崔潔冰 張萌 張瑩婷 徐進

（南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037）

柳杉（Cryptomeria fortunei）為杉科（Taxodiaceae）柳杉屬（Cryptomeria）常綠高大喬木，喜山地氣候及條件良好的酸性土壤，具有側(cè)根發(fā)達、生長迅速、適應(yīng)性強、樹形優(yōu)美且能凈化空氣、改善環(huán)境等特性［1-2］，是中國南方優(yōu)良的用材和園林樹種。天然種群集中分布于中國東南的天目山、武夷山、日本本州島及九州島等地，長江以南省區(qū)也多有栽培［3］。但其生長和分布常受到干旱、寒冷等極端環(huán)境的制約，隨著全球氣候變化以及極端天氣頻繁發(fā)生，柳杉的生長發(fā)育受到了極大的影響。

低溫是影響自然界植物生存的主要環(huán)境因子之一，也是限制植物地理分布的關(guān)鍵因素［4］。一般來說，溫度降低時會導(dǎo)致植物的各種生理活動減慢，生長發(fā)育變緩，當(dāng)?shù)蜏卦斐傻膫Τ^一定程度時，環(huán)境脅迫就會對植株造成不可逆的傷害，甚至死亡［5-6］。植物為了抵御低溫脅迫，其根莖葉在形態(tài)上存在著相應(yīng)的響應(yīng)機制，如葉形、葉片厚度、葉色和解剖結(jié)構(gòu)等方面的變化［7-8］。其次，植物體內(nèi)多種滲透調(diào)節(jié)物以及保護酶等在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生理功能、抵抗惡劣氣候條件等方面具有重要作用［9］，并通過一系列生理生化代謝反應(yīng)提高對環(huán)境的適應(yīng)能力。

柳杉的抗寒性研究可為其品種選育提供理論依據(jù)，對于提高林木生產(chǎn)力與地區(qū)經(jīng)濟效益、促進我國生態(tài)環(huán)境的建設(shè)具有重要意義［10］。但是目前柳杉的研究主要集中在育苗、良種選育、病蟲害防治與生理生態(tài)等方面，關(guān)于柳杉不同無性系的抗寒性研究相對較少。本研究測定了10個無性系在低溫脅迫下的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm、Y（II）、qP）等生理生化指標(biāo)，采用主成分分析結(jié)合隸屬函數(shù)計算對柳杉各無性系抗寒性差異進行綜合評價，以期進一步探尋柳杉無性系抗寒能力評價體系，為柳杉抗寒無性系的評價篩選及造林栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

10個柳杉無性系主要來源于我國東部柳杉分布區(qū)（表1），穗條均采自南京林業(yè)大學(xué)白馬實驗基地柳杉優(yōu)良無性系收集區(qū)，2018年6月進行扦插，2020年用于本研究。

表1 材料及來源Table 1 Materials and sources

1.2 方法

1.2.1 低溫處理 取生長一致的10個柳杉無性系的2年生幼苗枝條，將每個無性系的枝條分為7組，分別放入海爾程控冰箱中進行4℃、0℃、-4℃、-8℃、-12℃、-16℃和-20℃低溫處理，從4℃開始，以4℃/2 h降溫，到達每個目標(biāo)溫度時處理12 h。零上溫度處理后直接進行生理指標(biāo)的測定，零下溫度處理結(jié)束后放入4℃中解凍12 h后進行測定，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.2 測定方法 取針葉0.5 g，通過0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）獲得粗酶提取液。采用硫代巴比妥酸法［11］和氮藍(lán)四唑比色法［11］分別測定MDA含量和SOD活性。柳杉枝條經(jīng)低溫處理后，使用便攜式光纖型雙通道調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xDUAL-PAM/F（德國Walz公司）測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)PS II最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PS II的實際光合量子產(chǎn)量（Y（II））和光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP），每個處理3次重復(fù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 （1）各項指標(biāo)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 22進行統(tǒng)計與分析，使用Duncan檢驗法進行差異顯著性分析。

（2）權(quán)重計算：本課題組Zhang等［12］在分析半致死溫度時發(fā)現(xiàn)-4℃是一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)折溫度，因此以-4℃下各指標(biāo)的值作主成分分析。綜合相對電導(dǎo)率（relative conductivity，REC）、MDA含量、SOD活性及Fv/Fm 4個指標(biāo)（REC數(shù)據(jù)見Zhang等［12］），使用SPSS 22軟件將數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過主成分分析確定其特征值、負(fù)荷量與貢獻值，計算權(quán)重（weight，W）。

（3）隸屬函數(shù)值計算：根據(jù)各無性系測定的指標(biāo)數(shù)據(jù)，計算其隸屬函數(shù)值并進行排序，對負(fù)向指標(biāo)采用反隸屬函數(shù)計算［13-14］。

隸屬函數(shù) ：f（xij）=（xij-xjmin）/（xjmax-xjmin）

反隸屬函數(shù) ：f（xij）=（xjmax-xij）/（xjmax-xjmin）

式中，f（xij）表示i無性系j指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值；xij表示i無性系j指標(biāo)的測定值；xjmax表示所有無性系j指標(biāo)的最大值；xjmin表示所有無性系j指標(biāo)的最小值。

（4）抗寒性評價：根據(jù)各指標(biāo)權(quán)重及隸屬函數(shù)值，通過公式Y(jié)=Wij×f（xij）計算各無性系抗寒性綜合指數(shù)Y（Wij為各抗寒指標(biāo)權(quán)重；f（xij）為各指標(biāo)隸屬函數(shù)值）［13-14］。再結(jié)合相對電導(dǎo)率（REC）、MDA含量、SOD活性以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）等指標(biāo)進行綜合分析，建立抗寒性評價體系。

2 結(jié)果

2.1 低溫脅迫對柳杉各無性系生理生化指標(biāo)的影響

2.1.1 低溫脅迫對柳杉各無性系中MDA含量的影響 由圖1和附表1可知，柳杉不同無性系的MDA含量總體呈上升-下降-上升的趨勢。但柳杉各無性系在不同溫度時，MDA含量的變化不太一致，在一定溫度范圍內(nèi)具有波動性。在0℃、-8℃、-16℃出現(xiàn)了峰值，在0℃和-16℃后呈明顯的下降趨勢，其中在-4℃、-8℃、-12℃時，MDA含量相較于0℃呈現(xiàn)下降趨勢，但各無性系變化無明顯規(guī)律，說明柳杉不同無性系對低溫的應(yīng)答反應(yīng)不同，且MDA含量受多種因素影響。在整個低溫處理過程中，66#無性系的MDA含量偏低，74#無性系的MDA含量偏高，說明66#無性系在低溫脅迫下膜功能受損害的程度較低，抗性較強。

圖1 不同低溫脅迫對柳杉各無性系MDA含量的影響Fig.1 Effects of different low temperature stress on MDA content in different clones of C. fortunei

2.1.2 低溫脅迫對柳杉各無性系超氧化物歧化酶（SOD）含量的影響 由圖2和附表2可知，在低溫脅迫下，多數(shù)柳杉無性系的SOD活性變化呈下降-上升-下降的趨勢。在4℃降到0℃時，由于植株對低溫的不適應(yīng)，SOD活性呈現(xiàn)下降趨勢，隨后植株經(jīng)過短暫的抗寒鍛煉，抗寒能力逐漸增強，SOD活性出現(xiàn)短暫的上升，-8℃后，SOD活性逐漸下降，說明過低的溫度超過了SOD酶作用的范圍，植株自身抗氧化系統(tǒng)受到破壞，抗寒能力減弱。特別的是25#和74#無性系，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在整個低溫處理過程中，68#無性系的SOD活性值偏高，而且波動較小，抗性較強。42#無性系的SOD活性值下降較快且降幅較大，說明在低溫處理過程中，42#無性系的超氧化物歧化酶受溫度的影響比較大，抗性較弱。

圖2 不同低溫脅迫對柳杉各無性系SOD含量的影響Fig.2 Effects of different low temperature stress on SOD content in different clones of C. fortunei

2.1.3 低溫脅迫對柳杉各無性系葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.1.3.1 低溫脅迫對柳杉各無性系Fv/Fm的影響 由圖3和附表3可知，隨著處理溫度的降低，柳杉各無性系的Fv/Fm值呈上升-下降的變化趨勢。在0℃時，F(xiàn)v/Fm開始下降，-4℃時急劇降低，到-20℃逐漸平緩，說明柳杉在經(jīng)歷低溫初期時有抵御能力，能夠在一段時間內(nèi)維持光合效率，超過抵御的臨界點，其光合效率大幅度降低。其中，42#無性系的Fv/Fm變化幅度較大，且顯著低于其他無性系，說明其PS II反應(yīng)中心光能轉(zhuǎn)化效率較低，對低溫脅迫較為敏感，抗寒性較差。68#無性系的Fv/Fm值在4℃至-4℃時相對較高，而57#無性系在低溫初期變化平緩且隨溫度的降低整體水平降幅較小，說明它們在低溫脅迫下PS II損傷較小，光能轉(zhuǎn)化效率較高。

圖3 不同低溫脅迫對柳杉各無性系Fv/Fm的影響Fig.3 Effects of different low temperature stress on Fv/Fm in different clones of C. fortunei

2.1.3.2 低溫脅迫對柳杉各無性系Y（II）的影響 由圖4和附表4可知，在低溫處理下柳杉各無性系Y（II）與Fv/Fm的變化趨勢相似，隨著溫度的降低整體呈上升-下降的變化趨勢。Y（II）在低溫初期出現(xiàn)小幅上升，在0℃后呈下降趨勢，隨著溫度的降低，在-4℃以后急劇下降，-8℃后變化逐漸平緩，-20℃時各無性系Y（II）值趨近于0。其中，68#無性系在0℃達到峰值，在-4℃之后急劇下降，且變化幅度較大，說明68#在低溫初期抗性較強，卻對溫度較為敏感。57#無性系的Y（II）值隨溫度降低也明顯下降，但整體上比其他無性系下降幅度小。由圖可以看出，42#無性系在-8℃和-16℃時Y（II）值趨近于0，各無性系在-20℃時的Y（II）值也幾乎為0。Y（II）是PS II實際光合量子產(chǎn)量，一段時間內(nèi)持續(xù)地對光能的有效轉(zhuǎn)換能力［15］。Y（II）為0，說明柳杉PS II反應(yīng)中心的實際光能轉(zhuǎn)換能力在低溫脅迫下受到抑制，柳杉的光合結(jié)構(gòu)受到破壞。

圖4 不同低溫脅迫對柳杉各無性系Y（II）的影響Fig.4 Effects of different low temperature stress on Y（II）in different clones of C. fortunei

2.1.3.3 低溫脅迫對柳杉各無性系qP的影響 由圖5和附表5可知，柳杉各無性系qP值在4℃-0℃無顯著變化，從0℃開始緩慢下降，-4℃時qP值急劇降低，在-8℃后變化平緩，直至-20℃ qP值趨近于0，這與Y（II）值的變化相似。由圖5可以看出，qP值隨溫度的降低呈現(xiàn)下降趨勢。其中，74#無性系的qP值在低溫初期變化不明顯且處于較高水平，57#和32#無性系隨溫度的變化qP值降幅較小，在低溫后期，qP值高于其他無性系，說明74#、57#和32#無性系光合電子傳遞能力較強，PS II受害程度較輕，抗性較好。42#無性系qP值變化與Y（II）值變化相似，顯著低于其他無性系且趨近于0，說明對光能的利用能力較弱，抗性較差。

圖5 不同低溫脅迫對柳杉各無性系qP的影響Fig.5 Effects of different low temperature stress on qP in different clones of C. fortunei

2.2 主成分分析

結(jié)果如表2所示，遵循特征值大于1的原則，從4項生理指標(biāo)中共提取出2個主成分，特征值分別為2.217和1.056，貢獻率分別為55.419%和26.389%，累計貢獻率達81.809%，因此，結(jié)果理想，提取的2個主成分概括了4個生理指標(biāo)的絕大部分信息。運用2個主成分對4個生理指標(biāo)進行負(fù)荷量分析和權(quán)重的計算，由表3可以看出，各指標(biāo)對柳杉抗寒性影響由強到弱分別是相對電導(dǎo)率（REC）、MDA、Fv/Fm、SOD。

表2 主成分分析結(jié)果Table 2 Results by principal component analysis

表3 柳杉各無性系抗寒性的負(fù)荷量及權(quán)重Table 3 Load capacities and weights of cold resistance indicators of C. fortunei clones

2.3 抗寒指標(biāo)隸屬函數(shù)值

以相對電導(dǎo)率（REC）、MDA含量、SOD活性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）為評級指標(biāo)，計算隸屬函數(shù)值并進行排序。結(jié)果（表4）表明，無性系57#、68#和32#的隸屬函數(shù)值較大，表明其抗寒評分較高，抗寒性較強，3#、25#和42#無性系隸屬函數(shù)值較小，表明其抗寒評分較低，抗寒性相對較弱。

表4 柳杉各無性系抗寒性指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table 4 Membership function values of cold resistance index of C. fortunei clones

2.4 柳杉各無性系抗寒性綜合評價

以相對電導(dǎo)率（REC）、MDA含量、SOD活性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）為評級指標(biāo)，依據(jù)權(quán)重與隸屬函數(shù)值，計算柳杉各無性系抗寒性綜合指數(shù)Y，進而評價柳杉各無性系的抗寒性（表5）。結(jié)果表明，57#、68#和32#為抗寒性較強的無性系，3#、25#和42#無性系抗寒性較弱。各無性系的綜合指數(shù)有一定的差異，其綜合指數(shù)為0.46-0.72，抗寒性最好的無性系為57#，其次為68#、32#、66#和74#，抗寒性最弱的無性系為42#，其余幾個無性系的綜合指數(shù)相對來說差距不大，為0.52-0.56。

表5 柳杉各無性系抗寒性綜合評價Table 5 Comprehensive evaluation of cold resistance in C. fortunei clones

3 討論

細(xì)胞膜是細(xì)胞感受環(huán)境脅迫最敏感的部位，當(dāng)植物受到低溫脅迫時，細(xì)胞膜首先受到傷害，透性增大，使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)大量外滲。外滲液電導(dǎo)值的變化，可反映材料的細(xì)胞膜傷害程度，進而判斷植物抗寒性的大?。?6-18］。Zhang等［12］在研究柳杉不同無性系低溫脅迫時相對電導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)，電導(dǎo)率整體呈“S”型曲線，呈現(xiàn)先上升后基本不變的趨勢。10個柳杉無性系的半致死溫度在-4.7℃--8℃。其中57#和32#在整個過程中相對電導(dǎo)率相對于其他無性系較低，抗寒能力較強，42#相對電導(dǎo)率增幅最大，說明受低溫的影響較大，抗寒能力較弱。

此外，植物在逆境條件下往往發(fā)生膜脂過氧化作用，其產(chǎn)物MDA會嚴(yán)重?fù)p傷生物膜，通常利用它作為膜脂過氧化指標(biāo)，表示細(xì)胞膜脂過氧化程度及對逆境反映的強弱［19］。本研究表明在低溫脅迫下，MDA含量隨著溫度的降低在一定溫度范圍內(nèi)存在波動性，但總體來說呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，表明在低溫脅迫下，柳杉細(xì)胞膜功能受到抑制，隨著溫度的降低MDA在細(xì)胞內(nèi)積累，膜功能受阻或喪失，造成細(xì)胞代謝紊亂，從而對細(xì)胞產(chǎn)生傷害。柳杉各無性系MDA的含量沒有明顯的變化規(guī)律，其原因可能有兩個方面原因，一是MDA含量與某些植物的抗寒性并無太大關(guān)系，如王微［20］對紫花苜蓿幾個抗寒生理指標(biāo)的研究中也出現(xiàn)MDA含量無變化規(guī)律的現(xiàn)象，她認(rèn)為抗寒反應(yīng)的生理機制比較復(fù)雜，單從某一個生理指標(biāo)來鑒定抗寒性是比較困難的；二是試驗中采用離體枝條針葉進行測定，可能與整株植株生理指標(biāo)變化有差異；三是整個低溫處理過程在黑暗的冰箱中進行，沒有考慮光照對生理指標(biāo)的影響。

過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2-）是逆境情況下產(chǎn)生的活性氧（ROS）物質(zhì)，低溫脅迫下植物會增加細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的含量［21］。超氧化物歧化酶（SOD）是生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，在植物體內(nèi)主要是用于清除超氧陰離子自由基等活性氧物質(zhì)，維持植物體內(nèi)活性氧代謝平衡，從而對機體起到保護作用［22-23］。因此，SOD酶活性的強弱能直接反映出植物在低溫脅迫下的自我調(diào)節(jié)能力，常被作為評價植物抗寒性的重要指標(biāo)［7，24］。低溫脅迫下柳杉各無性系SOD酶活性整體上表現(xiàn)出先短暫的下降后逐漸上升而后又下降的趨勢。低溫初期SOD活性的降低與陳政等［19］對日本無刺花椒的研究結(jié)果一致。章錦濤等［25］在研究山茶的抗寒能力時發(fā)現(xiàn)隨著脅迫溫度的降低，植株體內(nèi)SOD活性先升高后降低。在低溫脅迫下為了維持植物體內(nèi)活性氧和自由基的動態(tài)平衡，植物體內(nèi)的保護酶體系會發(fā)揮作用清除這些有害物質(zhì)，使SOD等保護酶的活性增強，但超過保護酶清除作用范圍時其酶活性會下降［26-27］。郭祥泉［28］認(rèn)為隨著低溫脅迫時溫度的降低，SOD酶活性有一個溫度拐點，在拐點前其活性急劇上升，在拐點后又下降，以此來定量研究不同樹種及不同個體的低溫臨界值。

光合作用是植物對逆境較為敏感的過程，低溫脅迫會抑制PS II的活性，使其光能捕捉能力與光化學(xué)轉(zhuǎn)化效率降低，反應(yīng)中心的開放程度降低，從而引起葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化［29-30］。植物可變熒光Fv與最大熒光Fm的比值Fv/Fm能夠良好地反映光合色素把捕獲的光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的速度和效率［31-32］。Fv/Fm下降越多表明PS II受損傷越大，F(xiàn)v/Fm的變化可反映低溫下PS II受傷害的程度［33］。柳杉各無性系Fv/Fm值在4℃-0℃出現(xiàn)短暫的上升，0℃后隨著低溫脅迫的加劇而逐漸降低。Fv/Fm的降低說明PS II反應(yīng)中心受到傷害，抑制了光合作用的原初反應(yīng)，不利于光能的轉(zhuǎn)換。Y（II）值代表光系統(tǒng) II的實際量子產(chǎn)量，它反映了植物的實際光合效率［29］。qP是衡量開放的光系統(tǒng) II反應(yīng)中心光抑制的程度，一定程度上表示PS II電子傳遞活性［34］。高qP值可以加速推動光合電子傳遞能力，促進光合效率增長［35］。Y（II）的變化趨勢與Fv/Fm的變化大致相同，隨著溫度的降低柳杉各無性系Y（II）值呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，而qP在低溫初期變化不明顯，0℃后與Y（II）值變化相同，隨著溫度的變化逐漸降低，甚至趨近于0，說明PS II反應(yīng)中心的開放受到影響，實際光合效率和光合活性均受到低溫的抑制。Fv/Fm、Y（II）和qP值在4℃-0℃的回升及不變說明柳杉在經(jīng)歷低溫初期有抵御能力，能夠在一定時間內(nèi)維持光合效率，當(dāng)超過臨界值其光合效率會大幅降低，嚴(yán)重時導(dǎo)致反應(yīng)中心受到損傷甚至失活。

植物是一個統(tǒng)一的有機整體，逆境脅迫下引起植物生理生化指標(biāo)變化的因素錯綜復(fù)雜，因此，單一指標(biāo)很難準(zhǔn)確評價植物的抗逆性［36-37］。主成分分析能有效地簡化數(shù)據(jù)，分析各指標(biāo)間的關(guān)系，起到了濃縮數(shù)據(jù)的作用［14，38］。利用主成分分析及隸屬函數(shù)法，可以綜合評價柳杉各無性系的抗寒能力，在一定程度上可以真實的反映其抗寒能力強弱［39-40］。陳新華［41］運用綜合評價的方法，對不同品種甜櫻桃的抗寒性進行了評價，蘇李維等［14］用主成分分析法結(jié)合隸屬函數(shù)值建立了葡萄抗寒性綜合評價方法。本研究以相對電導(dǎo)率（REC）、MDA含量、SOD活性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)（Fv/Fm）為評級指標(biāo)，依據(jù)權(quán)重與隸屬函數(shù)計算柳杉各無性系抗寒性綜合指數(shù)，最終結(jié)果表明57#、68#和32#為抗寒性較強的無性系，3#、25#和42#無性系抗寒性較弱。

4 結(jié)論

低溫脅迫下，測定10個柳杉無性系針葉的丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)，其變化均具有顯著差異。結(jié)合主成分分析與隸屬函數(shù)法對10個柳杉無性系的抗寒性進行綜合評價，其中57#、68#和32#無性系對低溫脅迫具有較強的適應(yīng)性，抗寒能力強，而3#、25#和42#無性系抗寒性較弱。

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