覃國忠 史鵬亮 張 震 霍少川

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000)

相關(guān)研究認(rèn)為，IncRNA與miRNA存在相互調(diào)控機(jī)制，IncRNA可通過內(nèi)源性吸附miRNA來調(diào)控基因表達(dá)〔1〕；同時(shí)miRNA能夠綁定IncRNA，在多種RNA結(jié)合蛋白共同幫助下，誘發(fā)miRNA介導(dǎo)的沉默機(jī)制，調(diào)節(jié)IncRNA的穩(wěn)定性〔2〕。研究已證實(shí)，miR-21與GAS5 IncRNA之間的反饋調(diào)控機(jī)制在乳腺癌、骨性關(guān)節(jié)炎等多種疾病中均有存在〔1〕。因此，人椎間盤退變中過程中miR-155能否通過IncRNA參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)值得探究。本次實(shí)驗(yàn)先通過IncRNA芯片檢測(cè)，明確miR-155過表達(dá)后椎間盤髓核細(xì)胞IncRNA表達(dá)情況，篩選細(xì)胞凋亡相關(guān)IncRNA，之后對(duì)篩選出的GAS5 IncRNA進(jìn)行初步作用機(jī)制分析。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 原代人椎間盤細(xì)胞購于美國典型微生物菌種保藏中心；hsa-miR-155過表達(dá)慢病毒載體購于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；Cy3、Cy5熒光染料購于天津百螢生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、RIPA蛋白裂解液均購于上海邦奕生物科技有限公司；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗體、B淋巴細(xì)胞瘤/白血病(Bcl)-2抗體及內(nèi)參β-actin抗體購于北京百奧萊博科技有限公司。

1.2方法

1.2.1髓核細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將凍存的原代人椎間盤細(xì)胞水浴復(fù)溫，2 000 r/min離心10 min，2 ml髓核細(xì)胞專用培養(yǎng)基重懸，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)蘇，48 h換液一次，顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度超過80%時(shí)用胰酶消化后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)研究組和陰性對(duì)照組，分別設(shè)3個(gè)平行組，標(biāo)記為T1～T3和N1～N3。取對(duì)數(shù)期髓核細(xì)胞，以1×106/L接種到培養(yǎng)皿中，按Moi值70的病毒量轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞，混勻后放入培養(yǎng)箱中孵育，6 h換液一次，每24 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染后48 h換液，96 h在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光率>95%后，每個(gè)樣品中滴加1 ml Trizol溶液提取細(xì)胞總RNA，低溫凍存。

1.2.2miR-155過表達(dá)后髓核細(xì)胞IncRNA芯片檢測(cè) 使用Agilent雙通道芯片平臺(tái)，將T1～T3和N1～N3互配成3對(duì)后進(jìn)行芯片比較。分別用Cy3、Cy5熒光染料標(biāo)記相同點(diǎn)陣上雜交的兩個(gè)樣品，標(biāo)記完成經(jīng)純化處理后放入芯片掃描儀得到圖像，使用相應(yīng)的數(shù)據(jù)提取軟件從中提取信息，記錄兩種熒光燃料信號(hào)值，篩選出差異性表達(dá)的IncRNA。

1.2.3篩選出的IncRNA過表達(dá)慢病毒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 篩選出的差異性IncRNA過表達(dá)慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成并測(cè)序驗(yàn)證。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)研究組和陰性對(duì)照組，按1×106/L密度接將髓核細(xì)胞種到6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度>60%，按Moi值70的病毒量轉(zhuǎn)染，混勻后放入培養(yǎng)箱中孵育，每24 h熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和轉(zhuǎn)染率，96 h后收集兩組髓核細(xì)胞，提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)差異性IncRNA表達(dá)情況并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡情況 兩組髓核細(xì)胞消化離心后，以1×107/L密度重懸在190 μl結(jié)合緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC，室溫下避光反應(yīng)15 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清后用190 μl結(jié)合緩沖液中重懸細(xì)胞，加入10 μl PI染色液，4℃避光反應(yīng)20 min，1 h內(nèi)放入流式細(xì)胞儀中檢測(cè)。

1.2.5Western印跡法檢測(cè)Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)情況 細(xì)胞蛋白裂解液提取兩組髓核細(xì)胞總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，TBST洗膜后滴加Caspase-3抗體(1∶500稀釋)、Bcl-2抗體(1∶1 000稀釋)、β-actin抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，滴加Bcl-2、Caspase-3抗兔二抗和β-actin抗小鼠二抗，4℃孵育6 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，采集圖像并用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-155過表達(dá)后髓核細(xì)胞IncRNA芯片分析 經(jīng)IncRNA芯片分析共發(fā)現(xiàn)630個(gè)差異表達(dá)IncRNA，其中381個(gè)IncRNA表達(dá)上調(diào)、249個(gè)IncRNA表達(dá)下調(diào)(見圖1)。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：Fc值>2倍且P<0.05。基因組數(shù)據(jù)庫(Ensemble)顯示，GAS5 IncRNA共包含有30個(gè)轉(zhuǎn)錄本，本次IncRNA芯片分析獲得了13個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況，均呈下降趨勢(shì)，其中GAS5-016轉(zhuǎn)錄下調(diào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fc值≥1.5，P<0.05)。

2.2髓核細(xì)胞過表達(dá)GAS5 IncRNA后細(xì)胞凋亡情況 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，陰性對(duì)照組髓核細(xì)胞早期凋亡率為(36.51±2.93)%，GAS5 IncRNA過表達(dá)組髓核細(xì)胞早期凋亡率為(43.75±3.34)%；GAS5 IncRNA過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后髓核細(xì)胞早期凋亡率明顯增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3過表達(dá)GAS5 IncRNA后Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)情況 髓核細(xì)胞過表達(dá)GAS5 IncRNA后，陰性對(duì)照組和GAS5 IncRNA過表達(dá)組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.63±0.41、3.81±0.75；Bcl-2蛋白表相對(duì)表達(dá)量分別為7.95±0.81、2.68±0.24。GAS5 IncRNA過表達(dá)組Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照組，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 兩組IncRNA表達(dá)差異聚類分析圖

圖2 髓核細(xì)胞過表達(dá)GAS5 IncRNA后細(xì)胞凋亡情況

圖3 Western印跡法檢測(cè)Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中采用miR-155慢病毒載體過表達(dá)人椎間盤細(xì)胞髓核細(xì)胞，使用IncRNA表達(dá)譜芯片分析顯示，GAS5 IncRNA各轉(zhuǎn)錄本表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，提示miR-155對(duì)人椎間盤細(xì)胞髓核細(xì)胞GAS5 IncRNA表達(dá)有負(fù)向調(diào)控作用。同時(shí)，IncRNA表達(dá)譜芯片中共檢測(cè)出13個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下調(diào)，但僅GAS5-016轉(zhuǎn)錄本下調(diào)有顯著差異，提示miR-155在人椎間盤細(xì)胞髓核細(xì)胞GAS IncRNA表達(dá)調(diào)控中，可能存在特定的一級(jí)序列特征，需進(jìn)一步采用熒光素酶報(bào)告基因等檢測(cè)方法探索二者可能的結(jié)合位點(diǎn)。

椎間盤內(nèi)細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)通路包括：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路、線粒體途徑、死亡受體通路，分別在椎間盤不同退變期發(fā)揮調(diào)控髓核細(xì)胞凋亡的作用〔3〕。線粒體在Caspase依賴性和非依賴性凋亡通路中起到重要作用，多種線粒體蛋白均可調(diào)控內(nèi)源性和外源性凋亡通路〔4〕。Caspase蛋白酶和Bcl-2蛋白是哺乳動(dòng)物中兩個(gè)進(jìn)化保守蛋白家族，其中Caspase蛋白酶可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展〔5〕；Bcl-2蛋白可調(diào)控線粒體生理結(jié)構(gòu)的完整性，抑制線粒體中cyt-c釋放到胞質(zhì)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡〔6〕。本次研究中，GAS5 IncRNA過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后髓核細(xì)胞早期凋亡率明顯增加；進(jìn)一步分析顯示，GAS5 IncRNA過表達(dá)后明顯上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào)蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活人椎間盤細(xì)胞髓核細(xì)胞內(nèi)的線粒體凋亡通路，促進(jìn)髓核細(xì)胞凋亡。說明GAS5 IncRNA在髓核細(xì)胞中調(diào)控促凋亡因子和抑凋亡因子之間的平衡，其表達(dá)水平?jīng)Q定了髓核細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的敏感性；同時(shí)GAS5 IncRNA過表達(dá)介導(dǎo)的凋亡過程中可能通過miR-155發(fā)揮作用，二者的相互調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

4 參考文獻(xiàn)

1張 鈺，劉志禮，黃山虎，等.線粒體與椎間盤退變〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(17)：4393-6.

2陳宇飛.miR-129-5p在椎間盤退變中的作用及其表觀遺傳調(diào)控研究〔D〕.重慶：第四軍醫(yī)大學(xué)，2014.

3魏海峰，錢 軍，鮑丙波，等.微血管形成在腰椎間盤退變過程中的表現(xiàn)特征及影響因素〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016；17(5)：632-5.

4江 輝，王祥善.經(jīng)多裂肌間隙入路微創(chuàng)治療成人特發(fā)性脊柱側(cè)凸合并椎管狹窄癥臨床研究〔J〕.中國衛(wèi)生工程學(xué)，2017；16(1)：105-7，109.

5萬中元.長鏈非編碼RNA在退變?nèi)俗甸g盤髓核內(nèi)的異常表達(dá)〔D〕.重慶：第四軍醫(yī)大學(xué)，2014.

6王 華.社區(qū)康復(fù)治療對(duì)老年骨質(zhì)疏松骨折患者疼痛評(píng)分及生活質(zhì)量的影響〔J〕.中國衛(wèi)生工程學(xué)，2015；14(2)：177-9.