莊 倩，趙曉娟，宋福強*

(1.黑龍江省森林植物園，黑龍江 哈爾濱 150081；2.黑龍江大學 生命學院，黑龍江 哈爾濱 150080)

叢枝菌根真菌(Glomusmosseae)是一類土著真菌，在自然界中分布廣泛且歷史悠久。該類真菌能夠與大部分高等植物根系建立共生關系并形成叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)[1]。植物形成AM后能夠促進根系對養(yǎng)分的吸收[2]，提高植物對逆境脅迫的抵抗能力[3-6]，對重金屬及有機農藥污染的土壤也具有較好的修復能力[7]，從而改善植物的生長境況。結瘤因子(脂殼寡糖，LCOs)被定義為根瘤菌在豆科植物根系分泌物(類黃酮)作用下分泌合成的一類多糖類物質[8]，這類物質能夠引起宿主植物根系在形態(tài)上發(fā)生巨大變化，在根系結瘤過程中發(fā)揮著極為重要的作用[9]。LCO不但可以促進豆科植物根系結瘤固氮，而且對某些非豆科類植物根系細胞分裂等也同樣具有一定的刺激作用[10]。

紫穗槐(Amorphafruticosa)在世界范圍內廣泛分布，屬于木本豆科、紫穗槐屬，是一種耐鹽堿、耐寒、耐旱、耐濕、抗風沙、抗逆性極強的多年生落葉叢生灌木，在荒山坡地、道路旁、河岸、鹽堿地均可生長；同時，紫穗槐具有很高的經濟效益，其莖條萌發(fā)力極強，是優(yōu)良的飼料植物[11]。紫穗槐不但能形成根瘤，同時還能夠叢枝菌根。前期研究結果表明AM真菌能夠顯著提高紫穗槐結瘤數量并提高其固氮能力[12]。本研究繼續(xù)開展AM真菌與紫穗槐共生體根系分泌物對根瘤菌結瘤因子的誘導情況，以及結瘤因子對紫穗槐的菌根形成、生長情況的影響，研究結果為進一步揭示AM真菌促進紫穗槐結瘤數量固氮能力的機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株為紫穗槐種子，根瘤菌菌株為紫穗槐中慢生根瘤菌(Mesorhizbiumamorphae)，AM真菌為摩西球囊霉(Glomusmosseae)。

1.2 方法

1.2.1 盆栽苗木設計 選擇飽滿的紫穗槐種子，用溫水搓洗2～3次，再用KMnO4(濃度0.3%)浸泡3～4 h，用清水沖洗干凈。在恒溫水浴鍋(25℃)中清水浸種1 d。然后淘洗2～3次，催芽。苗木盆栽培養(yǎng)基質按花土(5)∶蛭石(3)∶細沙(2)比例混勻，高壓滅菌1 h后，在陰涼處干燥、備用。

盆栽苗木設2個處理：1)單獨接種AM真菌處理(AM)：當紫穗槐種子播種15 d時施入AM真菌接種物，接種量為盆栽介質體積的5%；2)非接種處理(CK)：紫穗槐種子播種15 d時加入與單接種AM處理等量的滅活AM真菌接種物及其濾出液。每種處理設10個重復。

1.2.2 侵染率的測定 采用J.M.Phillip[13]等的KOH脫色-酸性品紅染色法，玻片鏡檢測定侵染根段數。

1.2.3 根系分泌物的提取 根據紫穗槐侵染率的實時測定結果，選取紫穗槐出苗15 d(菌根侵染率0%)和菌根侵染率為15%、25%、50%及100%時期根系表面土壤各100 g，樣品分裝在三角瓶中并加入濃度為80%的乙醇500 mL，在90℃水浴下持續(xù)加熱3 h后，采用濾紙抽濾，再用0.22 μm微孔濾膜過濾，利用旋轉蒸發(fā)儀控制溫度在40℃的條件下對獲得濾液進行蒸發(fā)，直至10 mL為止，然后放到冰箱中保存。同時提取相應時期CK處理苗木的根系分泌物為對照。

1.2.4 結瘤因子的提取與制備 首先配制一定量的YMA液體培養(yǎng)基，121℃下高壓滅菌30 min，冷卻后接種適量根瘤菌。28℃、160 r·min-1搖床上培養(yǎng)至OD值0.6～0.8，制成種子液。在三角瓶中裝入300 mL YMA液體培養(yǎng)基，同時接入種子液2.5 mL，在28℃ 160 r·min-1搖床上培養(yǎng)2 d，再向搖瓶中分別加入5 mL前期提取的菌根分泌物和對照處理根系分泌物，以此作為根瘤菌結瘤因子的誘導劑，繼續(xù)搖培至OD值1～1.2。以不加誘導劑作為對照。用正丁醇對所獲得的液體培養(yǎng)基以3∶2比例進行抽提2次，得到的上清液再利用孔徑為0.45 μm的濾膜抽濾后，再蒸發(fā)至1 mL，然后轉入1.5 mL離心管中，利用 4℃離心機12 000 r·min-1下離心5 min，得到的上清液低溫保存過夜，次日再離心3 min，獲得的上清液保存在乙腈中備用。

1.2.5 HPLC檢測結瘤因子 對檢測樣品過C18柱(φ4.6 mm×250 mm)，然后進行線性梯度洗脫，對洗脫物進行結瘤因子分析。HPLC檢測波長為214 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫25℃，洗脫時間1 h。

1.2.6 結瘤因子的生物檢測 采用根毛變形試驗方法對結瘤因子的生物活性進行檢測[14]。首先配制瓊脂含量為1.5%的溶液，121℃高壓滅菌15 min后倒平板、備用。紫穗槐種子用濃度1% 的NaOH溶液反復淘洗，直至去除種子表皮上的蠟質，隨后再用溫水反復沖洗后，放到2%的NaOCl溶液浸泡2 min，再用滅菌蒸餾水再沖洗干凈。處理后的種子放到先前準備好的水瓊脂平板內，每個平板放10粒種子，25℃恒溫避光培養(yǎng)，種子發(fā)芽以后仍要繼續(xù)培養(yǎng)15 d以上。用滅菌的解剖刀將嫩根部切下放到載玻片上，并滴加1滴結瘤因子檢測液，黑暗條件下25℃培養(yǎng)24 h。隨后將載玻片置于顯微鏡下，滴加甲基藍染液進行染色，觀察根系的變化。

1.2.7 結瘤因子回接紫穗槐 取結瘤因子10 mL，在40℃旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，然后加1 mL蒸餾水溶解并梯度稀釋。結瘤因子回接試驗設6個處理：1)單接種AM真菌處理(AM+)：按照盆栽培養(yǎng)基質5%(v/v)的量向基質中接種摩西球囊霉接種物，同時播種預先處理好的紫穗槐的種子；2)單接種結瘤因子(Nod1+)：盆栽苗木只加入結瘤因子稀釋液10 mL；3)單接種結瘤因子(Nod2+)：盆栽苗木只加入結瘤因子稀釋液20 m；4)雙接AM真菌和結瘤因子(AM+Nod1+)：對盆栽紫穗槐加入AM真菌接種物并加入結瘤因子稀釋液10 mL；5)雙接AM真菌和結瘤因子(AM+Nod2+)：對盆栽紫穗槐加入AM真菌接種物并加入結瘤因子稀釋液20 mL；6)非接種處理(CK)：播種紫穗槐種子的同時加入與單接種AM真菌處理等量滅活的AM真菌接種物及其濾出液。每個處理設3個重復。

不同處理的盆栽紫穗槐隨機擺放在溫室內，常規(guī)培養(yǎng)。當苗子生長到第10周時，每個處理隨機選取紫穗槐苗木10株，分別測定苗木菌根侵染率、植株各項生長指標，以及每株紫穗槐苗木根系上根瘤原基的數量。

1.2.8 數據處理 應用SPSS 17.0軟件對獲得的數據進行單因素方差分析和LSD多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 根系分泌物對根瘤菌結瘤因子誘導

通過HPLC檢測結果表明，不同處理樣品圖譜的各時間段誘導的結瘤因子出峰時間不盡相同，且同一時間段AM處理與CK處理的出峰時間也有所差異，出峰數量也各不相同。

表1 不同處理紫穗槐在不同時期根系分泌物對根瘤菌結瘤因子誘導HPLC分析出峰數量Table 1 The peak number of HPLC related to rhizobia nod factor induced by different periods of Amorpha fruticosa root exudates in different treatments

從表1可以看出，AM處理組誘導的根瘤菌結瘤因子相較空白對照組來說在侵染率0%與10%時期產生的峰值數量基本相同，但在菌根侵染率在25%時期特異峰最多，產生的差異峰達到24種之多。

對菌根侵染率在25%時期AM處理與對照處理可能為結瘤因子且明顯的差異峰進行結瘤因子生物檢測(根毛變形試驗)，結果表明，在33 min出現的色譜峰能夠誘導紫穗槐的根毛產生變形，根毛頂端膨大(圖1c)，且呈 “Z”字形彎曲(圖1d)，可以認為33 min左右出現的峰為結瘤因子。

注：a、b為對照；c、d為產生變形的根毛(400×)

由于HPLC檢測的物質量與峰面積呈正比，因此對33 min出現的色譜峰進行面積測定。由表2可知，紫穗槐苗木形成菌根的不同時期，菌根根系分泌物對根瘤菌結瘤因子的誘導量都顯著高于對照處理。苗木在生長不同時期根系分泌物誘導根瘤菌產生結瘤因子的峰面積也有所不同，在菌根侵染率25%與100%時期，無論是AM處理還是CK處理之間不存在顯著差異(P>0.05)，但都顯著高于菌根侵染率0%和10%時期(P<0.05)。

2.2 結瘤因子回接紫穗槐苗木的效果

當苗子生長到第10周時，分別測定了不同處理紫穗槐苗木的菌根侵染率、株高、鮮重以及根瘤原基的數量。從表3可以看出，AM真菌與結瘤因子混合處理的紫穗槐苗木菌根侵染率顯著高于單接種AM真菌處理，且隨著結瘤因子濃度的增加，效果越顯著。在沒有接種AM真菌處理的苗木根系內沒有檢測到菌根侵染率，表明苗木培養(yǎng)基質滅菌比較測底，沒有土著AM真菌存在。AM+Nod2+處理的苗木菌根侵染率、株高、鮮重及根瘤原基數量都顯著高于其他處理(P<0.05)，而CK處理最差。單接種結瘤因子與對照相比提高了根瘤原基的數量并促進了苗木的生長，且Nod2+優(yōu)于Nod1+。單接種AM真菌也同樣促進了苗木的生長，但效果顯著低于雙接種(AM+Nod+)處理(P<0.05)。

表2 不同處理根系分泌物誘導根瘤菌產生結瘤因子的峰面積Table 2 The peak area of rhizobia nodulation factors induced by root exudates in different treatments

注：表中數據為平均值(n=3)；不同大寫字母表示同行數據存在顯著差異，不同小寫字母表示同列數據存在顯著差異(P<0.05)。

表3 結瘤因子回接對紫穗槐苗木的影響結果Table 3 The effect of nodulation factor inoculation on A.fruticosa seedlings

注：表中數據為平均值(n=10)；不同小寫字母表示同列數據存在顯著差異(P<0.05)。

3 結論與討論

AM真菌能夠與紫穗槐根系形成菌根共生體，侵染率可達100%；紫穗槐菌根侵染率在25%時的根系分泌物能夠有效地誘導根瘤菌產生更多的結瘤因子；紫穗槐菌根分泌物對根瘤菌誘導出的結瘤因子能夠使紫穗槐根毛頂端膨大形成根瘤原基；結瘤因子與AM真菌混合接種能顯著提高紫穗槐苗木的菌根侵染率、株高、鮮重和根瘤原基的數量，且隨著結瘤因子含量的增加效果越顯著。

結瘤因子是在宿主植物根系分泌的類黃酮作用下，根瘤菌合成并分泌一類多糖信號分子(脂殼寡糖)。不同根瘤菌能形成2～60種的結瘤因子[15]。結瘤因子的質與量隨著根瘤菌種類的不同而發(fā)生改變并具有種屬專一性。結瘤因子的合成決定于結瘤基因nod的表達，nod基因種類多樣，其產物可以合成結瘤因子[16]。nod基因的表達起始于根瘤菌感知類黃酮類物質[17]。類黃酮類物質能夠誘導根瘤菌nodD調節(jié)基因的表達，隨后啟動nodABC的表達。類黃酮與NodD調節(jié)蛋白的早期接觸會激活nod基因的轉錄從而合成結瘤因子以產生根瘤原基。AM真菌在與植物形成共生體-菌根時，高等植物分泌的類黃酮物質被公認為共生體形成和發(fā)展的初始信號[18]。本研究發(fā)現紫穗槐菌根侵染率在25%時期的根系分泌物能夠有效誘導根瘤菌產生更多的結瘤因子，但是否與此時紫穗槐分泌更多的類黃酮物質有關，還有待于進一步研究。

結瘤因子能夠使根瘤菌進入根部以及皮層細胞，并誘導結瘤基因的表達以及細胞分化，引起根瘤原基的形成[19]。結瘤因子還被發(fā)現能夠促進種子萌發(fā)、植物地上部分的生長[20]以及側根的伸長[21]。C.Chen[22]等發(fā)現Bradyhizobiumjaponicum的結瘤因子能夠加速西紅柿的開花結果，并且能夠提高西紅柿的產量，同時結瘤因子還能夠提升干旱條件下大豆植株的產量等[23]。本研究進一步證明了AM真菌與結瘤因子混合接種能夠顯著提高紫穗槐的生物量和根瘤原基的數量。研究結果對揭示AM真菌在生態(tài)系統(tǒng)中的作用奠定了一定的理論基礎。

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