王曉麗 秦杰 王敏 王利祥 杜維俊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

根瘤菌可以與豆科植物形成不同類型的根瘤，如和大豆、百脈根形成有限型根瘤；和苜蓿、豌豆形成無限型根瘤兩種類型，從而能夠共生固氮，其固氮量占生物固氮量的60%［1］。大豆作為重要的共生固氮經(jīng)濟作物，其生長所需氮素營養(yǎng)的50%-90%是由根瘤菌-大豆共生體系固定的，因此對大豆根瘤菌的研究具有巨大的實際應(yīng)用價值［2］。前人研究表明根瘤菌具有明顯的生物地理分布特征。Zhang等［3］利用種水平的rpoB高通量測序方法，在對我國東北、黃淮海和南方3個大豆種植區(qū)土壤中的土著大豆根瘤菌的研究中，發(fā)現(xiàn)黃淮海的土著大豆根瘤菌多樣性最高，包括，Bradyrhizobium sp.III、B. japonicum、B. elkanii、B. huanghuaihaiense、Sinorhizobium fredii和S. sojae。而位于黃淮海的山西作為大豆的起源地之一，大豆種質(zhì)資源豐富。根瘤菌與大豆在進(jìn)化過程中是相互影響，共同進(jìn)化的，因此與其共生的根瘤菌資源也相當(dāng)豐富。但是，針對山西大豆根瘤菌的大量分離卻報道很少。

目前，對于根瘤菌的分類采用表型和基因型相結(jié)合的多相分類辦法。根瘤菌的表型分析，包括在不同碳源和氮源培養(yǎng)基上的生長情況、在YMA上生長的單菌落形態(tài)、耐鹽性、對不同生長溫度、pH的耐受性，BTB產(chǎn)酸或產(chǎn)堿判定等。表型的測定，不僅工作量大，易受環(huán)境影響，重復(fù)性還差，但仍是根瘤菌分類鑒定及發(fā)表新種的必需條件［4］。根瘤菌的基因型分析，包括DNA（G+C）mol%的測定及DNA-DNA雜交、16S/23S rRNA同源性分析、共生基因（NodA、NodC、NifH）同源性分析、限制性片段長度的多型性、隨機擴增DNA片段的多型性、REPBOX/BOX-PCR/ERIC-PCR指紋圖譜分析、持家基因MLSA（多位點序列分析）等［5-7］。相較于表型的鑒定，隨著測序技術(shù)的高速發(fā)展，基因型的測定快速、準(zhǔn)確，已成為分類的主要依據(jù)。16S rRNA進(jìn)化樹確定其系統(tǒng)發(fā)育地位構(gòu)成多相分類的主干，通常被用來確定屬、種的分類。然而，16S rRNA基因較高的保守性，使其在種以下水平的分類應(yīng)用中受到限制［8］。指紋圖譜中，尤其是BOX-PCR，操作簡便，不需要菌株的特異性 DNA 探針，對基因組的要求不高，容易獲得較為豐富的擴增條帶，這說明BOX-PCR指紋圖譜分析更適合于種及種以下水平上遺傳多樣性研究［9］。

根瘤菌的利用在減少氮肥的使用、增加產(chǎn)量和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面有巨大的潛能。但國內(nèi)的根瘤菌使用情況與巴西、美國、阿根廷等幾個大豆主產(chǎn)國還相距甚遠(yuǎn)［10］。由于土壤中土著根瘤菌的存在，使得菌劑的競爭性較差，接種效果差強人意［11］。通過對土著根瘤菌的分離，篩選出既適應(yīng)當(dāng)?shù)赝寥罈l件，競爭效果好，又與地方大豆品種共生固氮效果好的根瘤菌，可以有效避免這一問題。因此，本研究通過分離、鑒定山西的土著根瘤菌，并將其分類，以期通過苗期篩選出與山西主栽大豆品種的匹配性好的土著根瘤菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和大豆品種：菌株分離自山西大同廣靈（黃壤沙土）、太原清徐（鹽堿土）、晉中太谷（黃壤土）。大豆品種為晉大88號黃豆，科豐1號黑豆。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 YMA培養(yǎng)基：甘露醇10 g，酵母粉3 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.25 g，KH2PO40.25 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.8-7.0。

剛果紅培養(yǎng)基：1 000 mL YMA培養(yǎng)基中加入0.5%的剛果紅溶液5 mL。

BTB培養(yǎng)基：YMA液體培養(yǎng)基中加入溴百里香酚藍(lán)（BTB）使其終濃度為0.01%，調(diào)節(jié)溶液pH，使溶液呈淡黃綠色。

EasyTaq＠ DNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 根瘤菌的分離與純化 選取不同大豆品種根上個大、飽滿的根瘤，當(dāng)天進(jìn)行分離培養(yǎng)。分離、純化方法參照Peter等［6］方法，具體如下：在超凈工作臺中，依次放置6個滅菌的培養(yǎng)皿，依次倒入無菌水、75%乙醇、5%的NaClO溶液，后3個倒入無菌水。將取下的根瘤依次放入培養(yǎng)皿中，每個浸泡的時間為5 min，然后用鑷子將根瘤夾破，將創(chuàng)傷面貼在含有剛果紅的YMA培養(yǎng)基上。在28℃下倒置培養(yǎng)3-4 d。挑取未被染色的乳白色、粘稠狀的菌落在剛果紅YMA培養(yǎng)基上多次劃線，獲得單菌落。之后在培養(yǎng)基上劃線擴繁，制備成25%的甘油菌并保存-80℃冰箱。

1.2.2 根瘤菌的表型與基因鑒定 將分離的菌株進(jìn)行關(guān)鍵結(jié)瘤固氮基因nifH、nodA PCR擴增，對能擴增出目標(biāo)條帶的菌株，再進(jìn)行16S rDNA擴增，以及BTB染色鑒別。引物如表1所示。菌液PCR反應(yīng)體系為 ：EasyTaq DNA Polymerase 0.3 μL，10×EasyTaq＠ Buffer 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.3 μL，F(xiàn) 引物 0.3 μL，R引物0.3 μL，菌液培養(yǎng)3 d左右（OD600=0.5），DNA模板（煮沸的菌液）1 μL，最后ddH2O補足到15 μL。nifH PCR 反應(yīng)程序為 ：94℃預(yù)變性 4 min，94℃ 變性 30 s，56℃ 復(fù)性 30 s，72℃延伸 1 min，30個 循 環(huán) ；72℃ 延 伸 10 min。nodA和 16S rDNA PCR反應(yīng)程序分別是57℃復(fù)性30 s，72℃延伸36 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1.5 min，其余與nifH PCR反應(yīng)程序一樣。將PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送去北京六合華大進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫Blast后，選擇相似性較高的序列，在MEGA7.0軟件利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹來確定根瘤菌的分類地位。

表1 根瘤菌基因鑒定所用引物Table 1 Primers for gene identification of rhizobia

1.2.3 BOX-PCR 用 BOX A1R（5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′）擴增根瘤菌DNA的重復(fù)區(qū)域。PCR 反應(yīng)體系與1.2.2一樣。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性 4 min，94℃ 變性 1 min，53℃ 復(fù)性 1 min，72℃延伸5 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。80 V電壓下，BOX-PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳2.5 h，將照膠圖片保存為TIFF格式。所有跑膠圖片在Bionumerics＠7.5軟件采用UPGMA算法和Cosine系數(shù)進(jìn)行聚類分析，以70%的相似性進(jìn)行根瘤菌的分類。

1.2.4 根瘤菌與大豆的匹配性篩選 將蛭石滅菌，裝入10 cm×10 cm的雙層營養(yǎng)缽中。晉大88號黃豆和科豐1號黑豆用70%的無水乙醇進(jìn)行表面消毒5 min，再用5%的NaClO消毒5 min，之后用無菌水清洗3次，播種到營養(yǎng)缽中并在溫室中培養(yǎng)。一周后間苗，每個營養(yǎng)缽留一株長勢一致的大豆。用無氮營養(yǎng)液澆灌，待第一片真葉展開時，每株大豆接3 mL菌液（OD600=0.5），以不接菌作對照，接種USDA110做參照菌株，3次重復(fù)。4周后進(jìn)行指標(biāo)測定。測定指標(biāo)包括株高、地上部分鮮重、根鮮重、植株干重、根瘤數(shù)、根瘤鮮重。

1.2.5 數(shù) 據(jù) 分 析 采 用 Excel、DPS（V9.01）、MEGA7.0、Bionumerics＠7.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 根瘤菌的分離、純化

對菌落形態(tài)進(jìn)行觀察后，發(fā)現(xiàn)菌株的單菌落一般為圓形或橢圓形，表面濕潤，不透明，乳白色，微微凸起，這些生長表型均同根瘤菌的基本特征相符（圖1-A）。快生型根瘤菌一般生長3 d，菌落直徑就可達(dá)到2 mm，慢生型根瘤菌生長5-7 d，菌落直徑為1 mm。共分離出203株菌，并用分離地將其命名，分離自山西大同廣靈、太原清徐和晉中太谷分別命名為GL、QX和TG（附表1）。

圖1 根瘤菌表型鑒定Fig.1 Phenotype identification of rhizobia

2.2 根瘤菌的表型與分子鑒定

nifH固氮基因擴增條帶為460 bp，nodA結(jié)瘤基因擴增條帶為660 bp，16S rDNA擴增條帶為1 400 bp（圖2）。203株菌中有187株可以擴增出nifH和nodA基因，基本確定為根瘤菌。對這187株根瘤菌進(jìn)行BTB染色鑒別，其中172株快生型根瘤菌，產(chǎn)酸變黃（圖1-B）；15株慢生型根瘤菌，產(chǎn)堿變藍(lán)（圖1-C）。將前25株快生型根瘤菌的nifH、nodA、16S rDNA的PCR產(chǎn)物測序，3個基因都屬于中華根瘤菌屬（Sinorhizobium），且與S. fredii有99%以上的相似性，但是并不能很好將菌株區(qū)分。因此，不再依次對后續(xù)菌株進(jìn)行測序。挑選BOX-PCR三類帶型不同的慢生型根瘤菌，進(jìn)行16S rDNA測序鑒定種屬，均屬于慢生型根瘤菌（Bradyrhizobium），以能與大豆結(jié)瘤的慢生型根瘤菌Bradyrhizobium japonicum，B. diazoefficiens，B. liaoningense，B. elkanii，B.yuanmingense，B. canariense，B. huanghuaihaiense，B. daqingense做參比菌株構(gòu)建進(jìn)化樹，表明QX13和B. diazoefficiens同源性較高，GL67、GL76和B.daqingense同源性較高（圖3-6）。

圖2 根瘤菌基因鑒定結(jié)果Fig. 2 Gene identification results of rhizobia

圖3 nifH 進(jìn)化樹Fig. 3 nifH phylogenetic tree

圖4 nodA 進(jìn)化樹Fig. 4 nodA phylogenetic tree

圖5 16S rDNA 進(jìn)化樹Fig. 5 16S rDNA phylogenetic tree

圖6 慢生型根瘤菌16S rDNA 進(jìn)化樹Fig. 6 16S rDNA phylogenetic tree of Bradyrhizobium

2.3 根瘤菌BOX-PCR結(jié)果

將全部根瘤菌進(jìn)行BOX-PCR，其電泳條帶的大小在5 000 bp-400 bp之間，條帶數(shù)目在25-3條不等（圖7）。將187株根瘤菌進(jìn)行BOX-PCR，去除條帶完全一致的菌株，用剩余的85株菌和兩個參比菌株USDA110、S. fredii 45436進(jìn)行聚類分析。這87株根瘤菌以45%的相似性可分為A、B、C、D和E五大類群，其中B類群為慢生型根瘤菌，A、C、D和E類群為快生型根瘤菌，根瘤菌QX13表型和16S rDNA鑒定為慢生型，卻聚類到快生型根瘤菌中的A群中，GL19表型鑒定為快生型，卻聚類到慢生型根瘤菌中的B群中（圖8）。以70%的相似性可將這87株菌共分為18類，兩個參比菌株各為一類，本實驗分離的根瘤菌分為16類，表明分離的土著根瘤菌與兩個參比菌株相似性差距較大。16個聚類中11個由少于3個分離株組成，3個由4個分離株組成，1個由5個分離株組成，剩下的第一、三、六類聚到的根瘤菌株較多。第一類的9株菌株全部分離自廣靈；第三類32株菌株，除1株分離自廣靈外，其余全部分離自太谷；第六類14株菌株，7株分離自太谷，7株分離自廣靈，但其在72%的水平上便各自分為一類，第一小類9株中，7株分離自太谷，2株分離自廣靈，第二小類5株，全部分離自廣靈。表明根瘤菌具有較強的地域性。

圖7 BOX-PCR電泳結(jié)果Fig. 7 Results of BOX-PCR electrophoresis

圖8 BOX-PCR聚類結(jié)果Fig.8 Results of BOX-PCR clustering

2.4 根瘤菌與大豆的匹配性篩選

從分離的16類土著根瘤菌中，每一類挑選出一株代表性菌株進(jìn)行共生匹配性篩選。接種根瘤菌的晉大88號植株長勢整體要比CK好，接種效果明顯（圖9-A），接種根瘤菌的科豐1號植株長勢和CK差別不大，接種效果不明顯（圖9-B）。接種不同根瘤菌的2個大豆品種都在株高、地上干重和根干重存在顯著差異（表2）。接種不同根瘤菌的2個大豆品種也都在根瘤鮮重、根瘤干重和根瘤數(shù)有顯著差異（表3）。表明接種的菌株都可以和這兩個大豆品種結(jié)瘤，但不同的根瘤菌與大豆品種匹配性存在較大差異。接種同一根瘤菌的晉大88號的根瘤性狀要好于科豐1號，除接種GL16和QX13外，其根瘤大小沒有太大區(qū)別（圖10），表明科豐1號較晉大88號對根瘤菌的識別更加嚴(yán)格。通過對根瘤生物量和植株生物量的比較，發(fā)現(xiàn)其并非嚴(yán)格對應(yīng)，根瘤性狀最好的，地上性狀并非最好，可能與根瘤菌的固氮能力有關(guān)。篩選出與晉大88號匹配性較好的根瘤菌GL11和GL43，其地上部分干重較接種USDA100分別增加38.5%、30.1%；根干重分別增加22.2%、27.8%；根瘤鮮重分別增加24.3%、41.5%；根瘤干重分別增加36.6%、31.0%。篩選出與科豐1號大豆匹配性較好的根瘤菌TG37，其株高、地上干重、根干重、根瘤鮮重、根瘤干重和根瘤數(shù)較接種USDA110分別增加8.1%、15.0%、28.6%、27.3%、44.3%和60.6%。

圖9 根瘤菌與大豆的匹配性實驗的大豆植株長勢Fig.9 Soybean plant growth in the matching experiment between rhizobia and soybean

表2 根瘤菌與大豆匹配性篩選中植株性狀的比較Table 2 Comparison of plant traits between rhizobium and soybean in matching screening

表3 根瘤菌與大豆匹配性篩選中根瘤性狀的比較Table 3 Comparison of nodule traits between rhizobium and soybean in matching screening

圖10 根瘤菌與大豆的匹配性實驗的根瘤圖片F(xiàn)ig. 10 Picture of nodules in the matching experiment between rhizobia and soybean

3 討論

本研究從山西大同廣靈、晉中太谷、太原清徐共分離203株菌，其中187株根瘤菌可以擴增出nifH和nodA基因。通過BTB染色鑒定172株為快生型根瘤菌，包括了大同廣靈的84株，晉中太谷的88株；15株為慢生型根瘤菌，包括了大同廣靈的12株，太原清徐的3株。挑選前25株快生型根瘤菌進(jìn)行nifH、nodA和16S rDNA測序，與相似菌株建立進(jìn)化樹，表明其都屬于S. fredii。挑選3株慢生型根瘤菌進(jìn)行16S rDNA測序，構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示從大同廣靈的分離的兩株GL67、GL76屬于 B. daqingense，在山西廣靈是首次分離出來。B.daqingense最先從黑龍江省大慶市分離鑒定出來［15］。在酸性和中性土壤中一般以慢生根瘤菌為主，在堿性土壤中一般以費氏中華根瘤菌（S. fredii）為主［16］。QX13屬于B. diazoefficiens，是從清徐的鹽堿土中分離。葛誠等［17］從遼寧鐵嶺地區(qū)的鹽堿土中分離出超慢型大豆根瘤菌。在新疆鹽堿地中，S. fredii（45%）和B. liaoningense（43%）是大豆根瘤菌的優(yōu)勢類群，B. japonicum、B. yuanmingense和Rhizobium為次要類群［18］。同為鹽堿土，因地理位置和氣候條件的不同，大豆根瘤菌種類也有較大差異。

不同的生態(tài)區(qū)，大豆主栽品種和農(nóng)家品種各不相同。張璐等［19］通過宏基因組高通量測序分析了大豆根區(qū)、根際到根瘤的細(xì)菌群落構(gòu)成，發(fā)現(xiàn)大豆對細(xì)菌群落的構(gòu)成有明顯的逐層過濾和富集作用，其中在大豆非根際土壤中的優(yōu)勢根瘤菌是Bradyrhizobium屬和 Mesorhizobium屬，在根際土壤中主要的優(yōu)勢根瘤菌是Sinorhizobium屬和 Rhizobium屬，根瘤內(nèi)部的優(yōu)勢菌是Sinorhizobium屬。大豆對根瘤菌的特異性識別，使得大豆根瘤菌的分布差異更加明顯。史清亮等［20］從山西分離根瘤菌情況表明S.fredii為優(yōu)勢菌，占分離菌總數(shù)的90%，而且菌株類型也較多，分布最廣，抗逆性較強，是山西省大豆侵染結(jié)瘤的主要類群和優(yōu)勢資源菌株，與此次的分離結(jié)果相同。張紅俠等［21］還從山西分離出兩類慢生型根瘤菌為B. liaoningense和B. japonicum。

利用BOX-PCR以45%的相似性將87株根瘤菌分為A、B、C、D和E五大類群，其中B類群為慢生型根瘤菌，A、C、D和E類群為快生型根瘤菌，根瘤菌QX13表型和16S rDNA鑒定為慢生型，卻聚類到快生型根瘤菌中的A群中，GL19表型鑒定為快生型，卻聚類到慢生型根瘤菌中的B群中，QX13和GL19在59%的相似性上都獨自聚為一類，可能是不同的PCR儀、不同批次電泳、電泳液對結(jié)果的影響［22］。在BOX-PCR分析中，相似度低于70%的菌株被認(rèn)為是差異較大的，并被單獨分為一類［23］。以70%的相似性可將這87株菌分為18類，兩個參比菌株各為一類，本實驗分離的根瘤菌分為16類，分離的土著菌株在基因組上差別較大，而且，從同一地區(qū)分離的菌株一般聚到一類，與王衛(wèi)衛(wèi)等［24］對東北三省的根瘤菌分類情況相似，說明根瘤菌具有較強的地域性分布。綜合表明山西的根瘤菌資源豐富、種類多樣。

根瘤菌與大豆復(fù)雜識別調(diào)控機制，造就了兩者極強的種屬特異性，環(huán)境也對共生固氮的效果產(chǎn)生較大影響，篩選出適應(yīng)性廣，競爭力強的根瘤菌一直是科研工作者努力的目標(biāo)。張紅俠等［25］通過蛭石初篩和土壤復(fù)篩獲得的優(yōu)良耐旱菌株 B.liaoningense4345和 S. fredii4338，接種晉豆25可顯著提高植株生物量、全氮量和產(chǎn)量，具有較強競爭能力，具有良好的應(yīng)用前景。蔣攀等［26］綜合水培實驗、盆栽和大田小區(qū)試驗篩選出了與四川大豆主栽品種貢選號、南豆號匹配性最佳的菌株S65。本研究結(jié)果顯示兩個大豆品種都可以和16種根瘤菌結(jié)瘤，晉大88的結(jié)瘤效果整體比科豐1號的好，不管是接種分離的土著根瘤菌，還是USDA110。表明科豐1號對根瘤形成調(diào)控更加嚴(yán)格。結(jié)瘤固氮是高耗能的過程，豆科植物通過結(jié)瘤自調(diào)控（AON）來調(diào)控碳氮平衡，通過地上部分生物量的比較，也可以部分解釋科豐1號的結(jié)瘤效果更差。通過匹配性篩選，表明不同的根瘤菌與大豆品種匹配性存在較大差異，這與伍慧等用8株優(yōu)良大豆根瘤菌與不同地區(qū)27個大豆主栽品種的匹配性研究結(jié)果相似［27］。與晉大88號匹配性較好的是GL11和GL43，其地上部分、根和根瘤的生物量都較接種USDA110增加在22.2%-41.5%。與科豐1號匹配性較好的是TG37，其地上干重、根干重、根瘤鮮重、根瘤干重和根瘤數(shù)較接種USDA110增加在15.0%-60.6%之間。為后續(xù)研究提供候選菌株。

4 結(jié)論

本研究從山西分離出187株根瘤菌，172株為快生型根瘤菌，屬S. fredii，是當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢菌，15株為慢生型根瘤菌，分別屬B. diazoefficiens和 B.daqingense。BOX-PCR聚類表明，此次分離的根瘤菌分為16類，表明山西根瘤菌資源豐富，種類繁多。通過苗期的匹配性篩選，能夠與晉大88號共生固氮效果好的是GL11和GL43，與科豐1號共生固氮效果好的是TG37。為后續(xù)的大田實驗提供菌劑資源。

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