王昕昕， 劉元法， 李進(jìn)偉

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

冷凍面團(tuán)是當(dāng)今較新的一種面包加工技術(shù)，目的是分離面包的制作和焙烤過程，便于實(shí)現(xiàn)控制面包的規(guī)?；a(chǎn)和新鮮度，近年在國內(nèi)發(fā)展尤為迅速[1-2]。然而在冷凍面團(tuán)加工過程中，一方面冰晶的生成和凍藏過程中重結(jié)晶現(xiàn)象破壞面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和酵母細(xì)胞，同時(shí)，凍裂酵母釋放出的谷胱甘肽會進(jìn)一步破壞面筋及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[3]，從而導(dǎo)致酵母細(xì)胞存活率、發(fā)酵力和面團(tuán)的持氣能力均會有一定程度降低[4]。因此，在長時(shí)間的凍藏條件下，如何提高面包酵母的抗凍能力，以及保持面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的完整是目前急需解決的核心問題之一。

羥丙基甲纖維素 （HPMC）是非離子型纖維素醚，相比于離子型纖維素醚，與重金屬不發(fā)生反應(yīng)，且具有酸堿穩(wěn)定性等特點(diǎn)[5]，且目前是纖維素醚種類中產(chǎn)量最少，性能最優(yōu)、用途最為廣泛。HPMC由纖維素經(jīng)堿化和醚化制得，分子中羥基被甲氧基和羥丙基基團(tuán)按一定比例所取代，由于羥基和羥丙基的親水性，所以賦予HPMC良好的持水性能。為研究HPMC的持水性能，及其應(yīng)用于冷凍面團(tuán)中對可凍結(jié)水含量的影響和對面包酵母的抗凍作用。首先對比了質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的谷氨酸、海藻糖和HPMC溶液的抗凍活性，再將HPMC以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加入面團(tuán)中，測定比較在凍藏45 d后面團(tuán)中可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，最后測定添加谷氨酸、海藻糖和HPMC的酵母菌液在凍藏過程中的酵母細(xì)胞存活率（η）隨凍藏時(shí)間和添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HPMC：山東赫達(dá)股份有限公司產(chǎn)品；高筋小麥粉：益海嘉里（昆山）食品工業(yè)有限公司產(chǎn)品。

差示掃描量熱儀：美國TA儀器公司產(chǎn)品；多點(diǎn)磁力攪拌器：IKA（廣州）儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；顯微鏡：奧林巴斯有限公司產(chǎn)品產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備HPMC溶液 稱取0.5 g不同型號HPMC，各量取50 mL蒸餾水，先將蒸餾水置于多點(diǎn)磁力攪拌器上，80℃加熱20 min后，放入轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速調(diào)至400 r/min，將HPMC粉末緩慢加入，攪拌30min，使其充分溶脹，再將溫度調(diào)至20℃攪拌30 min，使其形成透明溶液[6]。

1.2.2 抗凍活性的測定 利用差示掃描量熱法（DSC）測定HPMC水溶液、谷氨酸溶液、海藻糖溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%）的抗凍活性。先測定3種溶液和蒸餾水的結(jié)晶融化焓。在特定鋁盒中稱取15～20 μg溶液，先于20℃平衡，以5℃/min降溫至-25℃，恒溫10 min，再以5℃/min升溫至30℃，記錄凍結(jié)水的融化焓（ΔHw）及凍結(jié)溶液的融化焓（ΔHA）。

抗凍活性（AF）：單位抗凍活性劑（g）在凍結(jié)材料中所產(chǎn)生未凍結(jié)水的質(zhì)量（g），計(jì)算公式如下[7]：

式中：ΔHw為凍結(jié)水的融化焓，mJ/mg；ΔHA為凍結(jié)溶液的融化焓，mJ/mg；C為溶液中抗凍劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 面團(tuán)制作 制作面團(tuán)配方為：高筋面粉500g、鹽 7.5 g、水 270 g、HPMC（B400 為例）分別加入（0、0.5、1.5、2.5、3.5、5.0 g），將 HPMC 配制成溶液后再加入和面機(jī)中，低速攪拌5 min后高速攪拌2 min，使面筋網(wǎng)絡(luò)充分形成。將面團(tuán)靜置15 min后，壓片至2 mm，以保鮮膜包覆放置-18℃冰箱凍藏備用。

1.2.4 面團(tuán)中水的可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 利用差示掃描量熱法（DSC）測定添加不同濃度HPMC面團(tuán)[8]，在凍藏一定時(shí)間后可凍結(jié)水的變化。在鋁盒中稱取15～20 μg面團(tuán)，先于20℃平衡，以10℃/min降溫至-60℃，恒溫3 min，再以10℃/min升溫至30℃，記錄冷凍面團(tuán)的融化焓（ΔHfw），及凍結(jié)水的融化焓（ΔHw）為339.2 mJ/mg，冷凍面團(tuán)可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為[9]：

式中：ΔHfw為冷凍面團(tuán)的融化焓，mJ/mg；ΔHw為凍結(jié)水的融化焓，mJ/mg；Wt為為面團(tuán)中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.2.5 酵母菌液的配制 稱取10 g活性干酵母，用適量的生理鹽水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%）溶解后，定容至1 000 mL，靜置10 h后，取上清液待用。取15 mL上清液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1%、1.5%、2.0%的谷氨酸、海藻糖的酵母菌液。分別取配制好的酵母菌液10mL于試管（D18×L180 mm）中，每個(gè)樣重復(fù)3次。對于含HPMC的酵母菌液，先以上述同種方法配制200 mL的2%的酵母上清液待用，再以生理鹽水分別配制50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%的HPMC溶液，將配置好的酵母菌液與HPMC溶液各吸取5 mL于試管（D18×L180 mm）中，充分混合攪勻，每個(gè)樣重復(fù)3次。

1.2.6 酵母菌液的凍藏和解凍 將配制好的酵母菌液放入-18℃冰箱凍藏。待測定時(shí)取酵母菌液在30℃水浴中解凍15 min后測定其酵母細(xì)胞存活率。

1.2.7 酵母細(xì)胞存活率的測定 酵母細(xì)胞濃度采用血球計(jì)數(shù)板法測定。測定前，取0.1 mL酵母菌液和0.9 mL美藍(lán)液于試管中，染色10 min[10]。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取平均值。η（η，%）為血球計(jì)數(shù)板中活細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)數(shù)量之比：

式中：n1為計(jì)數(shù)板中的活酵母細(xì)胞數(shù)量；nT為計(jì)數(shù)板中的酵母細(xì)胞總量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有測定均重復(fù)3次，利用Origin8.5數(shù)據(jù)處理軟件和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPMC對比其他抗凍劑的抗凍活性

純水和不同溶液結(jié)晶融化焓曲線（圖1）。凍結(jié)溶液的海藻糖、谷氨酸、HPMC添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%。由圖1可以看出，與凍結(jié)水、谷氨酸、海藻糖DSC曲線相比，HPMC溶液的融化曲線在最上方，表明凍結(jié)溶液結(jié)晶融化焓最低，且曲線明顯偏右，代表結(jié)晶溶液融化溫度最高，即HPMC的抗凍活性相比于海藻糖、谷氨酸有明顯優(yōu)勢。

圖1 凍結(jié)水和凍結(jié)溶液DSC曲線Fig.1 DSC curve of different frozen solution

通過對HPMC的取代度、聚合度和粘度值的比較及對不同分子結(jié)構(gòu)HPMC與海藻糖、谷氨酸的抗凍活性進(jìn)行對比（結(jié)果如圖2所示），作者發(fā)現(xiàn)，A系列的HPMC抗凍活性明顯低于B系列，這是由于A系列的HPMC羥丙基取代度較低，而羥丙基作為親水基團(tuán)可以與水分子形成分子間氫鍵，從而束縛部分水分子結(jié)晶，可抑制凍藏過程中水分子結(jié)晶及重結(jié)晶，表征為降低凍結(jié)溶液的結(jié)晶融化焓，即抗凍活性較強(qiáng)。如A400的AF為 5，B400的AF則為8.79。同時(shí)，在相同取代度條件下，不同的聚合度（以粘度表征）對于抗凍活性也有一定的影響，聚合度越大，分子鏈越長，羥丙基、羥基與水分子結(jié)合比例越大，抗凍活性越強(qiáng)，以 A100、A400、A4000為例，隨著聚合度提高，AF值由4.19增加至7.76，相比于谷氨酸、海藻糖的AF值為3.98、5.99，HPMC的抗凍活性均有明顯優(yōu)勢，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以B50000為例進(jìn)行深入研究。

圖2 對比海藻糖、谷氨酸、HPMC抗凍活性值Fig.2AF of HPMC compare with Glutamate and Trehalose

2.2 HPMC對冷凍面團(tuán)中可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響

冷凍面團(tuán)在凍藏過程中所產(chǎn)生的冰晶主要由可凍結(jié)水形成，冰晶不僅會對面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)造成破壞，且會破壞酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成酵母細(xì)胞存活率下降，這都將影響面團(tuán)的發(fā)酵和最終面包的品質(zhì)，所以降低冷凍面團(tuán)中可凍結(jié)水含量對冷凍面團(tuán)有著重要意義。添加一定濃度的HPMC（B50000）對于冷凍面團(tuán)的初始結(jié)晶溫度To、峰值溫度Tp沒有顯著的影響，但在凍藏1 d和45 d后，添加HPMC的樣品冰晶融化范圍（Te-To）較小，在凍藏1 d后，相比空白樣品，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%HPMC面團(tuán)樣品的冰晶融化范圍降低16.6%，凍藏45 d后降低6.8%。而面團(tuán)冰晶融化范圍越小，意味著凍藏期間形成的冰晶大小分布就越均勻[11]；同時(shí)隨著HPMC添加濃度的增大，面團(tuán)的結(jié)晶融化焓明顯降低。

ΔHfw的降低的原因[12]主要由于體系中可凍結(jié)水含量降低或體系中原本的水分降低，本實(shí)驗(yàn)是由于HPMC中的羥丙基基團(tuán)對于水分子的束縛作用導(dǎo)致其可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。圖3表明，在凍藏45 d后，面團(tuán)可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯升高，而添加HPMC后，可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)由空白面團(tuán)的65.2%下降至51.3%。同時(shí)，隨著HPMC質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0%增大到1%，可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)會顯著下降，凍藏1 d的情況下，可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)由62.5%降至46.5%，凍藏45 d后，可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)由65.2%降至51.3%。Sharadanant[13]和Leray[14]等認(rèn)為，將親水膠加入冷凍面團(tuán)中，由于膠體分子上的親水基團(tuán)和水分子之間由氫鍵相互作用，可達(dá)到吸附面團(tuán)中部分游離水的效果，從而阻止水分子進(jìn)一步遷移，降低冷凍面團(tuán)中游離態(tài)水的含量，進(jìn)一步減少冰晶含量，減緩對面筋蛋白的破壞。

圖3 凍藏45 d后HPMC濃度對面團(tuán)中可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 Effect ofHPMC’s concentration on frozen watercontent in frozen dough after 45 d

2.3 HPMC對凍藏過程中酵母細(xì)胞存活率的影響

HPMC由于同時(shí)存在疏水性基團(tuán)甲氧基及親水性基團(tuán)羥丙基，所以其有良好的乳化性能，乳化劑已作為酵母冷凍保護(hù)劑被廣泛研究。徐云峰[15]等發(fā)現(xiàn)經(jīng)冷凍后，相比于空白組，含乳化劑的培養(yǎng)液中酵母存活率，由50%升提升至80%，相對提高了60%。

在抗凍劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，凍藏溫度為-18℃的條件下，測定酵母細(xì)胞存活率隨凍藏時(shí)間的變化。如圖4所示，凍藏初期，在0～6 d內(nèi)，η呈顯著下降趨勢，以0～2 d內(nèi)η下降最為迅速，凍藏2 d后，空白酵母菌液η僅為37.2%，而添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%谷氨酸、海藻糖后酵母凍藏率分別可達(dá)47.9%、54.3%，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%HPMC的酵母菌液η為62.1%，遠(yuǎn)高于空白菌液，和其它對照組。凍藏6 d后，η下降變緩，8 d后基本保持平衡，此時(shí)空白酵母菌液η為23.2%，添加1%的谷氨酸、海藻糖、HPMC的酵母菌液η分別為34.8%、44.3%、55.5%。由此可得出結(jié)論，酵母菌液在冷凍初期下降迅速，8 d后保持穩(wěn)定，HPMC對于其它抗凍劑而言有著明顯優(yōu)勢，這是由于HPMC的羥丙基對于水分子有著束縛作用，在冷凍前期，可有效減少冰晶的形成，防止了重結(jié)晶，減少對酵母細(xì)胞的破壞作用，提高了酵母細(xì)胞存活率；隨著凍藏時(shí)間的延長，在凍藏后期，存活的酵母細(xì)胞將開啟自身代謝調(diào)節(jié)，例如合成海藻糖來達(dá)到自我保護(hù)的目的，所以酵母細(xì)胞存活率保持穩(wěn)定[15]。

圖4 酵母細(xì)胞存活率隨凍藏時(shí)間變化而變化Fig.4 Effect offrozen time on ratio of yeast cells

在凍藏溫度-18℃下，凍藏時(shí)間8 d的條件下，通過改變酵母菌液中不同抗凍劑的添加濃度，測定酵母細(xì)胞存活率。由圖5可以得到：在HPMC添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～1.0%時(shí)，η隨著其添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而顯著提高，由空白樣的23.2%增至55.5%，添加谷氨酸、海藻糖的樣品η分別為34.8%、44.3%；隨著抗凍劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步提高，HPMC對η的影響保持穩(wěn)定，谷氨酸和海藻糖還有增幅，當(dāng)超過1.5%的添加量時(shí)，3組樣品的η基本保持穩(wěn)定，HPMC效果明顯優(yōu)于谷氨酸和海藻糖。

圖5 酵母細(xì)胞存活率隨抗凍劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig.5 Effect of concentration of cryoprotectants on ratio of yeast cells

3 結(jié)語

通過對比研究不同型號HPMC、海藻糖、谷氨酸的抗凍活性，HPMC對面團(tuán)中可凍結(jié)水含量的影響，及其對提高凍藏過程中酵母細(xì)胞存活率可發(fā)現(xiàn)，HPMC的抗凍活性由于其分子結(jié)構(gòu)從2.4變化至9.82，通過適當(dāng)選型，可遠(yuǎn)高于海藻糖、谷氨酸的5.99和3.98；在凍藏45 d后，添加HPMC的面團(tuán)可凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)由空白樣的65.2%降至51.3%；同時(shí)，由于HPMC優(yōu)異的持水性能，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%HPMC樣品的酵母細(xì)胞在凍藏8 d的存活率也由空白的23.2%提升至55.5%，明顯高于添加海藻糖、谷氨酸樣品的44.3%，34.8%。所以，結(jié)果表明HPMC的持水性能對于降低面團(tuán)中可凍結(jié)水含量和提高酵母細(xì)胞在凍藏過程中的存活率有顯著效果，對實(shí)驗(yàn)研究和冷凍面團(tuán)生產(chǎn)工藝具有一定的指導(dǎo)意義。

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