盧軍利， 孫建霞， 文羅娜， 白衛(wèi)濱*， 焦 睿， 歐仕益， 楊 勇

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；3.廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

重金屬鎘可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入體內(nèi)，分布到全身各個(gè)器官，重金屬鎘會(huì)對(duì)腎、肝、肺、心血管、睪丸等系統(tǒng)產(chǎn)生一系列損傷。且鎘的半衰期長(zhǎng)達(dá)15～30年。由于鎘容易在體內(nèi)蓄積，所以一些動(dòng)物性食品中鎘含量較高，濃度可達(dá)幾十至數(shù)百倍[1-3]。

重金屬鎘對(duì)雄性和雌性的生殖系統(tǒng)都有損害作用，但雄性生殖系統(tǒng)對(duì)鎘的敏感性要高于雌性生殖系統(tǒng)，動(dòng)物雄性生殖器官睪丸是重金屬染毒受損嚴(yán)重的靶器官之一，除了對(duì)雄性性腺發(fā)育有不良影響外，鎘還對(duì)睪丸和附睪也有毒副作用[4]。目前，重金屬Cd的雄性毒性研究主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上，而對(duì)體外睪丸間質(zhì)細(xì)胞研究較少，損傷機(jī)理不是很明確。且對(duì)重金屬暴露的睪丸間質(zhì)細(xì)胞毒性損傷的研究主要是集中于對(duì)睪酮生成途徑中相關(guān)酶的影響[5]，孕酮是合成睪酮的前體物質(zhì)，作者通過(guò)CdSO4對(duì)R2C細(xì)胞孕酮合成通路的影響，探討重金屬鎘引起的雄性生殖毒性機(jī)制，為重金屬Cd的食品安全評(píng)估提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

R2C細(xì)胞：購(gòu)自 CCTCC；CdSO4（純度為 98%）：百靈威公司產(chǎn)品；F-12 basic（1X）培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰酶、馬血清：美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品；MTT、DMSO：美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；I125孕酮放射免疫分析藥盒：北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；活性氧檢測(cè)試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；StAR兔抗大鼠抗體 Cell Signaling Technology；CYP11A1兔抗大鼠抗體 Cell Signaling Technology；GAPDH兔抗大鼠抗體proteintech。

CO2培養(yǎng)箱：美國(guó) Thermo公司產(chǎn)品；流式分析儀：美國(guó)BD公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀美國(guó)：Thermo公司產(chǎn)品；GC-1200 γ放射免疫計(jì)數(shù)儀：安徽中科中佳公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)Cd對(duì)R2C細(xì)胞增殖的影響將對(duì)數(shù)期的R2C細(xì)胞用胰酶消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，接種于96孔板中，每孔8 000個(gè)細(xì)胞，每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入用完全培養(yǎng)基稀釋的CdSO4溶液，使每組 CdSO4作用濃度分別為 0、10、20、40、80、160 μmol/L，并設(shè)有空白組（不含細(xì)胞）。 CdSO4作用24 h后，避光加入加噻唑藍(lán)（MTT）溶液，每孔 20μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄孔內(nèi)液體，避光加入DMSO溶解藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，每孔150 μL，脫色搖床上搖勻10 min，使沉淀充分溶解，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

用SPSS軟件分析得出Cd作用于R2C細(xì)胞的IC25、IC50、IC75濃度值。

1.2.2 放射免疫 （radioimmunoassav，RIA）檢測(cè)Cd對(duì)R2C細(xì)胞合成孕酮的影響 將對(duì)數(shù)期的R2C細(xì)胞用胰酶消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，接種到6孔板中，每孔4×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基2 mL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入濃度分別為IC25、IC50和IC75的CdSO4溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取上清，按照碘[125I]孕酮放射免疫分析藥盒進(jìn)行測(cè)定孕酮合成量。

1.2.3 流式細(xì)胞分析儀（FCM）檢測(cè)Cd對(duì) R2C細(xì)胞線粒體膜電位（MMP）的影響 將對(duì)數(shù)期的R2C細(xì)胞用胰酶消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，接種到6孔板中，每孔4×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基2 mL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入濃度分別為IC25、IC50和IC75的CdSO4溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，胰酶消化，400 g離心5 min，按照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒進(jìn)行JC-1染色，用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品采集104個(gè)細(xì)胞。

1.2.4 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè) CP對(duì)R2C細(xì)胞的ROS水平影響 將對(duì)數(shù)期的R2C細(xì)胞用胰酶消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，接種到96孔板中，每孔10 000個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入30 μL DCFH-DA溶液 （無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋），細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min，無(wú)血清F12培養(yǎng)基洗3遍，將孔內(nèi)殘留探針清洗干凈，加入分別含IC25、IC50和IC75濃度CdSO4的培養(yǎng)基，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)Cd作用前后熒光的強(qiáng)弱變化。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)Cd對(duì)R2C細(xì)胞孕酮合成相關(guān)蛋白Star和CYP11A1表達(dá)的影響 漩渦震蕩15 s，冰浴 45 s，重復(fù)操作 1 h，4 ℃離心 30 min，取上清。測(cè)定試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度，制樣，然后進(jìn)行SDS電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、顯影。ImageJ軟件分析結(jié)果。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 通過(guò)SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析結(jié)果，檢驗(yàn)水平為p＜0.05時(shí)為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cd對(duì)R2C細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

CdSO4作用24 h后，R2C細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，由表1可以看出，重金屬Cd能夠抑制R2C細(xì)胞的生長(zhǎng)，且Cd濃度越高，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率越大，呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)CdSO4濃度達(dá)到160 μmol/L時(shí)，細(xì)胞抑制率高達(dá)95%，通過(guò)SPSS軟件分析得出Cd對(duì) R2C 細(xì)胞的 IC25、IC50、IC75濃度值分別為 （24.93±0.023 5）、（44.80±0.047 9）、（80.51±0.035 7） μmol/L。

2.2 Cd對(duì)R2C細(xì)胞孕酮合成的影響

在維持正常的雄性生理功能過(guò)程中，睪酮起到至關(guān)重要的作用[6]，R2C細(xì)胞由于缺少表達(dá)合成睪酮的相關(guān)酶，最終生成孕酮，而孕酮是睪酮合成的前體物質(zhì)，所以通過(guò)檢測(cè)孕酮水平可以反映雄性激素的變化[7]。由孕酮檢測(cè)結(jié)果可以看出，IC25、IC50、IC753濃度組CdSO4均對(duì)孕酮合成有影響。CdSO4溶液濃度越高，孕酮合成量越少，當(dāng)濃度值達(dá)到IC75Z值時(shí)，孕酮合成量下降為對(duì)照組的40%。

表1 不同濃度CdSO4對(duì)R2C細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響Table 1 Inhibitory effect of CdSO4on the growth of R2C cells

圖1 不同濃度CdSO4對(duì)R2C孕酮合成的影響Fig.1 Effect of CdSO4on progesterone production of R2C cells

2.3 Cd對(duì)R2C線粒體膜電位的影響

流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)CdSO4濃度為IC25、IC50、IC75暴露24 h后對(duì)R2C細(xì)胞MMP的影響。通過(guò)JC-1染料對(duì)R2C細(xì)胞進(jìn)行染色，紅色熒光部分為細(xì)胞內(nèi)正常MMP區(qū)域，綠色熒光為細(xì)胞內(nèi)MMP降低的部分。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IC25、IC50、IC75作用濃度均對(duì)R2C細(xì)胞MMP有所影響，且隨著濃度的增大，線粒體膜電位損傷的比例越大 （圖2（a））。數(shù)據(jù)分析表明：與正常組相比，濃度為IC25時(shí)，線粒體膜電位顯著下降，損傷嚴(yán)重，IC75值時(shí)，線粒體膜電位損傷比率達(dá)33%（圖2（b））。

2.4 Cd對(duì)R2C產(chǎn)生ROS的影響

氧化損傷是重金屬雄性毒性的重要損傷學(xué)說(shuō)之一[8]，而各種自由基中，氧自由基（ROS），最為主要，圖 3顯示，CdSO4刺激 R2C細(xì)胞 2、4、8 h時(shí)，R0S產(chǎn)生量均有顯著提高，4 h時(shí)最為明顯，且隨著Cd濃度的升高，ROS產(chǎn)生的量也相應(yīng)增多。由于ROS的產(chǎn)生速度非常快，所以Cd作用8 h時(shí)R0S產(chǎn)生量有所下降。

圖2 不同濃度Cd對(duì)R2C細(xì)胞MMP的影響Fig.2 Effects of CdSO4on MMP changes of R2C cells

圖3 不同濃度Cd對(duì)R2C產(chǎn)生ROS的影響Fig.3 Effects of Cd on ROS in R2C cells

2.5 Cd R2C細(xì)胞孕酮合成相關(guān)基因StAR、CYP11A1蛋白表達(dá)的影響

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：重金屬Cd可以抑制StAR、CYP11A1蛋白的表達(dá)量，且StAR蛋白的表達(dá)量隨Cd濃度的升高而下降，與對(duì)照組相比，IC25、IC50、IC75濃度作用組的 StAR蛋白的表達(dá)量均有顯著性差異。而與對(duì)照組相比，只有IC75作用濃度可以明顯抑制CYP11A1蛋白的表達(dá)，說(shuō)明Cd對(duì)StAR蛋白的影響更為顯著，結(jié)果見(jiàn)圖4-6。

圖4 Western blot檢測(cè)不同濃度Cd對(duì)R2C細(xì)胞StAR和CYP11A1蛋白的影響Fig.4 Effects of Cd on StAR and CYP11A1 expressions by Western blot

圖5 Western blot檢測(cè)不同濃度Cd對(duì)R2C細(xì)胞StAR蛋白的影響Fig.5 Effects of Cd on StAR and CYP11A1 expressions by Western blot

圖6 Western blot檢測(cè)不同濃度Cd對(duì)R2C細(xì)胞StAR和CYP11A1蛋白的影響Fig.6 Effects of Cd on StAR and CYP11A1 expressions by Western blot

3 討 論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，鎘可以損傷曲精小管中的生殖細(xì)胞，并且鎘刺激濃度微量的提高即可引起睪丸損傷的大幅加重[9]，體外實(shí)驗(yàn)研究重金屬暴露的睪丸間質(zhì)細(xì)胞毒性損傷主要是集中于對(duì)睪酮生成途徑中相關(guān)酶的影響，鎘通過(guò)氧化損傷途徑對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞孕酮合成能力的影響沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，作者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，研究了Cd雄性毒性作用。結(jié)果顯示，金屬Cd可以顯著降低R2C細(xì)胞的活性，且濃度越大，作用越強(qiáng)。ROS是體內(nèi)重要的一種自由基，ROS在機(jī)體內(nèi)保持平衡狀態(tài)下，有抗菌、消炎等重要作用，但當(dāng)平衡被打破，會(huì)造成生物膜的脂質(zhì)氧化損傷，從而引起酶、蛋白等氧化損傷，最終導(dǎo)致對(duì)身體機(jī)能的損害[10-12]。通過(guò)測(cè)定在Cd的作用下R2C細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生量，發(fā)現(xiàn)Cd能夠使細(xì)胞中ROS顯著提高，隨著Cd濃度的升高，產(chǎn)生的ROS的量也顯著升高，線粒體損傷比率也顯著升高，這是由于ROS的主要產(chǎn)生部位是線粒體的呼吸鏈，Cd刺激R2C細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的ROS，使線粒體DNA、基質(zhì)中的酶受到ROS攻擊而損傷[13]，從而影響線粒體膜電位的正常作用。StAR蛋白和CYP11A1蛋白是整個(gè)孕酮合成通路中的關(guān)鍵點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，重金屬Cd明顯降低StAR和CYP11A1蛋白表達(dá)量，StAR蛋白表達(dá)量的下降減弱了膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)內(nèi)，CYP11A1蛋白表達(dá)量的下降減少了線粒體中孕烯醇酮的合成，從而降低了孕酮的合成。孕酮檢測(cè)結(jié)果對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證，濃度為IC25、IC50、IC75的Cd刺激R2C細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，各CdSO4作用組的R2C細(xì)胞孕酮量都顯著降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傊珻d刺激對(duì)體外培養(yǎng)的R2C細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，進(jìn)而影響線粒體正常功能和StAR、CYP11A1的表達(dá)，從而阻礙膽固醇的正常轉(zhuǎn)運(yùn)和孕酮生成中間物質(zhì)孕烯醇酮的生成，最終降低R2C細(xì)胞孕酮合成量。

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