閆玉潔， 李 會， 王向棟， 馬 洋， 史勁松， 許正宏

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

微生物多糖是某些微生物生長代謝過程中，在特殊的營養(yǎng)條件下，合成的對細(xì)胞具有保護(hù)作用的生物聚合物[1-2]。

膠質(zhì)芽孢桿菌于20世紀(jì)初分離得到，它可分解云母、長石等硅酸鹽礦石而釋放出磷、鉀元素，且在生長過程中能夠產(chǎn)生豐富的胞外多糖。

目前，對于多糖BMPS過量合成的研究工作僅限于常規(guī)的發(fā)酵條件優(yōu)化[3-4]，導(dǎo)致其生產(chǎn)效率偏低、生產(chǎn)成本偏高，限制了該多糖的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，作者希望通過蛋白組學(xué)的方式，分析不同條件下的差異蛋白，找出影響多糖合成的關(guān)鍵酶，并對其在分子水平和蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行代謝調(diào)控，引導(dǎo)物質(zhì)代謝流量朝著目標(biāo)產(chǎn)物多糖的合成方向偏移，從而實(shí)現(xiàn)多糖的過量合成。然而由于蛋白質(zhì)組自身的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，至今尚未得到通用、簡便、高效的技術(shù)支持[5]，目前雙向電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)是差異蛋白質(zhì)組學(xué)最常用的方法之一。作者研究了夾膜多糖的脫除，對菌體總蛋白質(zhì)的提取方法進(jìn)行改進(jìn)，并優(yōu)化雙向電泳的條件，建立一套高分辨率、高靈敏度的雙向電泳技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)條件 菌株：膠質(zhì)芽孢桿菌SM-01，江南大學(xué)藥學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室分離并保藏。

培養(yǎng)條件：從固體培養(yǎng)基上刮取適量菌體接入到50 mL的種子培養(yǎng)基中，置于30℃，200 r/min的往復(fù)式搖床中培養(yǎng)24 h；再將種子液按照體積分?jǐn)?shù)4%接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30℃，200 r/min的往復(fù)搖床中發(fā)酵培養(yǎng)24 h。

1.1.2 試劑 IPG線性預(yù)制干膠條、兩性電解質(zhì)等：購自美國Bio-Rad公司；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨、溴酚藍(lán)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、十二烷基磺酸鈉（SDS）、pH7.5 Tris飽和酚、考馬斯亮藍(lán)G-250、蛋白測定試劑盒等：購自上海生工集團(tuán)；蔗糖、甲醇、丙酮、冰醋酸、三氯乙酸（TCA）等：均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Ettan IPG-phor 3型等電聚焦電泳儀、Ettan DALTsix垂直電泳系統(tǒng)、Image MasterLabScan凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)：GE公司產(chǎn)品；CR22GH型高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司產(chǎn)品；PDQuest 8.0.1分析軟件：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖去除與菌體收集

1）超純水洗滌法 取100 mL發(fā)酵液，在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清。用50mL超純水懸浮洗滌菌體，在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，重復(fù)3次得菌體沉淀。

2）高濃度鹽酸單次處理法 取100 mL發(fā)酵液，加入等體積的體積分?jǐn)?shù)50%鹽酸，攪拌1 h，在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清。超純水懸浮洗滌菌體3次得菌體沉淀。

3）低濃度鹽酸多次處理法 取100 mL發(fā)酵液，加入等體積的體積分?jǐn)?shù)30%鹽酸，攪拌1 h，在4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清。沉淀中加入50 mL體積分?jǐn)?shù)10%鹽酸，攪拌30 min，離心，重復(fù)一次，超純水懸浮洗滌菌體3次得菌體沉淀。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取

1）TCA-丙酮法 將收集到的菌體置于陶瓷研缽中，加入液氮研磨成粉，將粉末轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中。加入TCA-丙酮溶液30 mL，-20℃放置過夜，用于沉淀蛋白質(zhì)。在4℃、14 000 r/min條件下離心30 min。用預(yù)冷的丙酮溶液（含1 g/L的DTT）懸浮洗滌沉淀，-20℃靜置1 h，在4℃、14 000 r/min條件下離心30 min，重復(fù)2次，得蛋白質(zhì)沉淀。

2）酚抽提法 根據(jù)Rocco[6]的方法并加以改進(jìn)，將收集到的菌體用液氮在研缽中研磨成粉，加入5 mL酚提取緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.5，0.7 mol/L蔗糖，0.1 mol/L KCl，0.05 mol/L EDTA），4 ℃放置 10min。加入等體積pH 7.5的Tris飽和酚，渦旋震蕩混勻。在4℃、14 000 r/min條件下離心30 min，收集上層酚相，加入與酚相體積相同的提取緩沖液，重復(fù)上述提取步驟2次。沉淀分別用預(yù)冷的甲醇和丙酮懸浮洗滌2次，得蛋白質(zhì)沉淀。

3）TCA-丙酮與酚抽提結(jié)合法 將收集到的菌體用液氮在研缽中研磨成粉，加入30 mL TCA-丙酮溶液沉淀蛋白質(zhì)，-20℃放置過夜，在4℃、14 000 r/min條件下離心30 min，加入5 mL酚提取緩沖液，4℃放置10 min。加入等體積pH 7.5 Tris飽和酚，渦旋震蕩混勻。在4℃、14 000 r/min條件下離心30 min，收集上層酚相，加入與酚相體積相同的提取緩沖液，將上述步驟重復(fù)2次。沉淀用預(yù)冷的甲醇懸浮洗滌2次，沉淀中加入30 mL TCA-丙酮溶液，-20℃放置過夜，在4℃、14 000 r/min條件下離心30 min。用預(yù)冷的丙酮溶液 （含1 mg/mL的DTT）懸浮洗滌沉淀，-20℃靜置1 h，在4℃、14 000 r/min條件下離心30 min，重復(fù)2次，得蛋白質(zhì)沉淀。

蛋白質(zhì)沉淀中加入500 μL蛋白裂解液。至沉淀完全溶解后，并于在4℃、10 000 r/min條件下離心30 min，用Bradford方法定量蛋白質(zhì)[7]。

1.2.3 雙向電泳

1）第一向等電聚焦 移取300 μg全蛋白于1.5 mL EP管中，加入上樣緩沖液至總體積為300μL，充分混勻后，緩慢均勻加入聚焦槽。將膠條膠面朝下覆蓋于樣品上，趕出氣泡，加入2～3 mL的礦物油封閉聚焦槽，20℃進(jìn)行等電聚焦（IEF）。

2）膠條平衡 聚焦完成后，取出膠條，膠面朝上放入平衡盤內(nèi)，分別用平衡液Ⅰ（6 mol/L尿素，75 mmol pH 8.8 Tris-HCl，體積分?jǐn)?shù)20%甘油，體積分?jǐn)?shù)4%SDS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%DTT）和平衡液Ⅱ（6 mol/L尿素，75 mmol pH 8.8 Tris-HCl，體積分?jǐn)?shù)20%甘油，體積分?jǐn)?shù)4%SDS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%碘乙酰胺）平衡10 min。

3）第二向SDS-PAGE分離 將膠條從平衡槽中取出，快速浸入 TGS Buffer（Tris 3 g，SDS 1 g，甘氨酸 14.4 g，ddH2O定容至1 L）中，去除表面氣泡。在封有質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%SDS-PAGE的玻璃膠板中加入融化好的覆蓋瓊脂糖，將膠條壓入其中，待覆蓋瓊脂糖凝固，將玻璃膠板放入裝有TGS Buffer的電泳槽。

4）染色 將凝膠從玻璃板中剝離，加入約500 mL超純水清洗1 min。加入適量的染色液（2.5 g/L考馬斯亮藍(lán)G-250，體積分?jǐn)?shù)10% 冰醋酸，40%甲醇）置于搖床上染色約4 h，更換脫色液（體積分?jǐn)?shù)10%冰醋酸，40%甲醇），脫色至點(diǎn)清晰，背景不明顯。

5）圖像采集與分析 采用 Image MasterLabScan凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對雙向凝膠電泳圖譜進(jìn)行掃描，并用PDQuest 8.0.1分析軟件進(jìn)行圖像分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同多糖預(yù)處理方法對菌體蛋白提取的影響

由于B.mucilaginosus SM-01能夠合成大量的莢膜多糖，菌體被該多糖緊緊包裹，難以去除，對后續(xù)菌體蛋白的提取帶來極大不便。使用超純水洗滌多次仍無法有效洗去菌體外莢膜多糖，且處理后蛋白濃度過低，無法達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，見圖1（b）與表1。由于該多糖易溶于酸性溶液中，故采用不同濃度的鹽酸單次或多次處理菌體。圖1（c）和圖1（d）顯示，兩種酸法處理后莢膜多糖能夠有效去除，且細(xì)胞完整，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。表1顯示，低濃度鹽酸多次處理法所得的蛋白濃度更高，且考慮到高濃度鹽酸可能對細(xì)胞產(chǎn)生一定的傷害，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用低濃度鹽酸多次處理法。

圖1 不同多糖去除方法對細(xì)胞的影響Fig.1 Comparison of cells with different BMPS dissolution methods

表1 不同多糖去除方法得到的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度Table 1 Comparison protein concentration with different BMPS dissolution methods

2.2 不同菌體總蛋白提取方法對雙向電泳圖譜的影響

蛋白質(zhì)提取方法是雙向電泳成敗的關(guān)鍵[8]，使用上述方法處理菌體后，仍有部分多糖存在，多糖難以去除且可溶于蛋白裂解液中，使蛋白質(zhì)提取面臨許多困難。TCA丙酮法是目前微生物全蛋白提取常用的方法[9-10]，而酚抽提法則主要應(yīng)用于植物組織蛋白的提取，有研究表明酚抽提法同樣適用于細(xì)菌，甚至效果優(yōu)于TCA丙酮法。作者比較了TCA丙酮法、酚抽提法和TCA丙酮與酚抽提結(jié)合法3種蛋白質(zhì)提取方法對雙向電泳圖譜的影響，圖2（a）和圖2（b）表明，單獨(dú)采用TCA丙酮法和酚抽提法時得到的圖譜不清晰，且蛋白點(diǎn)聚集成團(tuán)，基本無法分離，分析原因?yàn)榍v膜多糖沒有完全除去。圖2（c）中，用TCA丙酮與酚抽提結(jié)合法得到的蛋白圖譜，蛋白點(diǎn)基本得以分離，圖譜較清晰。以上結(jié)果表明，TCA丙酮與酚抽結(jié)合法能夠較好的除去多糖等雜質(zhì)，提取得到的蛋白質(zhì)純度較高。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用TCA丙酮與酚抽結(jié)合法作為B.mucilaginosus SM-01菌體蛋白質(zhì)的提取方法。

圖2 不同蛋白質(zhì)提取方法的雙向電泳圖譜Fig.2 Comparison of 2-DE maps with different protein extraction methods

2.3 不同pH范圍膠條對雙向電泳圖譜的影響

每個蛋白質(zhì)都有各自不同的等電點(diǎn)（pI），這決定了蛋白圖譜中蛋白點(diǎn)的橫向分布。因此選擇合適pH范圍的IPG膠條對雙向電泳圖譜具有重要影響，較寬pH范圍的IPG膠條能包含所有的蛋白質(zhì)，但蛋白點(diǎn)可能聚集，難以有效分離；較窄pH范圍IPG膠條有利于提高圖譜的分辨率，但可能丟失pH值范圍之外的蛋白質(zhì)。作者首先采用17 cm、pH 3～10的線性IPG預(yù)制干膠條，得到的結(jié)果如圖3（a）所示，蛋白點(diǎn)較集中，主要分布在pH 4～7附近，膠條沒有得到有效的利用，而且蛋白點(diǎn)出現(xiàn)了堆積現(xiàn)象，分離效果不理想，進(jìn)一步用PDQuest 8.0.1軟件分析檢測到447個蛋白點(diǎn)?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，改用pH范圍為4～7的線性IPG預(yù)制干膠條，得到的結(jié)果如圖3（b）所示。此時蛋白點(diǎn)的分離效果較圖3（a）顯著提高，很好的解決了蛋白點(diǎn)重疊的問題，用PDQuest 8.0.1軟件可檢測得到616個蛋白點(diǎn)。因此，作者選擇采用pH 4～7的IPG預(yù)制干膠條進(jìn)行雙向電泳的第一向等電聚焦電泳。

圖3 不同pH范圍膠條的雙向電泳圖譜Fig.3 Comparison of 2-DE maps with different IPG strips

2.4 不同等電聚焦程序?qū)﹄p向電泳圖譜的影響

等電聚焦是雙向電泳中至關(guān)重要的一步，聚焦時間不足容易造成高相對分子質(zhì)量部分蛋白聚焦不完全以及點(diǎn)不圓等現(xiàn)象，聚焦時間過長則容易導(dǎo)致蛋白在其等電點(diǎn)位置時不穩(wěn)定而產(chǎn)生橫條紋。作者設(shè)置了3個不同的等電聚焦程序：程序I（100 V 30 min，1 000 V 3 h，6 000 V 5 h，6 000 V 50 000 Vh，500 V 20 h）、程序Ⅱ（100 V 30 min，1 000 V 3 h，8 000 V 5 h，8 000 V 60 000 Vh，500 V 20 h）和程序Ⅲ （100 V 30 min，1 000 V 3 h，10 000 V 5 h，10 000 V 70 000 Vh，500 V 20 h）。 3 個程序的區(qū)別為最高電壓和聚焦功率不同，結(jié)果如圖4所示。程序I條件下的蛋白圖譜可分離的蛋白點(diǎn)極少，高相對分子質(zhì)量部分出現(xiàn)較多橫條紋；程序Ⅲ得到的結(jié)果見圖4（c），程序I相比得到改善，但高相對分子質(zhì)量部分的橫條紋依然較明顯，考慮可能的原因分別是聚焦不完全和聚焦過度。程序Ⅱ?qū)?yīng)的圖譜蛋白點(diǎn)更加清晰，橫條紋的問題大大的得到了改善，用PDQuest 8.0.1分析檢測可得737個蛋白點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用程序Ⅱ進(jìn)行雙向電泳的第一向等電聚焦電泳。

圖4 不同等電聚焦程序的雙向電泳圖譜Fig.4 Comparison of 2-DE maps with different IEF programs

3 結(jié) 語

建立了適用于B.mucilaginosus SM-01的全蛋白提取和雙向電泳方法。確定采用低濃度鹽酸多次處理法去除菌體外莢膜多糖，然后用TCA丙酮/酚抽提結(jié)合法提取全蛋白，所得到的蛋白質(zhì)純度較高。采用17 cm pH 4～7的線性IPG預(yù)制干膠條，在8 000 V 60 000 Vh的最高聚焦程序下進(jìn)行第一向等電聚焦。在此條件下，圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)多達(dá)737個，圖譜分離效果好，蛋白點(diǎn)清晰且背景較低，適用于B.mucilaginosus SM-01的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

[1]SEVIOUR R J，MCNEIL B，F(xiàn)AZENDA M L，et al.Operating bioreactors for microbial exopolysaccharide production[J].Critical Reviews in Biotechnology，2011，31：170-185.

[2]YOON S，HONG E，KIM S，et al.Optimization of culture medium for enhanced production of exopolysaccharide from Aureobasidium pullulans[J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2012，35：167-172.

[3]LI Donghua，YANG Bo.Application of response surface methodology to optimize the spore production of B.mucilaginosus GM1[J].Science and Technology of Food Industry，2012，33（22）：206-209.（in Chinese）

[4]LIU Wuxing，XU Xushi.Study on fermentation of Bacillus mucilaginosus[J].Journal of Nanchang University （Natural Science），2002，26（3）：299-302.（in Chinese）

[5]WRIGHTON K H.Technology：proteomics gets more selective[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology，2013，14（3）：131-131.

[6]ROCCO M，D'AMBROSIO C，ARENA S，et al.Proteomic analysis of tomato fruits from two ecotypes during ripening[J].Proteomics，2006，6（13）：3781-3791.

[7]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of Protein-Dye binding[J].Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[8]WISNIEWSKI J R，ZOUGMAN A，NAGARAJ N，et al.Universal sample preparation method for proteome analysis[J].Nature Methods，2009，6（5）：359.

[9]SHENG L，ZHU G，TONG Q.Comparative proteomic analysis of Aureobasidium pullulans in the presence of high and low levels of nitrogen source[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（43）：10529-10534.

[10]ZHAO Shaohui，ZHOU Jingwen，DU Guocheng，et al.A preliminary study on differential proteomics of Corynebacterium crenatum in two oxygen supply models[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（3）：235-240.（in Chinese）