張雨函 范熠 李婷婷 龐爽 劉為 白可喻 張西美

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京100081；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 國際生物多樣性中心東亞辦事處，北京 100081）

葉表生境廣闊，總表面積估計(jì)超過4×108km2，植被模型估計(jì)的葉子總表面積大約是陸地表面積的兩倍［1］，是陸生微生物的一個(gè)巨大且極其多樣化的棲息地，也是地球上最大的微生物棲息地之一。葉表面的環(huán)境是復(fù)雜而動(dòng)態(tài)的，葉表微生物在這樣極端、緊張和變化的環(huán)境中仍有著豐富的多樣性［2］，葉表面的微生物相互作用可以影響植物種群在自然生態(tài)系統(tǒng)中的適應(yīng)性。葉表微生物不僅促進(jìn)植物生長發(fā)育，還可以抑制病原菌的入侵和定殖，對植物有著重要的保護(hù)作用［3］。由于植物的空中部分是不適宜微生物生存的開放系統(tǒng)，這些微生物極易受到各種環(huán)境條件和營養(yǎng)缺乏的影響，不同分類群的微生物在植物葉表面的數(shù)量波動(dòng)變化很大［4］，導(dǎo)致對葉表微生物群落的組成和功能等基本問題仍然沒有清晰的認(rèn)知。研究表明葉表微生物群落較為復(fù)雜［5］，特別是通過與植物的相互作用進(jìn)而影響整個(gè)生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)，葉表微生物群落及其對植物生長、發(fā)育和保護(hù)的重要作用已經(jīng)受到了人們的廣泛關(guān)注［6］。因此盡可能多地保留微生物多樣性可以更好地理解生物多樣性的結(jié)構(gòu)、功能和生態(tài)多樣性［7］。

由于葉表微生物基因組DNA的提取難度較大，葉表微生物在推動(dòng)生態(tài)系統(tǒng)功能和植物群落動(dòng)態(tài)方面作用的研究較少。一直以來，人們對葉表微生物的認(rèn)識是建立在純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對葉表微生物多樣性的認(rèn)識不夠深入。Yang等［5］采用培養(yǎng)和非培養(yǎng)方法對7種不同植物的葉表微生物群落進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果表明與不依賴培養(yǎng)的方法相比，傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法無法檢測到大多數(shù)優(yōu)勢的葉表微生物。測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展為微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域帶來革命性的影響，以擴(kuò)增子測序和宏基因組測序?yàn)榇淼姆桥囵B(yǎng)測序技術(shù)極大地增強(qiáng)了對葉表微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)的評估。擴(kuò)增子測序局限于研究物種的群落組成、物種間的進(jìn)化關(guān)系和群落多樣性［8］，無法對微生物的功能做出解釋，而宏基因組測序通過環(huán)境DNA構(gòu)建克隆文庫，可以得到生態(tài)環(huán)境中的全部微生物基因的總和，包括可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物基因的總和［9］，提供葉表微生物分類群和功能更為準(zhǔn)確的描述［7，10］，幫助我們理解微生物與宿主和環(huán)境的聯(lián)系和微生物組的整體功能［11］，進(jìn)而可以開發(fā)新的葉表微生物資源。宏基因測序同樣為微生物物種鑒定開辟了新的研究途徑，它能夠?qū)?fù)雜環(huán)境背景下的基因組異質(zhì)性和進(jìn)化進(jìn)行分析，并提供了遠(yuǎn)比在培養(yǎng)皿中觀察到的微生物多樣性更多的途徑［12-13］。目前，宏基因組學(xué)作為迄今為止最全面地了解微生物群落特征、最大限度地挖掘微生物資源的一種方法，已經(jīng)成為了國際上微生物生態(tài)學(xué)主要的研究手段。到目前為止，宏基因組學(xué)研究已經(jīng)開展了多種常見環(huán)境（如土壤、水等）和極端環(huán)境（如冰川、間歇泉等）的研究［14］，但是對自然生態(tài)中的各種植物的葉表微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的功能和作用尚不清楚。

宏基因組學(xué)研究的第一步是直接從生活在特定環(huán)境中的所有微生物中提取出高質(zhì)量、完整的微生物基因組DNA［15-16］。宏基因組數(shù)據(jù)的質(zhì)量和準(zhǔn)確性依賴于可靠的取樣和DNA提取程序［17］。取樣的關(guān)鍵是收集到足夠的微生物進(jìn)行測序，為了保證獲取足夠的葉表微生物基因組DNA，需要對葉表微生物進(jìn)行有效的分離。已有的研究在改進(jìn)DNA提取過程中，一般只涉及DNA的提取過程［18］，很少重視對葉表微生物的富集和前處理，對此本研究將目標(biāo)集中在收集葉表微生物細(xì)胞的過程，尤其是對洗脫液的選擇。對于洗脫液的選擇，主要有磷酸緩沖液和無菌水［19］等，不同洗脫液對于不同植物葉表微生物的洗脫效果沒有統(tǒng)一的結(jié)論。由于微生物細(xì)胞通常附著在表面上，并可能被整合成生物膜［20］，使用磷酸緩沖液或無菌水作為洗脫液的方法無法洗脫形成生物膜的細(xì)胞，可能會導(dǎo)致樣本微生物DNA的質(zhì)量不佳，葉表微生物DNA 總量不夠。為了解決葉表微生物多樣性豐富但可獲取的數(shù)量少這一難點(diǎn)，本研究通過改良洗脫液成分，通過洗脫并收集更多的葉表微生物，以提高對葉表微生物DNA的提取質(zhì)量。通過此方法能夠提高葉表微生物DNA的提取效率，進(jìn)而提高宏基因組文庫構(gòu)建的成功率，促進(jìn)葉表微生物宏基因組學(xué)研究的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選取內(nèi)蒙古呼倫貝爾草原常見的6種草本植物，分別為羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel.）、叉分蓼（Polygonum divaricatum L.）、冷蒿（Artemisia frigida Willd.）、馬藺（Iris lactea Pall. var.chinensis（Fisch.）Koidz.）、披針葉黃華（Thermopsis lanceolata R. Br.）、野韭（Allium ramosum L.）。分別取其植物葉片，放于滅菌的封口袋，每袋大約180 g，每種10袋。迅速將樣品轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，存放于-20℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 植物葉表微生物的分離和收集 （1）實(shí)驗(yàn)以無菌水作為對照，添加表面活性劑Silwet L-77的PBS緩沖液（PBS+ Silwet L-77）為處理。配置PBS磷酸緩沖鹽溶液（1×PBS：137 mmol/L NaCl，10 mmol/L phosphate，2.7 mmol/L KCl，pH 7.4）， 在 每1 000 mL的PBS緩沖液中加入200 μL 表面活性劑Silwet L-77（GE Bayer Silicones），分別稱取大約30 g葉片置于2個(gè)500 mL無菌玻璃瓶中，分別加入一定量的可以淹沒葉片的無菌水和PBS+ Silwet L-77，200 r/min振蕩20 min，將微生物細(xì)胞從葉上清洗掉，取出葉片，留下含有菌泥的洗脫液，每組處理重復(fù)2次。（2）將余下的植物樣品采用的同樣的方法，循環(huán)利用洗脫液進(jìn)行振蕩，以此循環(huán)，直至將葉片全部洗完。這樣可以保證葉表微生物更好的富集在一起。（3）將洗脫液通過100 μm大小的細(xì)胞過濾器過濾到50 mL離心管中，5 000×g離心10 min，棄去上清液，所得沉淀存于-80℃冰箱，用于DNA的提取。

1.2.2 植物葉表微生物DNA的提取與檢測 使用MoBio PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation Kit按照說明進(jìn)行葉表基因組DNA的提取。為了獲得足夠量的DNA用于宏基因組測序，將洗脫下來的沉淀全部用于DNA的提?。總€(gè)重復(fù)0.25 g沉淀物）。每個(gè)重復(fù)最終得到的DNA即為用100 μL純水洗脫下來的DNA。用Thermo NanoDrop2000分光光度計(jì)測定各樣本DNA的濃度及A260/A280值。將使用不同洗脫液進(jìn)行前處理收集得到的菌泥提取到的葉表微生物宏基因組DNA送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，經(jīng)1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，判斷哪一種分離和收集葉表微生物的方法提取得到的基因組DNA可以滿足宏基因組建庫的要求。

1.2.3 宏基因組測序 選取滿足宏基因組建庫的葉表微生物基因組DNA樣品進(jìn)行鳥槍法宏基因組測序。準(zhǔn)備用于測序的DNA庫，根據(jù)Illumina配對端準(zhǔn)備試劑盒的描述對DNA提取液進(jìn)行處理。機(jī)械剪切DNA，大小選擇至～180 bp，純化凝膠。測序是在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina Hiseq 2000平臺上進(jìn)行的。

1.2.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控 為了提高后續(xù)分析的可靠性和質(zhì)量，對原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行了以下兩步處理。首先， 使 用 fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0） 對 reads 3′端 和 5′端 的 adapter序列進(jìn)行質(zhì)量剪切。其次使用fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）去除剪切后長度小于50 bp、平均堿基質(zhì)量值低于20以及含N堿基的reads，保留高質(zhì)量的pair-end reads和singleend reads。

1.2.5 葉表微生物COG功能注釋 使用FLASH對宏基因組的配對序列進(jìn)行拼接，將拼接序列上傳到STRING數(shù)據(jù)庫，并使用MBLASTX（E-value cutoff 1e-6）對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行直系同源聚類（clusters of orthologous groups of proteins，COG）功能注釋，并將注釋結(jié)果進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 植物葉表微生物總DNA質(zhì)量評估

宏基因組一次建庫濃度/總量標(biāo)準(zhǔn)：濃度 ≥10 ng/μL，文庫構(gòu)建需要總量5-10 μg的環(huán)境DNA。由表1可知以PBS+ Silwet L-77為洗脫液分離收集得到的植物葉表微生物DNA的濃度都大于20 ng/μL且總量都大于5 μg，能夠滿足宏基因組建庫的要求。以無菌水作為洗脫液得到的葉表微生物最終獲得的DNA濃度較低且總量不滿足宏基因組文庫構(gòu)建所需的環(huán)境DNA總量。通常用A260/A280檢測DNA的純度，通過兩種方法得到的每種植物葉表微生物DNA的OD260/280在1.8-2.0之間，說明DNA純度都滿足建庫要求（表1）。對植物種類和提取方法對葉表微生物DNA濃度的方差分析結(jié)果表明，植物種類對微生物DNA濃度無影響，提取方法顯著影響葉表微生物DNA濃度（表2），以PBS+ Silwet L-77為洗脫液分離收集得到的植物葉表微生物DNA的濃度明顯大于以無菌水為洗脫液分離收集得到的DNA的濃度（圖1）。瓊脂糖凝膠電泳圖（圖2）顯示，以PBS+Silwet L-77為洗脫液分離和收集得到的葉表微生物最終得到的DNA質(zhì)量，DNA主帶 ≥5 kb，DNA溶液無嚴(yán)重RNA、蛋白、糖類等雜質(zhì)污染，而以無菌水作為洗脫液最后提取出來的DNA質(zhì)量；膠圖條帶彌散，DNA溶液無嚴(yán)重RNA、蛋白、糖類等雜質(zhì)污染，DNA濃度和總量較低，不滿足宏基因組建庫需求。綜上所述，用無菌水洗脫得到微生物較少，提取效率不高，提取得到植物葉表微生物DNA濃度和質(zhì)量不滿足宏基因組建庫標(biāo)準(zhǔn)，以PBS+ Silwet L-77作為洗脫液所提取微生物相對較多，提取效率高，提取得到植物葉表微生物DNA都相對完整且DNA總量滿足宏基因組標(biāo)準(zhǔn)建庫需求。

圖1 不同洗脫液提取不同植物種類葉表微生物的DNA濃度Fig. 1 DNA concentration of leaf surface microorganism extracted from different plant species by different eluents

圖2 六種植物葉表微生物DNA電泳圖Fig. 2 Microbial DNA electrophoresis patterns on the leaf surfaces of 6 plants

表1 無菌水和PBS緩沖液+Silwet L-77表面活性劑對葉表微生物基因組DNA的提取效果Table 1 Extraction effect of sterile water and PBS buffer solution +Silwet L-77 surfactant on microbial genomic DNA from leaf surface

表2 植物種類與不同富集方法對DNA濃度的影響Table 2 Effects of plant species and different enrichment methods on DNA concentration

2.2 宏基因組測序結(jié)果

以PBS+ Silwet L-77為提取葉表微生物的洗脫液獲取的DNA作為最終樣品進(jìn)行宏基因組測序。通過數(shù)據(jù)質(zhì)量控制，過濾掉低質(zhì)量序列、接頭序列等雜質(zhì)，得到的Clean reads占比在98%以上（表3），表明原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量較高。綜合各項(xiàng)指標(biāo)確定在這6種植物的葉表提取得到用于宏基因組測序的DNA質(zhì)量合格，滿足建庫標(biāo)準(zhǔn)，可以進(jìn)行下游的生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。經(jīng)過宏基因組測序，最終得到葉表微生物的各個(gè)分類群占葉表微生物群的相對比例（圖3）。結(jié)果顯示這6種植物的葉表微生物中的細(xì)菌在全基因組測序中占比達(dá)到了一半以上，說明葉表微生物群落主體由細(xì)菌組成，其次為真菌，古菌最少，幾乎沒有，其他的非微生物的比例說明可能存在植物DNA污染。

圖3 六種植物葉表微生物不同分類群的百分比Fig. 3 Percentages of different taxa microorganism on the leaf surfaces of 6 plants

表3 宏基因組測序統(tǒng)計(jì)Table 3 Metagenomics sequencing statistics

與擴(kuò)增子測序分析相比，宏基因組學(xué)分析不僅能夠進(jìn)行物種注釋，還能夠通過比對多個(gè)功能數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行功能注釋，揭示微生物群落的功能多樣性和功能潛力。為了揭示優(yōu)化方法后提取建庫得到的葉表DNA宏基因測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，在物種注釋的基礎(chǔ)上，宏基因組分析通過比對直系同源聚類（COG）進(jìn)行功能注釋分析。通過BLAST將宏基因組拼接組裝序列與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，COG功能分類富集結(jié)果如圖4所示，說明宏基因組建庫可以滿足物種注釋和功能注釋的需求，達(dá)到揭示微生物群落功能多樣性的研究目的，進(jìn)而表明以PBS+ Silwet L-77為洗脫液收集得到DNA可以通過宏基因組測序?qū)χ参锏娜~表微生物進(jìn)行功能研究。

圖4 六種植物葉表微生物COG功能注釋Fig. 4 Functional annotation of microorganism COG on the leaf surfaces of 6 plants

3 討論

本研究以提高葉表微生物的收集和分離為目的，只有獲取足夠多的葉表微生物，才可能進(jìn)一步提高DNA的獲得量。進(jìn)行DNA提取工作的第一步是將微生物從葉片中分離出來，超聲和震蕩技術(shù)已用于這一目的，但由于操作較為劇烈往往不容易得到大片段的DNA［21］。穩(wěn)定的大片段基因組文庫能保證基因簇的完整性，更利于目的基因的結(jié)構(gòu)和功能分析［22］，因此大片段DNA的提取是建立高質(zhì)量宏基因組文庫的關(guān)鍵。超聲波利用聲波產(chǎn)生高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用會破壞植物細(xì)胞［22］，為此本研究只采用恒溫?fù)u床震蕩，而沒有選擇超聲波震蕩。

由于葉片形態(tài)差異，葉片的結(jié)構(gòu)和表面化學(xué)構(gòu)成了一個(gè)特殊的微環(huán)境［6］，各種葉片表面特征，如表皮細(xì)胞連接處形成的凹陷處、沿靜脈和毛狀體基部都被確定為微生物的優(yōu)先附著位置［2］，導(dǎo)致微生物在葉片表面的分布不均勻。之前研究表明無菌水和磷酸緩沖液這兩種洗脫液對葉表微生物基因組DNA提取效果基本沒有差別［19］，目前多采用的是使用磷酸緩沖鹽溶液作為洗脫液來獲取葉表微生物［23］。相較于無菌水，PBS磷酸鹽緩沖液具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜pH緩沖作用，可以使完整的、具有活性的微生物細(xì)胞保持其特性，面對復(fù)雜的葉表環(huán)境，微生物需要形成聚集體以及分泌生物活性化合物來克服這一困難［2］。只使用PBS磷酸鹽緩沖液不足以使我們獲得足夠多的葉表微生物。葉片最外側(cè)的蠟質(zhì)層具有疏水性，普通緩沖液的很難使葉面濕潤，而表面活性劑可以降低溶液與葉表蠟質(zhì)層之間的界面張力［24］，使葉片更易被潤濕，從而能更有效的收集葉表微生物。已有研究采用含有0.01% Tween-80的PBS緩沖液富集黃瓜（Cucumis sativus L.）葉片表面的微生物［25］，由于水的表面張力為72.4 mN/m，0.1%的Silwet-L77系列有機(jī)硅溶液的表面張力約為21 mN/m［26］，0.1%的Tween 80水溶液的表面張力約為 48.21 mN/m［27］，相比 Tween-80，Silwet L-77 更能降低水的表面張力。Silwet L-77是一種高效有機(jī)硅表面活性劑，具有很強(qiáng)的表面活性，可以在難以濕化的表面迅速擴(kuò)散，幾乎可輕易濕潤所有種類的葉面，增加葉子濕潤性，產(chǎn)生的水膜可以讓微生物在葉子表面活動(dòng)起來［26，28］，促進(jìn)微生物在葉平面上的運(yùn)動(dòng)，在震蕩的過程中更容易將微生物從葉表面洗脫下來。PBS磷酸緩沖液結(jié)合表面活性劑Silwet L-77作為洗脫液被成功應(yīng)用到根際微生物的提取中［29］，但在葉表微生物上的應(yīng)用幾乎沒有，因此選擇在PBS磷酸緩沖液中加入表面活性劑Silwet L-77提高對葉表微生物的富集。由于根系上會附著很多的土壤顆粒，很容易就可以得到足夠的菌泥來獲得足夠量的根際微生物基因組DNA，而植物葉片表面極小量的微生物以及形態(tài)各異的葉表皮環(huán)境增加了分離和收集葉表微生物的難度，需要大量的植物葉片才可富集得到足夠的菌泥進(jìn)行DNA提?。?0］。因此植物葉片樣品的采集量也是獲取足夠葉表微生物基因組DNA的關(guān)鍵因素，由于采樣量的限制，本研究每組處理做了兩次重復(fù)，在以后的方法改進(jìn)中需要注意。

目前，鳥槍法宏基因測序仍然是適合研究葉表微生物的非培養(yǎng)方法，不僅可以對環(huán)境樣本中存在的微生物進(jìn)行分類［31］，而且可以更深入地了解測序數(shù)據(jù)中識別出的微生物的結(jié)構(gòu)、功能和代謝途徑。對于葉表微生物，宏基因組測序可以實(shí)現(xiàn)物種注釋和功能描述，通過增加測序深度和數(shù)據(jù)量，可以深度揭示植物葉表微生物群落，甚至是低豐度的但可能在生態(tài)系統(tǒng)功能中發(fā)揮重要作用的微生物也可以被發(fā)掘［32］。宏基因組測序可以得到環(huán)境微生物的全基因組序列［10］，能夠全面顯示樣品中微生物群落的實(shí)際豐度和多樣性。植物的葉表存在各種各樣的微生物，包括細(xì)菌、古生菌、原生生物和真菌［33］，具有高度的多樣性和重要的生態(tài)學(xué)意義。本研究最終得到的每種植物葉表微生物的分類群在葉表微生物群中占比各不相同，可能是由于植物種類會影響葉片的微生物攜帶能力。一直以來，大多數(shù)關(guān)于葉表微生物的研究大部分集中在細(xì)菌上，對葉表真菌的研究目前也有所增多，但葉表真菌和細(xì)菌很少被同時(shí)研究［12］，葉表很少有古菌，對葉表古菌的研究幾乎沒有。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，宏基因組測序可以對同一環(huán)境的所有微生物進(jìn)行研究，打破迄今為止大多數(shù)與植物葉表微生物相關(guān)的研究只集中在單個(gè)微生物分類群（即細(xì)菌）的界限。通過COG功能注釋，可以對基因功能進(jìn)行預(yù)測，發(fā)掘微生物群落功能，對進(jìn)一步揭示葉表微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究得到了一種可以更高效的分離和收集葉表微生物的方法，Silwet L-77表面活性劑緩沖液的使用提高了葉表微生物的收集量，在震蕩清洗的過程中，選擇循環(huán)利用洗脫液，一方面可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本，另一方面可以更好的富集葉表微生物。通過商業(yè)試劑盒提取得到的高純度和高質(zhì)量的DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，宏基因組測序、數(shù)據(jù)質(zhì)控和功能注釋的驗(yàn)證，此方法滿足宏基因組建庫的要求，并成功進(jìn)行了宏基因組測序和建庫。