蘭欣悅 劉寧寧 朱龍佼 陳旭 褚華碩 李相陽(yáng) 段諾 許文濤

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 轉(zhuǎn)基因生物安全性評(píng)價(jià)（食品安全）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系 食品精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，邯鄲 056000；4. 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；5. 江南大學(xué)食品學(xué)院，無(wú)錫 214122）

四環(huán)素（tetracycline，TC）由鏈霉菌生產(chǎn)，以抑制細(xì)菌內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成的方式，發(fā)揮抗菌作用［1-2］。因其具有廣譜的抗菌效果和低成本的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，常在畜禽、水產(chǎn)、蜜蜂等養(yǎng)殖過(guò)程中作為獸藥被使用［3-4］。然而，不當(dāng)或過(guò)度使用四環(huán)素會(huì)令肉、奶等食品出現(xiàn)抗生素殘留，一旦被消費(fèi)者攝入體內(nèi)往往會(huì)令人體的肝腎功能受損，出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)等癥狀［5-6］。為有效限制四環(huán)素濫用，減少威脅人類(lèi)健康及環(huán)境的問(wèn)題發(fā)生，中國(guó)、美國(guó)、歐盟等都對(duì)食源性食品中四環(huán)素最大殘留量進(jìn)行了嚴(yán)格的限定［7-8］。因此，針對(duì)四環(huán)素開(kāi)發(fā)特異性傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)其靈敏檢測(cè)非常必要。

近幾十年，針對(duì)四環(huán)素傳感器的開(kāi)發(fā)多圍繞色譜 - 質(zhì)譜［2，8-11］、酶聯(lián)免疫吸附［12］、毛細(xì)管電泳［4］、比色法［1，13-16］等技術(shù)手段展開(kāi)，令檢測(cè)難以擺脫大型儀器設(shè)備，同時(shí)，抗體、酶等大分子的加入，往往會(huì)提升分析成本，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間；近幾年，依靠納米材料的加入，以電化學(xué)檢測(cè)的方式一定程度擺脫了上述缺陷，且進(jìn)一步提高了檢測(cè)靈敏度［16-17］，但是反應(yīng)體系依然復(fù)雜，因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏、低成本的四環(huán)素傳感器是有意義和創(chuàng)新性的。

硫黃素T（ThT）作為常見(jiàn)熒光染料［18］，在2013年被報(bào)道可與G-四鏈體中G-四平面的溝槽發(fā)生鍵合作用，限制自身苯并噻唑環(huán)和二甲基芐基環(huán)在自然條件下的任意扭轉(zhuǎn)，令兩環(huán)處于同一平面，引發(fā)光開(kāi)關(guān)啟動(dòng)［19-20］，實(shí)現(xiàn)對(duì)自身熒光近1 700倍的強(qiáng)激發(fā)［21］，令G-四鏈體結(jié)構(gòu)成為如今ThT信號(hào)輸出的主流核酸結(jié)構(gòu)模型。

功能核酸適配體是通過(guò)SELEX（指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)）篩選出來(lái)的由十幾個(gè)寡核苷酸組成的DNA/RNA單鏈序列［22］，可通過(guò)自身折疊成特定結(jié)構(gòu)與小分子、離子、蛋白質(zhì)、微生物等多種靶物質(zhì)發(fā)生識(shí)別結(jié)合，具有相比抗體而言更低的免疫源性和細(xì)胞毒性，同時(shí)可在體外大量合成，降低實(shí)驗(yàn)成本，為信號(hào)識(shí)別和檢測(cè)創(chuàng)造新的機(jī)遇和突破［22-24］。2014 年，Kwon 等［25］將 76 nt的單鏈適配體剪裁為8 nt短序列，并驗(yàn)證裁剪后序列具有對(duì)四環(huán)素的高結(jié)合親和力（Kd 1.067 nmol/L），實(shí)現(xiàn)了對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物的比色法檢測(cè)；2015年，Mohammad等［26］將截短的8 nt序列設(shè)計(jì)進(jìn)三螺旋分子開(kāi)關(guān)傳感體系，將四環(huán)素檢測(cè)限降低至266 pmol/L。

因此，本文旨在以前人截短的8 nt短序列為基礎(chǔ)，進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，開(kāi)發(fā)具G-四鏈體形成潛力的雙價(jià)四環(huán)素適配體，在提高檢測(cè)性能的基礎(chǔ)上［27］，實(shí)現(xiàn)在靶標(biāo)加入前后的構(gòu)象變化，最終基于ThT熒光信號(hào)響應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)四環(huán)素的無(wú)標(biāo)記傳感。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 ThT、四環(huán)素、KCl、NaCl、MgCl2、Tris粉末及甲醇溶液均購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司；氨芐青霉素、林可霉素、氯霉素、慶大霉素及土霉素溶液為實(shí)驗(yàn)室留存；實(shí)驗(yàn)所用水為超純水。

1.1.2 主要設(shè)備 熒光分光光度計(jì)（G9800A），美國(guó)安捷倫科技有限公司；電子分析天平、pH計(jì)，北京六一生物科技有限公司；SCILOGEX PCR儀，美國(guó)賽洛捷克公司；sigmaD-37520高速離心機(jī)，默克公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)所用序列 實(shí)驗(yàn)所用序列均由北京生工生物工程有限公司合成，對(duì)應(yīng)詳細(xì)名稱(chēng)、堿基序列組成、堿基數(shù)見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用序列Table 1 Sequences used in experiment

1.2 方法

1.2.1 熒光強(qiáng)度測(cè)定 用超純水（UP）溶解DNA序列至100 μmol/L，經(jīng)PCR儀進(jìn)行95℃，5 min熱解鏈，自然冷卻至室溫備用。將熱解鏈處理后的適配體序列加入pH=7.4的20 mmol/L Tris-K+緩沖液中，至終濃度為1 μmol/L，并向?qū)?yīng)體系中加入不同濃度的四環(huán)素溶液，渦旋混勻，室溫條件孵育20 min，檢測(cè)前向體系中加入終濃度為1 μmol/L的ThT，混勻，至于熒光分光光度計(jì)中，選擇熒光測(cè)量模式，設(shè)置發(fā)射、激發(fā)狹縫寬度為10 nm，熒光分子激發(fā)波長(zhǎng)為443 nm，在490 nm處采集最大發(fā)射光強(qiáng)度。

1.2.2 ThT熒光隨時(shí)間變化曲線(xiàn)測(cè)定 將熒光分光光度計(jì)測(cè)量程序選擇為動(dòng)力學(xué)檢測(cè)模式，設(shè)置發(fā)射、激發(fā)狹縫寬度為10 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為443 nm，在490 nm處采集最大發(fā)射光強(qiáng)度，采集時(shí)間35 min，采集間隔0.02 s。

1.2.3 加標(biāo)原液的制備及實(shí)際樣品檢測(cè) 將2 mL純牛奶制品用超純水稀釋至5 mL，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)3次以分離牛乳中凝結(jié)的沉淀物，取上清液溶解四環(huán)素粉末，配置加標(biāo)原液。將不同濃度的加標(biāo)原液加入到終濃度含有1 μmol/L 四環(huán)素雙價(jià)適配體序列，pH=7.4的20 mmol/L Tris-K+緩沖液中，渦旋混勻，室溫條件孵育20 min，檢測(cè)前向體系中加入終濃度為1 μmol/L的ThT，混勻，將總體積100 μL的檢測(cè)樣品至于熒光分光光度計(jì)中，選擇熒光測(cè)量模式，選擇490 nm處不同四環(huán)素濃度牛奶樣本中對(duì)應(yīng)ThT的熒光值，上述操作進(jìn)行3次平行重復(fù)后，分析代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算回收濃度，獲得回收濃度與實(shí)際加標(biāo)濃度之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

經(jīng)Kwon等［25］裁剪得到的8 nt四環(huán)素適配體為富G序列，序列組成具有構(gòu)成劈裂G-四鏈體的潛力，由于G-四鏈體結(jié)構(gòu)可以強(qiáng)激發(fā)ThT熒光，故本研究通過(guò)對(duì)序列理性設(shè)計(jì)，在不改變其自身堿基的情況下，將8 nt單序列引入重復(fù)單元，形成以16 nt雙價(jià)四環(huán)素適配體為基礎(chǔ)的新序列，賦予其更好的G-四鏈體形成能力。進(jìn)一步，在此條件下，通過(guò)在雙價(jià)適配體基序間隔間引入適當(dāng)長(zhǎng)度的堿基單元，令序列能更易折疊形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，從而在無(wú)靶標(biāo)情況下，強(qiáng)激發(fā)ThT熒光，在引入靶標(biāo)后，通過(guò)四環(huán)素與序列的高親和性，破壞G-四鏈體形成條件，ThT熒光不能被有效激發(fā)，實(shí)現(xiàn)加入靶標(biāo)前后的熒光強(qiáng)度變化，以此為檢測(cè)信號(hào)輸出（圖1）。

圖1 四環(huán)素雙價(jià)適配體非酶免標(biāo)記傳感器原理圖Fig. 1 Schematic diagram of tetracycline bivalent aptamer non-enzyme label-free sensor

2.2 雙價(jià)適配體間隔插入序列設(shè)計(jì)及激發(fā)ThT能力評(píng)估

首先，經(jīng)熒光分光光度計(jì)測(cè)定了8 nt四環(huán)素適配體序列、雙價(jià)適配體序列及雙價(jià)適配體間隔插入不同堿基類(lèi)型的序列之間的熒光強(qiáng)度。通過(guò)圖2-A可以發(fā)現(xiàn)，插入2G堿基的序列，相比四環(huán)素適配體序列和雙價(jià)適配體序列，顯著激發(fā)了ThT熒光；因此，在確定G為最適間隔插入堿基的基礎(chǔ)上，研究又對(duì)最適序列間隔插入堿基的數(shù)目進(jìn)行了探究，熒光檢測(cè)結(jié)果如圖2-B所示，雙價(jià)-3G插入適配體序列相比于其他序列，熒光強(qiáng)度接近400，是四環(huán)素適配體序列激發(fā)ThT的近40倍，雙價(jià)適配體序列激發(fā)ThT的近14倍，故認(rèn)為該序列具有最好的ThT熒光激發(fā)能力。

圖2 雙價(jià)適配體間隔插入序列激發(fā)ThT能力評(píng)估Fig. 2 Ability of bivalent aptamer spacer insert sequences to trigger ThT fluorescence

2.3 可行性驗(yàn)證

檢測(cè)了序列在加入100 nmol/L四環(huán)素前后的熒光強(qiáng)度變化，熒光光譜如圖3所示，當(dāng)體系中只有四環(huán)素或ThT時(shí)，體系幾乎無(wú)熒光信號(hào)，而在雙價(jià)-3G插入適配體的加入下，熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)到近400；當(dāng)向含有雙價(jià)-3G插入適配體的體系中加入四環(huán)素后，熒光信號(hào)又明顯降低至275左右，因此，加入靶標(biāo)前后的ThT熒光信號(hào)差異表明該方法具有檢測(cè)四環(huán)素的可行性。

圖3 可行性驗(yàn)證Fig. 3 Feasibility verification

2.4 檢測(cè)條件優(yōu)化

2.4.1 測(cè)量時(shí)間優(yōu)化 在與雙價(jià)-3G插入適配體序列混合后，通過(guò)動(dòng)力學(xué)掃描程序監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度實(shí)時(shí)變化，如圖4所示，ThT的熒光強(qiáng)度在加入體系后即時(shí)達(dá)到最高，并在5 min內(nèi)迅速下降至起始熒光值的70%左右，此后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，熒光相比于前5 min，呈現(xiàn)平穩(wěn)下降趨勢(shì)；至35 min，熒光值降低至起始熒光值60%左右。因此，根據(jù)ThT在反應(yīng)后激發(fā)熒光隨時(shí)間延長(zhǎng)整體呈現(xiàn)近指數(shù)下降趨勢(shì)，為盡可能保證ThT的最佳測(cè)量時(shí)間，本文后續(xù)的熒光測(cè)定為即時(shí)測(cè)量。

圖4 熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間變化曲線(xiàn)Fig. 4 Fluorescence intensity changing curve with reaction time

2.4.2 適配體序列與ThT反應(yīng)體系濃度比優(yōu)化 固定反應(yīng)體系中雙價(jià)-3G插入適配體濃度為1 μmol/L，改變ThT濃度，設(shè)置適配體與ThT濃度呈不同梯度比的實(shí)驗(yàn)組，采集各組樣本的熒光信號(hào)，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)ThT濃度從0.1 μmol/L增加到1 μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，而ThT濃度的進(jìn)一步增加，熒光值出現(xiàn)隨ThT濃度增加而降低的趨勢(shì)，說(shuō)明當(dāng)體系中適配體與ThT濃度比為1∶1時(shí)，ThT對(duì)序列的熒光響應(yīng)達(dá)到飽和，即為檢測(cè)熒光信號(hào)的最佳比值。因此，本文后續(xù)檢測(cè)體系控制C適配體∶CThT=1∶1。

圖5 不同Captamer∶CThT 的熒光強(qiáng)度Fig. 5 Different fluorescence intensity of Captamer∶CThT

2.4.3 四環(huán)素孵育時(shí)間優(yōu)化 通過(guò)測(cè)量100 nmol/L四環(huán)素與序列孵育不同時(shí)間的熒光強(qiáng)度，通過(guò)圖6結(jié)果可以看出，隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)，熒光值逐漸降低，并于20 min后趨于穩(wěn)定，熒光信號(hào)不再有顯著的降低趨勢(shì)，說(shuō)明在孵育20 min左右，四環(huán)素與適配體可完成充分的識(shí)別結(jié)合，因此選取20 min為后續(xù)實(shí)驗(yàn)孵育時(shí)間。

圖6 TC與序列孵育不同時(shí)長(zhǎng)的熒光變化Fig. 6 Fluorescence intensity changes of TC and sequence incubation for different lengths

2.4.4 反應(yīng)體系及離子濃度優(yōu)化 將適配體序列至于不同緩沖液體系進(jìn)行反應(yīng)，熒光測(cè)定結(jié)果如圖7-A所示，發(fā)現(xiàn)在Tris-K+緩沖液條件下，ThT熒光最強(qiáng)。隨后，對(duì)該緩沖液體系下K+濃度進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)圖7-B可以看出，在加入四環(huán)素前后，ThT熒光信號(hào)變化在20 mmol/L的Tris-K+溶液中最大，即該反應(yīng)體系及離子濃度為最適合的雙價(jià)-3G插入適配體序列傳感緩沖體系。

圖7 反應(yīng)體系及離子濃度優(yōu)化Fig. 7 Optimization of reaction system and ion concentration

2.5 四環(huán)素定量檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

在最佳反應(yīng)體系及實(shí)驗(yàn)條件下，通過(guò)熒光光譜呈現(xiàn)的ThT熒光強(qiáng)度變化確定傳感器檢測(cè)性能，圖8-A所描述的即為10 nmol/L-1 μmol/L 的四環(huán)素濃度下熒光光譜響應(yīng)結(jié)果，可以看到，ThT熒光強(qiáng)度隨四環(huán)素濃度增加而降低。選取490 nm處不加靶標(biāo)條件下ThT熒光值與各四環(huán)素濃度下對(duì)應(yīng)ThT值做差值，發(fā)現(xiàn)差值與四環(huán)素濃度的對(duì)數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系（圖8-B），線(xiàn)性方程為y=67.492 05logx+19.811 79，R2=0.995 9。 根 據(jù) 公式3σ/k（σ：空白溶液相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，n=6；k：線(xiàn)性方程斜率），計(jì)算傳感器最低檢測(cè)限（LOD）為96 pmol/L。

圖8 TC傳感器的建立Fig. 8 Establishment of TC sensor

2.6 特異性檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)選擇了牛奶中易出現(xiàn)殘留［28］的5種抗生素：氨芐青霉素、林可霉素、氯霉素、慶大霉素、土霉素，評(píng)估傳感器特異性，將490 nm處不加靶標(biāo)條件下的ThT熒光值與各干擾體系ThT熒光值做差值，結(jié)果如圖9所示，可以看出，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，非靶標(biāo)抗生素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度變化遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于靶標(biāo)加入前后的數(shù)值變化程度，表明本傳感器對(duì)四環(huán)素具有較高的選擇性，即特異性良好。

圖9 特異性檢測(cè)Fig. 9 Specific detection

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

為評(píng)估傳感器對(duì)真實(shí)樣品的適用性和可靠性，將傳感器應(yīng)用于牛奶樣品中進(jìn)行四環(huán)素檢測(cè)，進(jìn)行3次平行重復(fù)，選擇490 nm處不同四環(huán)素濃度牛奶樣本中對(duì)應(yīng)ThT的熒光值，分析代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算回收濃度，獲得回收濃度與實(shí)際加標(biāo)濃度之間的關(guān)系，見(jiàn)表2。可以看出，該方法的回收率在103.1%到107.1%之間，即傳感器的重現(xiàn)性及準(zhǔn)確度較好。此外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可以在20 min內(nèi)完成，說(shuō)明本傳感器具備了在實(shí)際牛奶樣品中快速檢測(cè)四環(huán)素的能力。

3 討論

首先，本研究通過(guò)對(duì)8 nt四環(huán)素適配體序列的巧妙設(shè)計(jì)，獲得了雙價(jià)適配體間隔插入序列，分析熒光結(jié)果可知，雙價(jià)適配體模式的引入對(duì)ThT激發(fā)有促進(jìn)效果，同時(shí)也印證了作者預(yù)期對(duì)8 nt四環(huán)素適配體序列有形成劈裂G-四鏈體潛力的猜測(cè)，即雙價(jià)適配體對(duì)ThT的激發(fā)源自于自身具備了一定折疊形成G-四鏈體的能力傾向。此外，2T序列的插入相比于雙價(jià)適配體序列，也一定程度增強(qiáng)了ThT熒光，針對(duì)這一現(xiàn)象，分析可能是由于T堿基賦予了序列一定的柔性［29］，更容易令兩段雙價(jià)適配體序列通過(guò)折疊形成G-四平面；而針對(duì)雙價(jià)-3G插入適配體序列對(duì)ThT的強(qiáng)熒光激發(fā)效果，認(rèn)為這是序列在K+緩沖液體系中，折疊形成穩(wěn)定G-四鏈體的直觀結(jié)果，即研究選擇在雙價(jià)適配體間隔間適當(dāng)插入堿基，以更好幫助有劈裂G-四鏈體形成潛力的序列折疊形成穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)的思路是可行且有效的。

隨后，在雙價(jià)-3G插入適配體檢測(cè)四環(huán)素的可行性驗(yàn)證中，四環(huán)素加入前后ThT熒光響應(yīng)變化側(cè)面印證了因靶標(biāo)與適配體序列結(jié)合，破壞G-四鏈體結(jié)構(gòu)，使得ThT無(wú)法插入G-四鏈體平面，熒光激發(fā)被限制，從而降低檢測(cè)熒光信號(hào)。

確定序列后，由于傳感器的熒光響應(yīng)值及對(duì)靶標(biāo)檢測(cè)的靈敏度與實(shí)驗(yàn)體系及實(shí)驗(yàn)條件密切相關(guān)，為了令傳感器獲得最佳檢測(cè)性能，在文章中分別對(duì)最適測(cè)量時(shí)間、適配體序列與ThT反應(yīng)體系濃度比、四環(huán)素孵育時(shí)間、緩沖液離子體系及離子濃度進(jìn)行了優(yōu)化。

為了提高四環(huán)素傳感器的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)ThT加入后最適熒光信號(hào)檢測(cè)時(shí)間進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)ThT可與雙價(jià)-3G插入適配體序列快速結(jié)合，并即時(shí)產(chǎn)生最高的熒光激發(fā)，所獲得的ThT隨時(shí)間變化的熒光衰減曲線(xiàn)與Mohanty［21］和Sharmistha等［30］實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，即在不同溶液條件下，ThT熒光衰減均非常迅速，而當(dāng)K+和G-四鏈體序列加入體系后，賦予了ThT自身更好的結(jié)構(gòu)剛性，使熒光衰減變緩，但總體依然呈現(xiàn)較為迅速的衰減趨勢(shì)；此外，因ThT衰減程度與其結(jié)構(gòu)、劑量、所處微環(huán)境的極性及黏度等均相關(guān)［31-32］，而對(duì)應(yīng)本實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)，可忽略ThT與序列的插入反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)行即時(shí)測(cè)量。

在適配體序列與ThT反應(yīng)體系濃度比優(yōu)化結(jié)果中，針對(duì)C適配體∶CThT=1∶1后熒光強(qiáng)度下降這一現(xiàn)象，認(rèn)為這可能是由于當(dāng)ThT的濃度過(guò)高時(shí)，ThT分子傾向于形成二聚體或多聚體形式［33］，此時(shí)，因?yàn)榉肿咏Y(jié)構(gòu)及大小限制，將無(wú)法插入到G-四平面中，造成體系的熒光值不會(huì)增強(qiáng)反而降低。

由于四環(huán)素與適配體的結(jié)合程度受孵育時(shí)間影響，且在不同的結(jié)合程度會(huì)影響雙價(jià)-3G插入適配體序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定程度，進(jìn)而影響ThT熒光信號(hào)輸出，因此，探究四環(huán)素的最佳孵育時(shí)間是非常有必要的，而在本研究體系下，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，室溫孵育20 min即可令四環(huán)素與適配體完成充分的識(shí)別結(jié)合；在確定傳感器合適的緩沖液離子體系過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Tris-K+緩沖液可以令3G-插入適配體序列形成G-四鏈體的趨勢(shì)最強(qiáng)，分析這是由于Tris-HCl溶液可以為雙價(jià)適配體序列提供合適的緩沖環(huán)境，更易實(shí)現(xiàn)構(gòu)象自由變換，而K+又可以與G-四分體上的鳥(niǎo)嘌呤O6 原子保持配位，實(shí)現(xiàn)對(duì)G-四鏈體構(gòu)象的穩(wěn)定作用［21］，故以此為基礎(chǔ)，確認(rèn)在20 mmol/L的Tris-K+緩沖液中，序列可在加入靶標(biāo)前后實(shí)現(xiàn)最有效的構(gòu)象變化，從而令ThT輸出最顯著的信號(hào)差異，實(shí)現(xiàn)靈敏傳感。

最終，本研究獲得的四環(huán)素傳感器具備了一定的檢測(cè)特異性和實(shí)際樣本檢測(cè)能力，且相比于毛細(xì)管電泳法［4］、酶聯(lián)免疫分析法［12］、噻唑橙無(wú)標(biāo)記適配體傳感等方法［3］，具有相當(dāng)甚至更高的檢測(cè)靈敏度，在免去了對(duì)大型儀器依賴(lài)的同時(shí)，減少了檢測(cè)的復(fù)雜性和時(shí)間經(jīng)濟(jì)成本。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)前人剪裁后8 nt 四環(huán)素適配體的理性設(shè)計(jì)，成功獲得具有G-四鏈體形成潛力的雙價(jià)適配體序列，經(jīng)對(duì)檢測(cè)條件的系統(tǒng)優(yōu)化，將ThT熒光變化作為輸出信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了用于四環(huán)素的定量檢測(cè)的基于構(gòu)象轉(zhuǎn)變的非酶免標(biāo)記傳感器的開(kāi)發(fā)。該傳感器在10 nmol/L-1 μmol/L的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，R2達(dá)0.99以上，檢測(cè)限低至96 pmol/L；同時(shí)，該法特異性強(qiáng)，對(duì)氨芐青霉素、林可霉素、土霉素、慶大霉素等幾種常見(jiàn)抗生素均無(wú)顯著非特異性信號(hào)變化，且可在20 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶樣品中四環(huán)素的快速檢測(cè)，滿(mǎn)足《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中對(duì)四環(huán)素最大殘留量（100 μg/kg）的檢測(cè)需求，具有一定應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)潛力。