何洪炳，蔡明成，梁小虎，賴松家(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院遺傳所，四川 成都 611130)

【研究意義】兔流行性腸炎病(Epizootic rabbit Enteropathy，ERE)[1-2]的病因復(fù)雜，根據(jù)病原體的類型腸道疾病被分為特異性腸炎(Specific Enteropathies)和非特異性消化道紊亂(Non-Specific Digestive Disorders，NSDD)。特異性腸炎主要來源一些特定病原微生物，如細菌、病毒和毒素、寄生蟲等。非特異性消化道紊亂無特定致病病原微生物，病因十分復(fù)雜，飼養(yǎng)管理不當(dāng)、日糧纖維不當(dāng)、環(huán)境溫濕度的變化引起的應(yīng)激等均可誘發(fā)腸炎。已有研究表明，在飼養(yǎng)環(huán)境和管理良好的條件下，日糧中粗纖維含量和種類是誘發(fā)家兔非特異性消化道紊亂疾病的重要因素[3]?！厩叭搜芯窟M展】圓小囊是家兔特有的免疫淋巴器官，位于家兔回腸末端，屬于腸道的組成部分，呈膨大結(jié)構(gòu)，具有消化、免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌等功能。已有的研究表明，家兔圓小囊能特異性攝取腸腔內(nèi)的生物大分子和微生物到淋巴細胞中[4]，參與整個腸道免疫調(diào)控。圓頂上皮(dome epithelium)是一個傳遞抗原的通道，作為圓小囊重要的免疫組成部分，在傳遞抗原的同時也可以抵抗和防止抗原侵入組織深部淋巴組織，在腸道免疫防御中發(fā)揮重要的作用[5-8]。MicroRNAs是一種長度約為23 bp的單鏈非編碼RNA[9]，可靶向mRNA的3’端非翻譯區(qū)(UTR)發(fā)揮調(diào)控作用，不完全靶向抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯，完全靶向則引發(fā)降解。MicroRNAs可以參與調(diào)節(jié)哺乳動物的生長發(fā)育、細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡等生命活動[10-13]。人類基因組中預(yù)測并鑒定了超過1000 miRNAs，調(diào)節(jié)成千上萬的人類蛋白編碼基因[14-15]。近年來，miRNAs被認為是調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因子，miRNAs在系統(tǒng)性紅斑狼瘡[16]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[17]、銀屑病[18]和炎癥性腸炎病(Inflammatory bowel disease，IBD)[19]存在表達差異且與自身免疫病顯著相關(guān)。通過對人IBD外周血和各個組織的miRNAs測序表明miRNAs參與IBD的調(diào)節(jié)[20]。在體外細胞和誘導(dǎo)腸炎的模式動物中，也驗證了一些關(guān)鍵的miRNAs可調(diào)控信號通路參與IBD發(fā)病過程。綜上表明，miRNAs在人IBD中存在差異表達，暗示其在腸炎中起重要的調(diào)節(jié)作用，同時也可以作為分子標記預(yù)防和治療腸炎?！颈狙芯壳腥朦c】本研究通過構(gòu)建家兔非特異性消化道紊亂型腸炎模型，鑒定不同腸炎程度家兔中圓小囊miR-130b的表達趨勢，同時利用生物信息學(xué)軟件分析其靶基因，研究miRNA-130b與靶基因之間的聯(lián)系，探討miR-130b在家兔腸炎中的調(diào)控模式。【擬解決的關(guān)鍵問題】為家兔腸炎的預(yù)防與治療提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物模型構(gòu)建

本實驗選用60只49日齡的健康新西蘭兔作為試驗兔，10只飼喂正常飼料，50只飼喂低纖維飼料(纖維素CF 9 %、木質(zhì)素ADF 13 %)誘導(dǎo)非特異性消化道紊亂型腸炎。試驗前預(yù)飼喂7 d適應(yīng)環(huán)境，正式試驗14 d，日糧飼喂量為自由采食的85 %，正式試驗期每天觀察試驗兔臨床表現(xiàn)1次，并記錄試驗兔的臨床癥狀。70日齡時，通過耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉致死(符合動物福利保護法)，進行病理學(xué)檢查記錄和樣品的采集。

1.2 樣品的采集

采集圓小囊組織樣本1 g并用錫箔紙包裹置于-80 ℃液氮中用于RNA的抽提。組織切片樣本的采集，取試驗兔的空腸、結(jié)腸(取腸段相同的部位)，用4 %多聚甲醛浸泡固定，在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院制作切片。

1.3 臨床觀察、解剖癥狀評分和切片觀察

觀察試驗兔的飲食、飲水、腹脹情況及排泄物狀態(tài)等，臨床患病指標的判定和記錄參照Bennegadi的方法[21]。解剖死亡兔，觀察并記錄其消化道臨床癥狀。主要觀察各腸段、腸系膜出血情況、腸系膜淋巴結(jié)、圓小囊等免疫器官的變化。切片用HE染色后在高倍視野中(200×)觀察每張切片，對隱窩、粘膜固有層、上皮細胞、凋亡細胞及杯狀細胞等的變化。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

采用Trizol法提取圓小囊的總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit 貨號：1604342A和Takara, PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraer 貨號AK4002)進行miRNA和mRNA的反轉(zhuǎn)錄，得到各自的cDNA。利用miRBase和NCBI等在線工具，得到該miRNA的成熟序列，采用加尾法設(shè)計miRNA的引物，由成都擎科生物科技有限公司合成。下游引物是試劑盒自帶，內(nèi)參用試劑盒自帶U6作為引物。采用SYBR?Green I進行熒光定量，參照試劑盒說明書進行(Takara 貨號：AK9801)，10 μl體系：5 μl SYBR?Green I，0.4 μl Forward、Reverse引物，3.2 μl ddH2O，1μl cDNA。

1.5 靶基因的預(yù)測

利用Targetscan、miRBase和miRWalk等生物信息學(xué)在線工具預(yù)測和用DAVID信號通路富集篩選出miR-130b的靶基因。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

實驗熒光定量結(jié)果用Excel初步統(tǒng)計并采用2-△△ct進行分析，運用SAS8分析軟件進行顯著性分析，結(jié)果采用“平均值±標準差”表示。用SigmaPlot軟件計算STAT3和miR-130b表達量的皮爾遜相關(guān)性。

表1 臨床評分(CSS)Table 1 Clinical score (CSS)

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床觀察和解剖癥狀評分

每天對試驗兔采食情況、排泄物、腹脹情況進行觀察記錄(表1)；臨床癥狀的評分標準為(clinical symptom score, CSS)：0分，無癥狀；1分，采食量變少，糞便呈串連狀；2分，腹部臌脹、腹瀉嚴重、盲腸有結(jié)塊等有明顯的患腸炎現(xiàn)象。預(yù)飼期因環(huán)境應(yīng)激，健康對照和誘導(dǎo)組均死去1只，正式試驗期誘導(dǎo)組因嚴重腹瀉死亡10只。去除因患病死去12只，最終得到對照健康組9只、誘導(dǎo)健康組10、誘導(dǎo)輕微組9只、誘導(dǎo)嚴重組20只。

解剖癥狀觀察評分標準(GLS)見表2：無癥狀， 0分；1個腸段出現(xiàn)脹氣，內(nèi)有大量粘液等，1分； 2個以上腸道脹氣、腸壁變厚、大量粘液或腸系膜出血等，2分。除去因患病嚴重或其他原因死去12只(同上)，最終得到對照健康組9只、誘導(dǎo)健康組10、誘導(dǎo)輕微組11只、誘導(dǎo)嚴重組18只。

2.2 切片觀察

組織病理學(xué)切片觀察與分析發(fā)現(xiàn)，在空腸和結(jié)腸炎癥組織中，都存在組織損傷及炎性損傷、隱窩結(jié)構(gòu)異常。在空腸中并未發(fā)現(xiàn)淋巴細胞和紅細胞的內(nèi)容物，但存在局部上皮細胞壞死、溶解，而且伴有中性粒細胞的侵潤(圖1 B空腸嚴重，紅色箭頭)；粘膜固有層、粘膜下層結(jié)締組織間質(zhì)有炎癥細胞的侵潤(圖1 B空腸嚴重，黑色箭頭)，肌層纖維發(fā)生不同程度的溶解，肌膜有輕度溶解，伴有炎性細胞的侵潤(圖1 B空腸嚴重，黃色箭頭)。

在結(jié)腸嚴重組切片中，可見其隱窩結(jié)構(gòu)異常，隱窩變大變空，且杯狀細胞部分融合(圖1 D結(jié)腸嚴重，紅色箭頭)；上皮細胞的形態(tài)發(fā)生變化，有壞死溶解現(xiàn)象，伴有炎癥粒細胞的侵潤(圖1 D結(jié)腸嚴重，黃色箭頭)。肌層纖維發(fā)生不同程度的溶解，肌膜有輕度溶解，伴有炎性細胞的侵潤(圖1 D結(jié)腸嚴重，黑色箭頭)。

通過對試驗兔臨床癥狀，解剖學(xué)癥狀和切片的觀察將其分為健康對照組、誘導(dǎo)健康組、輕微組、嚴重組。

表2 剖檢評分(GLS)Table 2 Score of necropsy (GLS)

(A)空腸健康對照病理切片(H.E.200X)；(B)空腸嚴重組病理切片(H.E.200X)； (C)結(jié)腸健康對照病理切片(H.E.200X)；(D)結(jié)腸嚴重對照病理切片(H.E.200X)圖1 組織病理學(xué)切片 Fig.1 Histopathological section

圖2 生物學(xué)信息預(yù)測miR-130b靶基因為STAT3 Fig.2 Biological information predicts that the target gene of miR-130b is STAT3

2.3 生物信息學(xué)預(yù)測miR-130b靶基因

對miR-130b靶基因進行生物信息學(xué)預(yù)測，用DAVID進行炎癥相關(guān)的基因富集，通過篩選，STAT3可作為miR-130b的靶基因(圖2)。

2.4 定量檢測結(jié)果

本試驗引物信息見表3。

表3 試驗引物信息Table 3 Tested primer information

注： ‘*’表示該基因為內(nèi)參基因。

Note: ‘*’ said the gene as a reference gene.

(A)IL-22;(B)TNF-α;(C)IL-18* 表示0.01≤ P ≤ 0.05； ** 表示 P <0.01； *** 表示0.001≤ P ≤0.005； **** 表示 P <0.001圖3 炎癥因子在圓小囊中的表達量Fig.3 Expression of inflammatory factors in sacculus

(A)miR-130在圓小囊中的表達量；(B)STAT3在圓小囊中的表達量 * 表示0.01≤ P≤0.05； ** 表示 P <0.01； *** 表示0.001≤ P≤ 0.005； **** 表示 P <0.001圖4 miR-130和STAT3在圓小囊中的表達量Fig.4 Expression of miR-130 and STAT3 in the sacculus rounds

通過qPCR檢測，發(fā)現(xiàn)在家兔圓小囊中，IL-22、TNF-α和IL-18的表達隨著患腸炎程度的加重呈上調(diào)趨勢(圖3)。IL-22和TNF-α在嚴重組的表達量極顯著高于對照健康(P<0.01)，同時輕微組和誘導(dǎo)健康組也顯著高于健康對照組(P<0.05)。IL-18在嚴重組的表達量極顯著高于健康對照組和輕微組(P<0.01)，顯著高于誘導(dǎo)健康組(P<0.05)，而健康對照組、誘導(dǎo)健康組和輕微組表達無顯著差異。

不同腸炎程度的家兔圓小囊中miR-130b的表達量研究發(fā)現(xiàn)，miR-130b隨著患腸炎程度的加深表達下調(diào)趨勢，誘導(dǎo)健康組、輕微組和嚴重組都極顯著低于健康對照組(P<0.01)，并且，輕微患病組和嚴重患病組也極顯著低于誘導(dǎo)健康組(P<0.01)。輕微組和嚴重組之間差異不顯著(圖4 A)。

同時，利用RT-qPCR技術(shù)檢測了靶基因STAT3在圓小囊各種患腸炎狀態(tài)下的表達量，發(fā)現(xiàn)在圓小囊中，STAT3隨著腸炎嚴重程度的加深而表達上升。嚴重組極顯著高于健康對照組、誘導(dǎo)健康組和輕微組(P<0.01)，且輕微組極顯著高于健康對照組(P<0.01)，誘導(dǎo)健康組和輕微組差異不顯著，健康對照組和誘導(dǎo)健康組差異不顯著(圖4 B)。

圖5 患腸炎圓小囊組織中STAT3與miR-130b的相關(guān)性分析Fig.5 Analysis of the correlation between STAT3 and miR-130b in the tissues of enteritis sacculus

2.5 相關(guān)性分析

由圖5可以看出，SigmaPlot軟件計算所有STAT3和miR-130b表達量的皮爾遜相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在家兔腸炎圓小囊中，miR-130b和STAT3的表達量稱顯著的負相關(guān)(r=-0.635，P<0.01)。

3 討 論

家兔腸炎可能由多種因素引起，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠引起特異性腸炎的病原微生物主要有大腸桿菌、病毒、真菌等，其中大腸桿菌(Esherichiacoli)引起的腸炎最為普遍[22-23]。由日糧粗纖維不適引起的腹瀉，外界應(yīng)激性引起的腹瀉，出血性腸炎和兔流行性腸炎等疾病[24; 21-22]為非特異性腸炎。家兔日糧中的纖維對家兔來說可促進消化系統(tǒng)的發(fā)育，增強胃腸道蠕動等功能有尤為重要的作用。有研究表明日糧中纖維素(CF)<12 %、木質(zhì)素(ADF)<15 %則會引起家兔非特異性免疫[25-26]。

本試驗利用低纖維誘導(dǎo)家兔非特異性消化道紊亂型腸炎模型，根據(jù)家兔臨床癥狀、解剖病理學(xué)評分發(fā)現(xiàn)在腸炎發(fā)生過程中，家兔會隨著炎癥程度的加深出現(xiàn)不同的臨床癥狀，而且其腸道也會發(fā)生不同程度的病變。切片觀察發(fā)現(xiàn)空腸和結(jié)腸的隱窩變大且上皮細胞和杯狀細胞溶解出現(xiàn)不同程度的溶解，粘膜固有層、粘膜下層的結(jié)締組織間質(zhì)存在大量的炎癥細胞的侵潤。炎癥細胞主要包括巨噬細胞、粒細胞(GRAN)、淋巴細胞等，它們的持續(xù)存在導(dǎo)致了腸炎反應(yīng)的持續(xù)，試驗結(jié)果低纖維日糧可以誘發(fā)家兔非特異性消化道紊亂型腸炎的發(fā)生，各腸段病理學(xué)變化與家兔感染性實驗(ERE)相似[27]。炎癥性細胞可以上調(diào)腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor-α)[28]、IL-18[29]和IL-22[30]影響腸炎的發(fā)生，其研究結(jié)果與本實驗結(jié)果一致。通過臨床癥狀和解剖學(xué)評分及病理學(xué)切片的觀察，和檢測炎癥因子的表達情況，能夠充分說明本試驗誘導(dǎo)腸炎模型成功，樣本可進行下一步試驗。

近年來，大量研究表明miRNAs在腸炎組織中存在異常表達，并證實miRNAs參與腸炎的發(fā)生。wu等[20]檢測了miRNAs在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達差異，發(fā)現(xiàn)miR-16、miR-21、miR-23a等9個microRNAs表達上調(diào)，miR-192、miR-375和miR-422b表達下調(diào)。這表明miRNAs在腸炎的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，miR-130b在家兔低纖維日糧誘導(dǎo)的非特異性消化道紊亂型腸炎的兔圓小囊中表達均明顯下調(diào)，提示miR-130b可能是參與腸炎發(fā)生的新的因子。miR-130b被越來越多的研究證實在多種疾病中發(fā)揮重要的作用。在胃癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等的發(fā)生和發(fā)展研究中發(fā)現(xiàn)， miR-130b可促進癌細胞的增殖和侵襲[31-33]。另外，miR-130b下調(diào)可以導(dǎo)致活化的成纖維細胞和上皮-間充質(zhì)串?dāng)_促進失調(diào)，進而影響肺腺上皮細胞IGF-1的分泌，提示miRNA-130b的調(diào)控作用可預(yù)防肺纖維化[34]。這些研究結(jié)果充分說明miR-130b廣泛參與細胞各種生命活動。

為了更深一步探索miR-130b參與家兔非特異性消化道紊亂型腸炎的發(fā)病機制，為家兔腸炎治療奠定知識基礎(chǔ)，本研究通過生物信息學(xué)在線工具預(yù)測及分析，得到STAT3可作為miR-130b的直接靶基因，通過qPCR定量發(fā)現(xiàn)，在患腸炎的家兔圓小囊組織內(nèi)miR-130b和靶基因STAT3的表達量呈顯著負相關(guān)，且STAT3隨患病程度加深而升高。家兔和人源性的miR-130b及STAT3的3'UTR均十分保守，預(yù)測結(jié)果為且miR-130b與STAT3的3'UTR區(qū)有一段相互匹配，存在miR-130b直接調(diào)控STAT3直接調(diào)控的可能性。有研究表明，STAT3缺失會導(dǎo)致斑馬魚脊柱畸形和免疫障礙[35]，Gang Zhao等[36]發(fā)現(xiàn)miR-130b在人胰腺癌組織對比癌旁組織的表達量顯著下調(diào)，STAT3在胰腺癌組織中表達顯著上調(diào)，兩者之間存在顯著的負相關(guān)，并用雙熒光素酶報告證實了miR-130b可直接靶向STAT3，證明STAT3可作為miR-130b的靶基因，參與胰腺癌的發(fā)生，與本試驗結(jié)果一致。另外有研究表明IL-6可以通過JAK/STAT3信號通路活化STAT3，活化的STAT3可激活相關(guān)炎癥通路，而抑制IL-6的信號可導(dǎo)致減少STAT3活化，進而減少IL-10的表達，由于IL-10缺乏的缺乏進而導(dǎo)致的結(jié)腸炎的發(fā)生[37]。有研究表明，敲除小鼠IL-6基因后再誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)腸炎的實驗中，JAK//STAT信號通路中，活化的STAT3水平隨著炎癥程度的降低而降低，表明了STAT3的活化是炎癥發(fā)生的重要誘因[38]。多項研究表明，在IBD患者炎癥腸粘膜中，通過熒光定量和蛋白檢測發(fā)現(xiàn)總的STAT3和磷酸化的STAT3水平均高表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)磷酸化的STAT3水平與炎癥嚴重程度呈正相關(guān)[39-40]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)抑制IL-6 /STAT3的級聯(lián)效應(yīng)能導(dǎo)致獲得性免疫介導(dǎo)的結(jié)腸炎被抑制[41]。 Koukos 等[42]對UC兒童和試驗誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的實驗中發(fā)現(xiàn)，miR-124在炎癥組織中表達量顯著下調(diào)，STAT3和它下游基因的表達水平均顯著上調(diào)。同時他們也證明，下調(diào)miR-124可以增加STAT3的表達和從而促進炎癥和UC腸炎病的發(fā)生。以上各項研究都表明了IL-6/STAT3信號通路參與腸炎的發(fā)生過程，STAT3是參與炎癥發(fā)生的重要調(diào)控因子。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，STAT3的3’-UTR區(qū)可能是家兔miR-130b的潛在的作用靶點，與家兔患非特異性消化道紊亂型腸炎顯著相關(guān)，在家兔患非特異性消化道紊亂型腸炎的持續(xù)過程中miR-130b顯著下調(diào)，可能增加STAT3的表達和活性，促進下游基因的轉(zhuǎn)錄，進而促進炎癥的發(fā)生。這項研究也暗示了miR-130b在家兔腸炎的發(fā)生和發(fā)展中有重要的調(diào)節(jié)作用?？偟膩碚f，miR-130b可能作為家兔炎癥發(fā)生的標志物和抑制劑。

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