郝秀華，孫悅，王蕾，姬海婷，楊錦竹

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130021）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種目前醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的難治疾病之一，具有病變范圍廣泛、病情反復(fù)、容易復(fù)發(fā)、病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分明確的特點(diǎn)，是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病[1～3]。人參皂苷Rd（GinsenosideRd）作為一種三萜皂苷類化合物，是人參和三七活性物質(zhì)主要成分之一[4]，對(duì)心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腎臟等具有獨(dú)特的多觸發(fā)保護(hù)作用，近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rd對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎顯示出獨(dú)特的治療效果，可明顯減少潰瘍性結(jié)腸炎大鼠膿便、血便、腹瀉等癥狀，減少組織潰瘍形成及壞死，促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞和潰瘍面愈合，明顯減少炎癥反應(yīng)[5～7]?？诜Y(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)是指通過(guò)藥物傳輸系統(tǒng)使得藥物不在上消化道釋放，而在回盲部或結(jié)腸釋放，發(fā)揮局部或全身的治療作用。目前，口服結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)原理主要基于胃腸道恒定轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間[8]、胃腸道不同pH值[9]及結(jié)腸菌群所產(chǎn)生獨(dú)特酶系[10]等。本實(shí)驗(yàn)采用時(shí)滯-pH-酶觸3種原理相結(jié)合的方法制備人參皂苷Rd結(jié)腸定位片，克服了單一釋藥系統(tǒng)定位不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，在一定程度上提高藥物在結(jié)腸的釋放量，達(dá)到較理想的結(jié)腸定位效果。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料和試劑

人參皂苷Rd（廣東泰禾醫(yī)藥科技公司），微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉（德國(guó)JRS公司），聚乙烯吡咯烷酮（中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司），硬脂酸鎂（上海三浦化工有限公司），殼聚糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸二氫鉀（西隴化工股份有限公司），氫氧化鈉（北京化工廠），-葡萄糖苷酶（江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司），尤特奇E100、尤特奇S100、尤特奇L100（德國(guó)贏創(chuàng)公司），滑石粉、聚乙二醇6 000、鄰苯二甲酸二乙酯（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），檸檬酸三乙酯（TEC德國(guó)羅姆公司)，乙腈（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司），其他試劑為分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-20A型紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；THP-4T花籃式壓片機(jī)（上海智敏分裝設(shè)備有限公司制藥機(jī)械分公司）；流化床沸騰包衣機(jī)（沈陽(yáng)藥科大學(xué)制藥廠）；OTS750無(wú)油空氣壓縮機(jī)（臺(tái)州奧突斯工貿(mào)有限公司）；HL-2恒流泵（上海精科實(shí)業(yè)有限公司），LZB-10玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)（上海榮華儀表廠）；101系列數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海葉拓儀器儀表有限公司）；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）；KQ500DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RCZ-8A智能溶出儀（天津大學(xué)精密儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 釋放度測(cè)定方法建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C1（84.6mm×250mm，5m）；流動(dòng)相：乙腈-水（v∶v=40∶60）；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣量：10L；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm。

2.1.2 儲(chǔ)備液的配制 精密稱取人參皂苷 Rd 14.5mg，置于25mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成濃度為580g/mL的溶液，作為儲(chǔ)備液待用。

取人參皂苷Rd結(jié)腸定位包衣片20片，刮去衣膜，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于人參皂苷 Rd 25mg），置于25mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，0.45m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液10mL，置于25mL容量瓶中，甲醇定容作為人參皂苷Rd樣品溶液。

2.1.3 專屬性考察 按比例稱取混合輔料25.0mg，置于25mL容量瓶中，甲醇溶解，超聲，0.45m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液5mL，置于25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，進(jìn)樣 10L。人參皂苷 Rd保留時(shí)間在11.8min，空白輔料無(wú)干擾，實(shí)驗(yàn)方法專屬性良好，結(jié)果見圖1。

圖1 專屬性考察Fig.1 Results ofspecificity

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密移取儲(chǔ)備液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL，置于25mL容量瓶中，甲醇定容，依次進(jìn)樣10L，重復(fù)進(jìn)樣3次，以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=3 856.9C+5 397.9，r=0.999 9，人參皂苷Rd在2.32g/mL～92.8g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度 精密移取儲(chǔ)備液適量，以甲醇稀釋成濃度為4.64g/mL、46.4g/mL、92.8g/mL的溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，即為日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定6d，即為日間精密度，結(jié)果見表1、表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法精密度良好。

表1 日內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of within-day precision

表2 日間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of between-day precision

2.1.6 穩(wěn)定性 分別取室溫放置0h、2h、4h、8h、12h、24h儲(chǔ)備液，以甲醇稀釋成濃度為46.4g/mL的溶液，進(jìn)樣10L，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷Rd儲(chǔ)備液24h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of stability

2.1.7 重現(xiàn)性 按照“2.1.2”項(xiàng)下方法配制6份人參皂苷Rd溶液，甲醇稀釋至適宜濃度，分別進(jìn)樣10L，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性良好。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of repeatability

2.1.8 釋放度測(cè)定方法 依照2010年版《中國(guó)藥典》二部附錄XC釋放度測(cè)定法第三法小杯法進(jìn)行測(cè)定。取制備好的人參皂苷Rd結(jié)腸定位包衣片6片，分別置于溶出杯中，加入250mL溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100r/min，溫度保持在（37±0.5）℃。按照人體正常生理特點(diǎn)，pH1.0鹽酸溶液作為人工胃液，使包衣片釋放 2h；pH6.8磷酸鹽緩沖液作為人工小腸液，使包衣片釋放4h；pH7.6磷酸鹽緩沖液（內(nèi)加適量 -葡萄糖苷酶）作為人工結(jié)腸液，使包衣片釋放6h。每次變換介質(zhì)在5min內(nèi)完成，分別于第 6h、8h、10h取樣，0.45m微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣10L，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算累計(jì)釋放度。

2.2 制備方法

2.2.1 片芯的制備 以殼聚糖為多糖材料，硬脂酸鎂為潤(rùn)滑劑，微晶纖維素為填充劑，10%的羧甲基淀粉鈉和羧甲基纖維素鈉作為崩解劑。將原、輔料進(jìn)行干燥，分別過(guò)80目篩。將人參皂苷Rd和輔料混合均勻，10%聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液制軟材，過(guò)20目篩進(jìn)行制粒，置于40℃烘箱中干燥2h，整粒后以6mm沖壓片，使每片理論片重80mg，含藥量10mg。

2.2.2 時(shí)滯層包衣 以95%乙醇溶解尤特奇 E100，制成含聚合物6%的包衣液。取適量PEG6 000（相當(dāng)于聚合物重量的15%）及滑石粉（相當(dāng)于聚合物重量的50%）置于95%乙醇中進(jìn)行預(yù)勻化，加入到尤特奇E100的溶液中，制得混懸液用40目篩過(guò)濾，得時(shí)滯層包衣液[11，12]。制好的片芯置入流化床沸騰包衣機(jī)中預(yù)熱5min，設(shè)置包衣溫度為35℃，包衣液供給速率為6mL/min。至包衣增重達(dá)到要求后取出，放入干燥箱中40℃熱處理2h。

2.2.3 pH層包衣 按3∶1稱取適量尤特奇S100和L100，95%乙醇溶解，制成含聚合物6%的包衣液。將滑石粉（相當(dāng)于聚合物重量的50%）及PEG6000（相當(dāng)于聚合物重量的15%）置于95%乙醇介質(zhì)中預(yù)勻化，后加入到尤特奇溶液中，所得混懸液40目篩過(guò)濾，得pH層包衣液[13，14]。將已包好時(shí)滯層的藥片再次放入流化床沸騰包衣機(jī)中預(yù)熱5min，設(shè)定包衣溫度為35℃，包衣液供給速率為6mL/min，至包衣增重達(dá)到要求后取出，置于干燥箱中40℃熱處理2h。

2.3 處方篩選

2.3.1 崩解劑的種類及用量 固定處方中其他輔料，取適量10%的羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉及二者1∶1的混合物分別作為崩解劑，制備結(jié)腸定位片，測(cè)定體外釋放度，考察崩解劑種類對(duì)藥物溶出的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 崩解劑種類對(duì)釋放度的影響Fig.2 Effectofdifferentdisintegranton dissolution rate

從圖中可以看出，崩解劑種類對(duì)于藥物溶出影響差異不大，溶出行為較為接近，但是羧甲基纖維素鈉和羧甲基淀粉鈉1∶1混合時(shí)崩解效果稍勝一籌。因此，最終選擇二者的混合物作為崩解劑。

分別以5%、10%、15%的羧甲基纖維素鈉和羧甲基淀粉鈉1∶1混合物做為崩解劑，制備結(jié)腸定位片，測(cè)定體外釋放度，考察崩解劑用量對(duì)藥物溶出的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 崩解劑用量對(duì)釋放度的影響Fig.3 Effectof disintegrantamounton dissolution rate

可以從圖中看出，5%的崩解劑用量效果差，釋放度達(dá)不到要求；15%的崩解劑用量在未到達(dá)結(jié)腸時(shí)，藥物已經(jīng)釋放19.2%，釋放量過(guò)大，因此最終確定崩解劑用量為10%。

2.3.2 殼聚糖用量 固定處方中其他輔料，分別以主藥含量的20%、30%、40%殼聚糖，制備結(jié)腸定位片，測(cè)定體外釋放度，考察殼聚糖用量對(duì)藥物溶出的影響，結(jié)果見圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼聚糖用量對(duì)藥物的釋放度影響較大，用量過(guò)大導(dǎo)致藥物釋放緩慢，達(dá)不到釋放要求；用量較小時(shí)，藥物在小腸中釋放量增加，使藥物在結(jié)腸部位釋放減少，故選取殼聚糖用量為30%。

圖4 殼聚糖用量對(duì)釋放度的影響Fig.4 Effect of chitosan amounton dissolution rate

2.3.3 增塑劑種類 固定處方中其他輔料，分別以聚乙二醇6 000（PEG6 000）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、檸檬酸三乙酯（TEC）為增塑劑，制備結(jié)腸定位片，測(cè)定體外釋放度，考察增塑劑種類對(duì)藥物溶出的影響，結(jié)果見圖5。從圖中可知，增塑劑種類對(duì)藥物的釋放度影響不大，但PEG6 000作為增塑劑時(shí)，得到的包衣片外觀光潔，最終確定PEG6 000為增塑劑。

圖5 增塑劑種類對(duì)釋放度的影響Fig.5 Effect of different plasticizer on dissolution rate

2.3.4 時(shí)滯層包衣增重 固定處方中其他輔料，分別考察時(shí)滯層包衣增重8%、10%、12%對(duì)藥物溶出的影響，制備結(jié)腸定位片，測(cè)定體外釋放度，結(jié)果見圖6。時(shí)滯層包衣增重對(duì)藥物的釋放度影響較大，在pH層逐漸被溶蝕后，時(shí)滯層開始發(fā)揮作用，當(dāng)時(shí)滯層包衣增重為8%時(shí)，藥物在小腸液中釋放較多，當(dāng)時(shí)滯層包衣增重為12%時(shí)，藥物釋放延遲，10小時(shí)的累積釋放度小于 70%，因此最終選擇時(shí)滯層的包衣增重為10%。

圖6 時(shí)滯層包衣增重對(duì)釋放度的影響Fig.6 Effect of increased weight(T)on dissolution rate

2.3.5 pH層包衣增重 分別考察pH層包衣增重8%、10%、12%對(duì)藥物溶出的影響，固定處方中其他輔料，制備結(jié)腸定位片，測(cè)定體外釋放度，結(jié)果見圖7。從圖中可以看出，pH層包衣增重對(duì)藥物的釋放度影響顯著，8%的包衣增重的藥物在小腸中釋放已將近30%，12%的包衣增重藥物最終釋放量不到70%，均達(dá)不到釋放要求，故將處方中pH層包衣增重控制在10%。

圖7 pH層包衣增重對(duì)釋放度的影響Fig.7 Effect of increased weight(pH)on dissolution rate

3 結(jié)論

以10%的羧甲基纖維素鈉和羧甲基淀粉鈉同等比例混合物作為崩解劑、用量10%，殼聚糖用量30%，PEG6 000作為增塑劑，時(shí)滯層包衣增重及pH層包衣增重均為10%時(shí)可獲得較為理想包衣片。依照處方進(jìn)行3組平行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)得包衣片在pH1.0鹽酸溶液中釋放度小于5%，胃部無(wú)滯留，在pH7.6磷酸鹽緩沖液釋放度可達(dá)80%以上，符合《中國(guó)藥典》對(duì)腸溶制劑的要求，達(dá)到較好結(jié)腸定位效果。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用沸騰流化包衣機(jī)對(duì)片芯進(jìn)行包衣，與傳統(tǒng)的包衣鍋相比，包衣重現(xiàn)性好，得到的包衣片也更加均勻。本實(shí)驗(yàn)在人工結(jié)腸液中加入 -葡萄糖苷酶，可更加真實(shí)地反應(yīng)藥物釋放情況。在處方篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，崩解劑及增塑劑的選擇對(duì)于結(jié)腸包衣片的釋放度影響較小，殼聚糖用量及包衣層增重對(duì)于釋放度影響較大，或可進(jìn)行再設(shè)計(jì)以得到更加科學(xué)的處方工藝。

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