粟元 朱龍佼 曹繼娟 劉建龍 許文濤

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系 食品精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 大連民族大學(xué)，大連 116600；3. 河北伊萊莎生物技術(shù)有限公司，涿州 072750）

食品安全問(wèn)題是對(duì)公眾健康的重大威脅，微生物污染是導(dǎo)致食源性疾病最主要的因素，食源性疾病給全球醫(yī)療、經(jīng)濟(jì)和糧食帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)［1］。大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli），于1885年被德國(guó)科學(xué)家Theodor Escherich發(fā)現(xiàn)，又叫大腸埃希菌、大腸桿菌［2］。根據(jù)致病作用，大腸埃希菌主要分為8個(gè)種類，即能致胃腸道感染的腸道致病性的、腸道產(chǎn)毒素性的、腸道侵襲性的、腸道出血性的、腸集聚性的的大腸埃希菌以及近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腸產(chǎn)志賀樣毒素同時(shí)具有一定侵襲力的大腸埃希菌、致使尿道感染的尿道致病性的大腸埃希菌，以及最新命名的腸道集聚性的黏附大腸埃希菌［3］。大腸埃希菌的毒力因子可以分為4大類，黏附素、腸毒素、強(qiáng)毒力島、致病性腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)毒力島［2-3］。

大腸埃希菌O157∶H7（E. coli O157∶H7）屬于腸道出血性大腸埃希菌，其毒力基因主要分為3類，溶血素、志賀毒素（包括志賀毒素1、志賀毒素2）和對(duì)上皮細(xì)胞的粘附素，進(jìn)一步，溶血素由hlyA和eaeA基因編碼；志賀毒素1、2分別由stx1、stx2編碼，這4個(gè)基因也是常用于實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的基因。

針對(duì)大腸埃希菌的檢測(cè)方法主要分為三大類，傳統(tǒng)檢測(cè)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法，這些方法雖應(yīng)用廣泛［4］，但都存在一些限制。大腸埃希菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法（GB 4789.36-2016）的特點(diǎn)是需要耗時(shí)增菌培養(yǎng)、分離、生化鑒定，且需要專業(yè)人員操作，受到專業(yè)環(huán)境限制。免疫學(xué)方法［5-6］是依賴于抗原和抗體之間的特定組合，其種類多樣，可分為酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、免疫磁珠分離技術(shù)、酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)、免疫層析技術(shù)。免疫學(xué)方法雖檢測(cè)效率高、特異性強(qiáng)、實(shí)現(xiàn)了免提取、免培養(yǎng)的目標(biāo)，但成本較高，也需要特定環(huán)境進(jìn)行操作。分子生物學(xué)技術(shù)［7］的發(fā)展，給大腸埃希菌的檢測(cè)提供了更多可供選擇的方法，主要分為變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［8］、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［9］和生物傳感器［10-11］等。其中，1993 年發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技術(shù)應(yīng)用廣泛［12］，根據(jù)熒光信號(hào)基團(tuán)的不同，qPCR可以分為染料法和探針?lè)?。針?duì)TaqMan探針，其5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)［51］，當(dāng)熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相互靠近時(shí)，阻止了熒光基團(tuán)發(fā)出熒光；當(dāng)引物延伸至寡核苷酸結(jié)合位置時(shí)，Taq酶可以將其切割成小片段，使報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi)并發(fā)出熒光［12］。

真空冷凍干燥技術(shù)，簡(jiǎn)稱凍干技術(shù)，其原理是將溶液凝固后，在真空狀態(tài)下將凝固的溶劑升華，再由解吸干燥除去剩余水分的技術(shù)，一般分為3個(gè)階段，即預(yù)凍、升華、干燥［13］。其具有諸多優(yōu)點(diǎn)，一是低溫低氧不易損傷變性、二是凍干過(guò)程中保持原有結(jié)構(gòu)、三是重量輕且易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸、四是復(fù)水后基本保持原有性狀。凍干技術(shù)也具有不容忽視的劣勢(shì)，其會(huì)使檢測(cè)試劑組分形成冰晶，對(duì)其造成嚴(yán)重?fù)p傷，會(huì)加速樣品水分流失，從而降低生物活性［14-15］。因此，為了盡可能減小冷凍干燥過(guò)程對(duì)檢測(cè)試劑組分的損傷，延長(zhǎng)保藏期，選擇合適的保護(hù)劑至關(guān)重要。凍干保護(hù)劑是指樣品在凍干過(guò)程能夠?qū)悠愤M(jìn)行保護(hù)，使其免受損傷的物質(zhì)，其種類多樣，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為6類，即糖類、氨基酸類、鹽類、聚合物類、糖脂類和多元醇類，其功能也有所不同［16-18］，如表1所示。

表1 凍干保護(hù)劑的分類Table 1 Classification of the lyoprotectant［16］

目前，部分公司開(kāi)發(fā)了部分E. coli O157∶H7的qPCR檢測(cè)試劑盒，如廣東華銀醫(yī)藥科技有限公司、北京百奧萊博科技有限公司、上?？道噬锟萍加邢薰尽⒔K科晶生物科技有限公司等，但未進(jìn)行凍干，市場(chǎng)上存在小部分E. coli O157∶H7的熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒，國(guó)產(chǎn)的如廣州華峰生物科技有限公司（八連排凍干），進(jìn)口的如賽默飛世爾科技（96孔板凍干），兩家凍干試劑中均含有特異性引物和探針，總體而言，市場(chǎng)上缺少本研究6種食源性致病菌的熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒，對(duì)于第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和許多企業(yè)等，這成為迫切的需要。

本文結(jié)合qPCR技術(shù)和凍干技術(shù)，研制了一種既實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量，也便于儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)目焖贆z測(cè)試劑盒，用于簡(jiǎn)單、靈敏、特異鑒定E. coli O157∶H7。首先，該技術(shù)針對(duì)大腸埃希菌的eaeA基因設(shè)計(jì)引物，該設(shè)計(jì)包括一條正向引物、一條反向引物和一條熒光探針，熒光探針?lè)謩e修飾FAM熒光基團(tuán)和TAMRA淬滅基團(tuán)；其次，通過(guò)4種成分組成的復(fù)合凍干保護(hù)劑和qPCR體系混合凍干后組裝成熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒，克服了常用商品化擴(kuò)增試劑盒需冷藏運(yùn)輸和冷凍儲(chǔ)存的缺點(diǎn)，節(jié)約了冷鏈運(yùn)輸?shù)某杀?，且減少了加樣過(guò)程中的氣溶膠污染。所提出的方法可在45 min內(nèi)檢測(cè)到2.1 copies/μL的E. coli O157∶H7，其檢測(cè)效果優(yōu)，靈敏度高，且特異性強(qiáng)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究涉及的DNA序列在上海生工生物技術(shù)有限公司（生工生物，中國(guó)上海）合成；E. coli O157∶H7 BNCC192101、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食品）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；超純水是從Millipore MilliXQ系統(tǒng)（美國(guó)貝德福德）獲得的，用于溶解引物等；rTaq酶、PCR緩沖液（10×）、dNTPs（10 mmol/L）是從TaKaRa（中國(guó)北京）購(gòu)買的。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒是從天根（中國(guó)北京）生化科技有限公司購(gòu)買的；PerfectStartTMIIProbe qPCR SuperMix是從北京全式金生物技術(shù)有限公司購(gòu)買的；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯是從青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司購(gòu)買的。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)E. coli O157∶H7的培養(yǎng) 將50 μL E. coli O157∶H7、大腸埃希菌ATCC 25922、腸集聚性大腸埃希CICC 24186、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌CICC 10667、腸侵襲性大腸埃希菌CICC 10662加入LST液體培養(yǎng)基中，在（36±1）℃下以200 r/min的速度搖晃，時(shí)間為18 h-24 h。阪崎腸桿菌的培養(yǎng)：按照國(guó)標(biāo)（GB4789.40-2016）增菌步驟進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 基因組提取 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作。提取完基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性。具體方法：在 5 μL 樣品中加入 1 μL 6×Loading buffer，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行點(diǎn)樣，電泳儀的電壓為 120 V，電泳時(shí)間為30 min。

1.2.3 基因組驗(yàn)證及模板量測(cè)定 提取DNA后，利用兩條細(xì)菌16S rDNA引物對(duì)提取的E. coli O157∶H7的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16S rDNA 引物如表2所示，PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL：0.5 μmol/L F1和R1，1×PCR反應(yīng)緩沖液，0.8 mmol/L dNTPs，0.06 U rTaq DNA聚合酶和DNA。反應(yīng)體系在95℃下預(yù)變性5 min，然后在95℃下變性10 s，在55℃下退火30 s，在72℃下延伸10 s，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)。測(cè)定基因組濃度，并根據(jù)以下拷貝數(shù)計(jì)算公式計(jì)算拷貝數(shù)：（6.02×1023copies/mol）×（濃度g/mL）/（MW g/mol）。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) E. coli O157∶H7的特異性引物設(shè)計(jì)是根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的大腸埃希菌eaeA基因序列（GenBank 登錄號(hào) U38618.1），使用 Primer 5.0 軟件 和 Integrated DNA Technologies（IDT） 設(shè) 計(jì) PCR反應(yīng)的引物及探針（表2）。

表2 qPCR引物序列Table 2 Primers’ sequences of qPCR

1.2.5 qPCR體系的建立及優(yōu)化 初步建立的qPCR擴(kuò)增體系如下：20 μL反應(yīng)體系：PerfectStartTMII Probe qPCR SuperMix（2×），1× ；E. coli O157∶H7-F（10 μmol/L），0.3 μmol/L ；E. coli O157∶H7-R（10 μmol/L），0.3 μmol/L ；E. coli O157∶H7-P（10 μmol/L），0.3 μmol/L ；DNA 模 板，1 μL ；ROX（50×），1× ；ddH2O，6.8 μL。qPCR 系統(tǒng)運(yùn)行體系（ABI Step One Plus）：95℃，5 min；循環(huán)開(kāi)始，95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)，每40 s記錄一次熒光信號(hào)。陰性對(duì)照：阪崎腸桿菌DNA代替模板DNA，其它反應(yīng)條件不變?？瞻讓?duì)照：RNase-free水代替模板DNA，其它反應(yīng)條件不變；在初步建立的體系基礎(chǔ)上，優(yōu)化引物F、R 的濃度。濃度分別為：0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L 和 1.2 μmol/L ；接著，優(yōu)化引物與探針的比例，其比例分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。即E. coli O157∶H7的探針的濃度分別為 0.13 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4μmol/L、0.8 μmol/L、1.2 μmol/L。各實(shí)驗(yàn)組3個(gè)平行，qPCR系統(tǒng)運(yùn)行體系（ABI Step One Plus）：95℃，5 min；循環(huán)開(kāi)始，95℃，10 s；60℃，30 s；72℃，30 s共40個(gè)循環(huán)，每40 s記錄一次熒光信號(hào)，測(cè)定熒光曲線，并通過(guò)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳；最后，優(yōu)化退火溫度，分別為50、53、56、59、62、65℃。qPCR系統(tǒng)運(yùn)行體系（ABI Step One Plus）：95℃，5 min；循環(huán)開(kāi)始，95℃，10 s；50、53、56、59、62、65℃，30 s；72℃，30 s， 共40個(gè)循環(huán)，每40 s記錄一次熒光信號(hào)，測(cè)定熒光曲線，并通過(guò)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.2.6 qPCR體系的靈敏度及特異性分析 分別對(duì)E. coli O157∶H7基因組連續(xù)進(jìn)行10倍梯度稀釋，以稀釋后的基因組作為模板，稀釋至8個(gè)不同的濃度水平，即 2.1×108copies/μL、2.1×107copies/μL、2.1×106copies/μL、2.1×105copies/μL、2.1×104copies/μL、2.1×103copies/μL、2.1×102copies/μL、2.1×101copies/μL，在各自最優(yōu)的反應(yīng)條件下，分別進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。用RNase-free水代替模板，設(shè)立空白對(duì)照。針對(duì)E. coli O157∶H7，提取大腸埃希菌ATCC 25922、腸集聚性大腸埃希CICC 24186、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌CICC 10667、腸侵襲性大腸埃希菌CICC 10662的基因組，分別作為qPCR擴(kuò)增的模板，按照最優(yōu)體系進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證qPCR擴(kuò)增體系的特異性，每種靶標(biāo)3個(gè)平行，用RNase-free水代替模板，設(shè)立空白對(duì)照。

1.2.7 凍干保護(hù)劑對(duì)qPCR擴(kuò)增的影響 通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取4種常用的凍干保護(hù)劑，分別是海藻糖、PBS、BSA和甘露醇。基于qPCR最優(yōu)擴(kuò)增體系，研究海藻糖、PBS、BSA、甘露醇對(duì)qPCR擴(kuò)增的影響。其他反應(yīng)條件不變，海藻糖在20 μL qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）分別為1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、9.5%；PBS分別為0.1×、0.2×、0.3×、0.4×、0.5×；BSA分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；甘露醇分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，從而優(yōu)化出海藻糖、PBS、BSA和甘露醇不會(huì)對(duì)qPCR產(chǎn)生抑制作用的最優(yōu)濃度C1。

1.2.8 凍干保護(hù)劑保護(hù)作用濃度的確定 基于1.2.7的結(jié)果，研究海藻糖、PBS、BSA和甘露醇的凍干保護(hù)作用。其他反應(yīng)條件不變，海藻糖在20 μL qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度分別為4.5%、5.5%、6.5%、7.5%、8.5%；PBS分別為0.2×、0.3×、0.4×、0.5×、0.6×；BSA分別為0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%；甘露醇分別為0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%，從而優(yōu)化出海藻糖、PBS、BSA和甘露醇的最優(yōu)凍干保護(hù)作用質(zhì)量濃度C2。

1.2.9 熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的建立 通過(guò)試劑盒檢測(cè)E. coli O157∶H7，添加19 μL水將qPCR擴(kuò)增混合凍干樣品加復(fù)水，向各 PCR 管中加入1 μL靶標(biāo)DNA，同時(shí)設(shè)立未凍干擴(kuò)增試劑和未添加凍干保護(hù)劑的凍干擴(kuò)增試劑為對(duì)照，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，觀察qPCR擴(kuò)增曲線的平滑度、Ct值、熒光強(qiáng)度。

1.2.10 熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性 將熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒置于常溫儲(chǔ)存15 d、1個(gè)月、2個(gè)月，定期取試劑盒進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，考察不同時(shí)間儲(chǔ)存后的檢測(cè)性能，同時(shí)設(shè)立未凍干樣品為陰性對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后，觀察qPCR擴(kuò)增曲線的平滑度、Ct值、熒光強(qiáng)度。

1.2.11 熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的重復(fù)性 研究批內(nèi)變異系數(shù)的方法是在同一時(shí)間研制3個(gè)熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒置于常溫儲(chǔ)存，取試劑盒進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，每個(gè)試劑盒3個(gè)平行；研究批間變異系的方法是在不同時(shí)間分別研制3個(gè)熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒置于常溫儲(chǔ)存，取試劑盒進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，每個(gè)試劑盒3個(gè)平行，反應(yīng)結(jié)束后，觀察qPCR擴(kuò)增曲線的平滑度、Ct值、熒光強(qiáng)度。

1.2.12 實(shí)際樣品的檢測(cè) 選購(gòu)超市市售冷鮮牛肉1份、冷鮮豬肉1份、冷鮮雞肉1份樣品，無(wú)菌稱取25 g放入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌均質(zhì)杯做成1∶10、1∶1 00、1∶1 000樣品勻液。分別取上述3種稀釋度樣液1 mL接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，置（36±1）℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。接著，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行DNA提取，最后利用所研制的E. coli O157∶H7熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，用接種環(huán)取48 h后的培養(yǎng)液分別劃線接種于伊紅美藍(lán)平板，（36±1）℃培養(yǎng) 18 h-24 h。

2 結(jié)果

2.1 基因組的提取及驗(yàn)證

如圖1-A所示，提取的E. coli O157∶H7的基因組通過(guò)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，獲得完整的DNA，提取的DNA條帶亮，說(shuō)明濃度合格；沒(méi)有拖尾嚴(yán)重的現(xiàn)象，說(shuō)明長(zhǎng)度沒(méi)有斷裂；無(wú)雜帶，說(shuō)明沒(méi)有RNA污染。如圖1-B所示，用兩條細(xì)菌16S rDNA引物對(duì)E. coli O157∶H7基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得90 bp的目的條帶，且無(wú)其他雜條帶。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis image

2.2 qPCR體系的優(yōu)化

2.2.1 引物F、R的濃度優(yōu)化 圖2是引物F、R的濃度優(yōu)化結(jié)果，如圖所示，隨著引物F、R濃度增高，Ct值沒(méi)有一定的規(guī)律（圖2-C），熒光強(qiáng)度逐漸增大（圖2-A）。當(dāng)引物F、R濃度為0.2 μmol/L時(shí)，Ct值最小，但熒光強(qiáng)度最低，當(dāng)引物F、R濃度為0.4 μmol/L時(shí)，Ct值增加少，且熒光強(qiáng)度明顯提升，當(dāng)引物F、R濃度大于0.4 μmol/L后，Ct值逐漸增大，且擴(kuò)增曲線不是很平滑。電泳圖（圖2-B）中，當(dāng)引物F、R濃度在0.4 μmol/L后，擴(kuò)增條帶亮度無(wú)明顯變化，當(dāng)引物F、R濃度為1.0 μmol/L時(shí)，陰性對(duì)照和空白對(duì)照出現(xiàn)了假陽(yáng)性。因此，定量圖與電泳圖結(jié)果一致，但qPCR比傳統(tǒng)電泳圖更加靈敏。綜合考慮，引物F、R最適濃度為0.4 μmol/L。

圖2 大腸埃希菌O157∶H7引物 F、R 的濃度優(yōu)化Fig. 2 Concentration optimization of F and R of E. coli O157：H7

2.2.2 引物與探針的比例優(yōu)化 圖3是引物與探針的比例優(yōu)化結(jié)果，如圖所示，當(dāng)引物與探針的比例逐漸減小，Ct值逐漸減?。▓D3-C），當(dāng)引物與探針的比例小于3∶1后，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)引物與探針的比例為1∶3時(shí)，Ct值最小，但擴(kuò)增曲線不平滑，出現(xiàn)了嚴(yán)重曲折，且重復(fù)性不佳，當(dāng)引物與探針的比例為1∶1時(shí)，Ct值較小，且熒光強(qiáng)度高。電泳圖（圖3-B）中，引物與探針的比例為1∶1時(shí)，條帶最亮，當(dāng)引物與探針的比例為1∶2和1∶3時(shí)，陰性對(duì)照和空白對(duì)照出現(xiàn)了假陽(yáng)性。因此，定量圖與電泳圖結(jié)果一致，但qPCR比傳統(tǒng)電泳圖更加靈敏。綜合考慮，引物與探針的最適比例為1∶1，即探針的最適濃度為0.4 μmol/L。

圖3 大腸埃希菌O157∶H7的引物與探針的比例優(yōu)化Fig. 3 Optimization of the ratios of primers to probes of E.coli O157∶H7

2.2.3 退火溫度的優(yōu)化 圖4是退火溫度的優(yōu)化結(jié)果，如圖所示，當(dāng)退火溫度逐漸增大時(shí)，熒光強(qiáng)度逐漸減弱（圖4-A），當(dāng)退火溫度為50℃時(shí)，Ct值最?。▓D4-C），但曲線不平滑，當(dāng)退火溫度為53℃時(shí)，Ct值較50℃時(shí)相差不大，當(dāng)退火溫度大于59℃時(shí)，抑制了擴(kuò)增，圖4-B中，條帶無(wú)明顯變化。因此，定量圖與電泳圖結(jié)果一致，但qPCR比傳統(tǒng)電泳圖更加靈敏。綜合考慮，最適退火溫度為53℃。

圖4 大腸埃希菌O157∶H7的退火溫度優(yōu)化Fig. 4 Optimization of annealing temperature for E. coli O157∶H7

2.3 靈敏度和特異性

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，進(jìn)行qPCR檢測(cè)方法的靈敏度分析。圖5是E. coli O157∶H7的靈敏度分析結(jié)果，如圖所示，Ct值隨著大腸埃希菌濃度的減小而逐漸增大，且在2.1×108- 2.1×102copies/μL的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其回歸方程為Y = -3.194 8 lgX+41.766（R2= 0.995 9），其檢測(cè)限為2.1 copies/μL。因此，說(shuō)明建立的qPCR檢測(cè)方法具有較低的檢測(cè)限和較寬的檢測(cè)范圍，呈現(xiàn)較高的靈敏度。

圖5 建立的大腸埃希菌O157：H7檢測(cè)方法的靈敏度Fig. 5 Sensitivity of the established E. coli O157：H7 detection method

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，進(jìn)行qPCR檢測(cè)方法的特異性分析。圖6是大腸埃希菌的特異性分析結(jié)果，如圖所示，E. coli O157∶H7擴(kuò)增曲線的Ct值明顯小于其他菌種，且擴(kuò)增曲線平滑、熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，而其余菌種擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)已不清楚或沒(méi)有擴(kuò)增，說(shuō)明構(gòu)建qPCR檢測(cè)方法對(duì)大腸埃希菌檢測(cè)具有較好的特異性。

2.4 凍干保護(hù)劑對(duì)qPCR擴(kuò)增的影響

圖7-A、B是海藻糖對(duì)E. coli O157∶H7 qPCR擴(kuò)增的影響，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為5.5%時(shí)，Ct值最小，且擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為其余值時(shí)，Ct值增大，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度減弱，重復(fù)性差。圖7-C、D是PBS對(duì)E. coli O157∶H7 qPCR擴(kuò)增的影響，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為0.2×?xí)r，Ct值最小，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為0.1×?xí)r，Ct值增大，當(dāng)最終質(zhì)量濃度大于0.3×后，Ct值增大，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度減弱或完全抑制了擴(kuò)增。圖7-E、F是BSA對(duì)E.coli O157∶H7 qPCR擴(kuò)增的影響，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為0.6%時(shí)，Ct值最小。當(dāng)最終質(zhì)量濃度為其余值時(shí)，Ct增大，擴(kuò)增曲線熒光減弱或重復(fù)性不佳。圖7-G、H是甘露醇對(duì)E. coli O157∶H7 qPCR擴(kuò)增的影響，如圖所示，甘露醇對(duì)擴(kuò)增的影響很明顯，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為0.2%時(shí)，Ct值最小，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為其余值時(shí)，擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)已不清楚且熒光減弱

圖7 凍干保護(hù)劑對(duì) qPCR 擴(kuò)增的影響Fig. 7 Effect of lyoprotectant on qPCR amplification

2.5 凍干保護(hù)劑保護(hù)作用濃度的確定

圖8-A、B是海藻糖的凍干保護(hù)作用結(jié)果，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為4.5%、5.5%、8.5%時(shí)，Ct值相當(dāng)，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度4.5%和5.5%較強(qiáng)，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為其余值時(shí)，Ct值增大，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度減弱或擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)已不清楚。圖8-C、D是PBS的凍干保護(hù)作用結(jié)果，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為0.2×?xí)r，Ct值最小，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為0.3×?xí)r，Ct值增大，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為其余值時(shí)，擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)已不清楚或完全抑制擴(kuò)增。圖8-E、F是BSA的凍干保護(hù)作用結(jié)果，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為0.6%、0.9%時(shí)，Ct值和擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度相當(dāng)，當(dāng)最終質(zhì)量濃度其余值時(shí)，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度減弱或拐點(diǎn)已不清楚。圖8-G、H是甘露醇的凍干保護(hù)作用結(jié)果，如圖所示，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為0.25%時(shí)，Ct值最小，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，當(dāng)最終質(zhì)量濃度為其余值時(shí)，擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)已不清楚且熒光強(qiáng)度減弱。

圖8 凍干保護(hù)劑對(duì) qPCR 體系的凍干保護(hù)作用Fig. 8 Freeze-drying protective effect of lyoprotectant on qPCR system

2.6 熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的建立

基于此，凍干保護(hù)劑由5.5%海藻糖、0.2×PBS、0.6%BSA、0.25%甘露醇組成，并與qPCR體系組成試劑盒。圖9-A是利用試劑盒檢測(cè)E. coli O157∶H7的擴(kuò)增曲線圖，如圖所示，當(dāng)通過(guò)試劑盒檢測(cè)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組Ct值較小、有平緩的擴(kuò)增曲線、擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，與未凍干擴(kuò)增試劑對(duì)照組的擴(kuò)增曲線幾乎重合，而未添加凍干保護(hù)劑的凍干擴(kuò)增試劑的Ct值較大或擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)已不清楚或無(wú)擴(kuò)增曲線，圖9-B是由海藻糖、PBS、BSA、甘露醇組成的復(fù)合凍干保護(hù)劑與qPCR體系混合凍干后的形態(tài)，1是無(wú)凍干保護(hù)劑凍干的樣品，其幾乎沒(méi)有形狀，2是無(wú)甘露醇的復(fù)合凍干保護(hù)劑體系凍干的樣品，其呈透明狀，在反應(yīng)管上有粘附。3是試劑盒中的樣品，其呈白色海綿狀，有效物質(zhì)較為緊密，管壁上沒(méi)有粘附。

圖9 熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的建立Fig. 9 Establishment of the fluorescent quantitative lyophilized detection kit

2.7 熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的重復(fù)性

圖10-A是利用同一時(shí)間研制的3個(gè)E. coli O157∶H7熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒檢測(cè)E. coli O157∶H7的檢測(cè)效果，每個(gè)試劑盒分別3個(gè)平行，如圖所示，熒光曲線幾乎重合，3個(gè)熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的Ct平均值分別為17.596、17.917、17.937，批內(nèi)變異系數(shù)分別為0.26%、0.51%、0.3%；圖10-B利用不同時(shí)間研制的3個(gè)熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒檢測(cè)E. coli O157∶H7的檢測(cè)效果，如圖所示，熒光曲線幾乎重合，3個(gè)熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的Ct平均值分別為17.85、17.63、17.957，批間變異系數(shù)分別為0.39%、0.49%、0.093%。

圖10 熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的重復(fù)性Fig. 10 Reproducibility of the fluorescence quantitative lyophilized detection kit

2.8 熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性

圖11是E. coli O157∶H7熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒在常溫下放置2個(gè)月、4個(gè)月、半年后的檢測(cè)效果，如圖所示，放置3個(gè)時(shí)間段的試劑盒的擴(kuò)增曲線幾乎重合，因此，熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒穩(wěn)定性高，儲(chǔ)存期長(zhǎng)。特別注意，由于空氣中含有水分等可能影響凍干試劑保存效果的成分，為了使其復(fù)溶后能夠達(dá)到使用目的，同時(shí)為了防止凍干試劑的形態(tài)因吸水而塌陷，使用前需要將其進(jìn)行密封保存，儲(chǔ)存環(huán)境須滿足干燥、清潔、不易受到外界污染等條件。

圖11 熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果Fig. 11 Detection effect of the fluorescence quantitative lyophilized detection kit

2.9 實(shí)際樣品的檢測(cè)

利用所研制的E. coli O157∶H7熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒分別對(duì)生牛肉、生豬肉和生雞肉進(jìn)行檢測(cè)，如圖12-A所示，擴(kuò)增曲線無(wú)明顯Ct值。同時(shí)，利用國(guó)標(biāo)法進(jìn)行對(duì)比，如圖12-B所示，伊紅美藍(lán)平板上無(wú)黑色中心典型菌落，兩種方法都表明3種實(shí)際樣品均未檢測(cè)出E. coli O157∶H7。

圖12 實(shí)際樣品的檢測(cè)Fig. 12 Detection of actual samples

3 討論

大腸埃希菌種分類較多，毒素不同，毒力因子不同，對(duì)應(yīng)菌株分析特異性基因是擴(kuò)增成功的決定性因素。隨著qPCR技術(shù)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外已有許多研究報(bào)道了針對(duì)大腸埃希菌的qPCR方法，靶標(biāo)菌的特異性基因不盡相同。針對(duì)大腸埃希菌，常用的靶基因主要有rfbE、eaeA、stx1、stx2、uidA等［19-21］。qPCR體系反應(yīng)條件優(yōu)化對(duì)于擴(kuò)增是必要的，引物濃度、引物與探針的比例、退火溫度對(duì)避免擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度弱、避免引物二聚體、避免低靈敏度具有決定性作用。引物濃度低影響擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度，引物濃度過(guò)高影響特異性［7］，探針濃度高影響擴(kuò)增曲線平滑度和擴(kuò)增特異性，退火溫度過(guò)高或?qū)е履０搴鸵锝Y(jié)合不牢固，過(guò)低則容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。Ibekwe等［8］所建立的qPCR檢測(cè)方法其檢測(cè)限為3.5×103CFU/mL；王建昌等［22］所建立的qPCR檢測(cè)方法其檢測(cè)限為103CFU/mL；柯振華等［23］采用多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)靶標(biāo)致病菌，對(duì)于E.coli O157∶H7的檢測(cè)限為103CFU/mL。

對(duì)于凍干保護(hù)劑體系，首先要考慮到qPCR擴(kuò)增是微體系擴(kuò)增，加入的組分可能對(duì)擴(kuò)增會(huì)有影響，因此，凍干保護(hù)劑首先要滿足不對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)生任何抑制作用的要求，每種凍干保護(hù)劑的濃度對(duì)擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度和Ct值具有較大的影響，有的還影響擴(kuò)增曲線的平滑度。另外，在凍干過(guò)程中主要發(fā)揮保護(hù)作用，每種凍干保護(hù)劑的最適濃度對(duì)凍干和擴(kuò)增都很重要［16，24］。凍干保護(hù)劑種類較多，其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，實(shí)現(xiàn)的功能也不同，海藻糖作為穩(wěn)定劑，是目前應(yīng)用最廣泛的糖類保護(hù)劑，磷酸鹽作為緩沖劑，BSA具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，甘露醇作為填充劑，復(fù)合保護(hù)劑能夠更全面地對(duì)qPCR擴(kuò)增試劑進(jìn)行保護(hù)，且能夠保持理想的外觀，其是凍干試劑包裝、運(yùn)輸和儲(chǔ)存的基本要求［25］。在凍干過(guò)程中，預(yù)凍是不可忽視的，應(yīng)注意要避光凍干，凍干機(jī)上方應(yīng)用黑色的避光材料遮擋。儲(chǔ)存試劑盒時(shí)，也應(yīng)注意避光。對(duì)于凍干保護(hù)劑影響擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度和Ct值的機(jī)制［13，16］，目前尚不清楚，需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

我們所構(gòu)建的熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒便于常溫儲(chǔ)存、常溫運(yùn)輸，其檢測(cè)限可低至2.1 copies/μL，并且在特異性檢測(cè)中，也體現(xiàn)了良好的選擇性。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該檢測(cè)方法在對(duì)E.coli O157∶H7檢測(cè)時(shí)體現(xiàn)了較高的靈敏度和特異性，體現(xiàn)了本檢測(cè)方法的可靠性。

4 結(jié)論

本文研制了一種針對(duì)E.coli O157∶H7的熒光定量?jī)龈蓹z測(cè)試劑盒。本研究所提出的方法具有以下兩個(gè)優(yōu)勢(shì)：（1）靈敏度高特異性強(qiáng)。對(duì)E.coli O157∶H7的eaeA基因進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，建立了qPCR最優(yōu)擴(kuò)增體系，其檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)限為2.1 copies/μL，且特異性強(qiáng)。（2）試劑盒便于常溫儲(chǔ)存及運(yùn)輸。