物菌種資源，以及結合宏基因組學等免培養(yǎng)分析技術可促進對高山森林土壤微生物多樣性特征的認識。

由于微生物肥料等土壤微生物制劑在生產生活中廣泛使用及巨大作用[18,30-31]，人們越來越偏向從不同類型土壤尤其是特殊環(huán)境土壤中篩選功能性菌株加以應用。比如：李靜等[32]通過篩選得到15株纖維素降解菌，構建復合菌系來研究其對秸稈的降解，且降解效果較好。賀軍軍等[12]從甘蔗渣堆積場分離的54個菌株中篩選出21個有降解淀粉能力的菌株，并借此研究甘蔗渣更高效的處理方法。孟靜等[32]從受油脂污染的土壤中分離出13株細菌，篩選得到9株油脂降解菌，通過優(yōu)化降解條件以達到高效處理油脂廢水的目的。但當前高山森林土壤中功能性菌株的分離、篩選及應用研究相對較少；本研究從高山森林土壤分離得到的40株可培養(yǎng)細菌中，具有過氧化氫降解功能、纖維素降解功能、蛋白降解功能、淀粉降解功能和油脂降解功能的菌株分別占100 %、92.5 %、65 %、87.5 %和62.5 %，功能菌數(shù)量多、降解能力較高。本研究篩選到的纖維素降解菌中，透明圈與菌落直徑比大于5的菌株有5株，相比濕地[33]等類型土壤，高山森林土壤中纖維素降解菌的降解能力更強，猜測可能與高山森林土壤存在凍融期，土壤微生物降解森林下枯枝落葉層周期短有關。

隨著人類大規(guī)模生產生活的需要，微生物菌種資源的基礎及開發(fā)應用研究逐步受到重視，而高山森林土壤中資源菌的分離、篩選及開發(fā)作為微生物菌種資源研究的重要方向，其研究尚顯不足。本文通過對高山森林土壤中可培養(yǎng)細菌的分離，以及初步篩選已分離細菌的多種降解功能，有助于初步了解森林土壤微生物的產酶活性；同時通過對降解纖維素、蛋白質、淀粉、油脂和過氧化氫的21株多功能資源菌株的分子鑒定，初步認識了高山森林土壤中功能性資源菌株的多樣性和群落結構?？梢哉f，本文研究成果為高山森林土壤資源菌的應用奠定了較好的研究基礎，進一步研究方向主要在于功能性資源菌株復合菌系的構建以及它們在提高農業(yè)耕地土壤肥力和改善農作物品質方面的應用及效果研究。

4 結 論

本研究從四川汶川的高山森林土壤中分離得到細菌40株，從中篩選出能夠同時降解纖維素、蛋白質、淀粉、油脂及過氧化氫的菌株共21株，其中篩選到的纖維素降解菌中，透明圈與菌落直徑比大于5的菌株有5株。經鑒定這21株多功能資源菌歸屬于4個屬，其中絕大多數(shù)屬于假單胞菌屬(17株，80.95 %)，是該地區(qū)土壤的絕對優(yōu)勢菌群。本文研究結果表明該地區(qū)高山森林土壤具有較高的可培養(yǎng)細菌多樣性，其中的功能菌數(shù)量多且降解能力較高，因此，該結果在高山森林土壤資源菌的應用方面奠定了較好的研究基礎。

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