熊和麗 沙茜 劉韶娜 相德才 張斌 趙智勇

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650024）

細(xì)胞是機(jī)體最基本功能單位，細(xì)胞類型和功能由其表達(dá)的RNA決定，同一個體細(xì)胞的基因組基本相同，但每種細(xì)胞類型甚至每個細(xì)胞表達(dá)的RNA具有唯一性［1］。普通以同質(zhì)組織或是同類細(xì)胞為整體進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測序，其基因表達(dá)是整個組織所有細(xì)胞的平均水平，掩蓋了細(xì)胞的獨特性及異質(zhì)性，并且在研究復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制過程中，目標(biāo)細(xì)胞的表達(dá)特征可能被組織其他大量細(xì)胞所掩蓋。傳統(tǒng)細(xì)胞的分類往往基于細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、位置或是有限的細(xì)胞標(biāo)記，而不是系統(tǒng)性和綜合性的指標(biāo)，并且由于細(xì)胞處于不斷變化過程中，導(dǎo)致難以區(qū)分細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)，稀有細(xì)胞更無從鑒定［2］，而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序通過對單個細(xì)胞的所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序，可以依據(jù)單個細(xì)胞的表達(dá)譜特征以高精度分辨率鑒定細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)，并且可以鑒定稀有細(xì)胞，鎖定目標(biāo)細(xì)胞以進(jìn)行深入分析，是解析目標(biāo)表型背后復(fù)雜分子細(xì)胞機(jī)制的有力工具。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序不僅在方法上是對傳統(tǒng)細(xì)胞鑒定與分類技術(shù)的突破，在功能上也將大力促進(jìn)細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展。

1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)簡介

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是對單細(xì)胞的mRNA進(jìn)行測序的技術(shù)。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序得益于高通量測序技術(shù)的發(fā)展，2009年，Tang等［3］通過對單個細(xì)胞mRNA測序方法的改進(jìn)，檢測到小鼠囊胚單細(xì)胞中的5 270個基因，其基因數(shù)量遠(yuǎn)高于利用微陣列對數(shù)百個囊胚細(xì)胞的測序數(shù)據(jù)，首次實現(xiàn)了單個細(xì)胞的mRNA高通量檢測，從此開啟了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序時代。隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的不斷發(fā)展，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)也從細(xì)胞類樣本延展到組織樣本，測序通量由單個細(xì)胞增加到上萬個細(xì)胞。至今，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已有十余種，但其操作步驟基本都包括單細(xì)胞的分離，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及測序。

1.1 單細(xì)胞的分離

從細(xì)胞或組織樣本中分離單個細(xì)胞是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的第一步，單細(xì)胞的分離應(yīng)快速、準(zhǔn)確以獲得高質(zhì)量的單細(xì)胞［4］。單細(xì)胞的分離首先需要制備單細(xì)胞懸液，制備細(xì)胞懸液的樣本主要是培養(yǎng)的細(xì)胞或各種組織。培養(yǎng)細(xì)胞通過機(jī)械吹打或酶解的方法制成細(xì)胞懸液，組織樣品經(jīng)過剪碎為小塊再利用酶進(jìn)行消化制備細(xì)胞懸液。由于不同細(xì)胞、組織特性的差異，酶的選擇及消化時間有所不同，需要摸索出最佳消化條件以獲得高活性及完整性的細(xì)胞。

制備的單細(xì)胞懸液根據(jù)樣品特點可以采用以下幾種方法分離為單個細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的操作，分別是熒光激活流式分選（fluorescent activated cell sorting，F(xiàn)ACS）、微流控裝置（microfluidic devices）、微量移液（micro-pipetting）以及激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）［5］。FACS 具有高通量、低成本、自動化以及高效率的特點，還可根據(jù)細(xì)胞標(biāo)記篩選目標(biāo)細(xì)胞，但其要求至少上萬的細(xì)胞起始量，不適合用于細(xì)胞數(shù)量少及珍貴的細(xì)胞樣品，并且分選壓力可能造成細(xì)胞破壞；微流控裝置利用微流控孔道將細(xì)胞分離到微滴或微孔中，可對微量樣品進(jìn)行處理，通量高，操作可標(biāo)準(zhǔn)化自動化，并且分選成本低，分選過程對細(xì)胞造成的破壞小，但微流控孔道對細(xì)胞體積大小有一定限制，可能會造成體積大的細(xì)胞被丟失，商業(yè)化的平臺10×Genomics是利用微滴，而BD Rhapsody是利用微孔的細(xì)胞捕獲方法［5-7］；微量移液利用毛細(xì)玻璃管在顯微鏡下從單細(xì)胞懸液或組織中分離單個細(xì)胞，操作耗時，通量低，但在顯微鏡下操作可以保證單個細(xì)胞的分離及選擇高質(zhì)量的細(xì)胞，適用于細(xì)胞數(shù)量少或是脆弱的細(xì)胞，如早期胚胎細(xì)胞，骨髓微環(huán)境細(xì)胞［5-6］；LCM利用激光從組織切片上分離單個目的細(xì)胞，其優(yōu)點是保留了細(xì)胞原有的空間位置信息，組織無需酶解，但組織切片的制作可能造成直徑大于切片厚度的細(xì)胞丟失或破壞，并且通量低，耗時耗力，對設(shè)備要求高［5，8］。

1.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及測序

目前的高通量測序平臺只能對DNA分子進(jìn)行測序，因此單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序中mRNA需要先反轉(zhuǎn)錄為cDNA后再進(jìn)行擴(kuò)增測序。由于單個細(xì)胞總RNA含量為皮克級，其中mRNA約僅占總RNA的2%-5%，而高通量測序建庫要求納克級DNA，因此需要將起始的cDNA擴(kuò)增數(shù)十萬倍才能構(gòu)建文庫［9］。分離的單細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞裂解后利用oligo（dT）引物對帶有poly（A）尾的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增，以此避免rRNA和tRNA的干擾，但同時也無法檢測不帶poly（A）尾的各種RNA。目前常用的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增方法有PCR法和體外轉(zhuǎn)錄線性擴(kuò)增［9］。利用PCR法的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)如Smart-Seq/Smart-Seq2，10× Chromium，Drop-seq，SCRB-seq，Seq-Well以及sci-RNA-seq，利用體外轉(zhuǎn)錄線性擴(kuò)增的技術(shù)如CEL-seq2/C1，inDrops，MARS-seq［10-11］。cDNA擴(kuò)增過程中PCR偏好是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序中基因表達(dá)定量的重要影響因素，通過對每條轉(zhuǎn)錄本添加一段6-10 bp的隨機(jī)序列（unique molecular identifiers，UMI）來為每條轉(zhuǎn)錄本引入特定標(biāo)記，一段UMI對應(yīng)一條轉(zhuǎn)錄本，無論PCR循環(huán)多少次，UMI數(shù)量不變，以此進(jìn)行基因表達(dá)定量，解決了cDNA的擴(kuò)增偏好，如CEL-seq，Drop-seq，MARS-seq等方法［10］。但由于引入標(biāo)記在3′端或5′端，不能測序全長mRNA，因此適用于對基因表達(dá)進(jìn)行定量，不適用于可變剪切的分析。而擴(kuò)增全長mRNA的方法如Smart-seq/Smart-seq2，通過雙端引物擴(kuò)增，避免了3′或5′偏好，但仍存在PCR偏好，然而全長mRNA可用于轉(zhuǎn)錄本注釋、等位基因表達(dá)及可變剪切分析［6，10］。擴(kuò)增的cDNA隨后被片段化并加上接頭序列進(jìn)行測序。另外，文庫構(gòu)建過程中通過對每個細(xì)胞引入barcode，可以將多個細(xì)胞乃至多個樣本混合測序，從而實現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的高通量，如 10× Chromium，Drop-seq，SCRB-seq，Seq-Well等方法，而不采用細(xì)胞barcode的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)如 Smart-Seq/Smart-seq2，一次只能測序一個細(xì)胞，適合細(xì)胞稀少的樣本如干細(xì)胞、胚胎細(xì)胞或目標(biāo)細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。

至今，已有超過10種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)被研究報道［11］，各種技術(shù)的文庫構(gòu)建方法不同，其測序表現(xiàn)也存在一定差異，Ziegenhain等通過從靈敏度、準(zhǔn)確性、測序細(xì)胞數(shù)及測序成本等幾個方面系統(tǒng)比較 6種 方 法（CEL-seq2/C1、Drop-seq、MARS-seq、SCRB-seq、Smart-seq/C1、Smart-seq2）的測序表現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)Smart-seq2檢測到單個細(xì)胞和總細(xì)胞的基因數(shù)最多，具有最佳的靈敏性，其次是SCRB-seq、Smart-seq/C1、CEL-seq2/C1， 而 Drop-seq和 MARS-seq單個細(xì)胞的基因數(shù)減少了近50%；CEL-seq2/C1、Drop-seq、MARS-seq、SCRB-seq由于引入 UMIs具有較低的擴(kuò)增噪音；當(dāng)細(xì)胞數(shù)量較大時，Drop-seq具有最好的測序成本優(yōu)勢，而MARS-seq、SCRB-seq和Smart-seq2在測序少量細(xì)胞時具有成本優(yōu)勢［10］。Ding等對兩種低通量（Smart-seq2和 CEL-seq）和5種高通量（10× Chromium，Drop-seq，Seq-Well，inDrops以及sci-RNA-seq）方法的系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)Smart-seq2和CEL-seq具有最佳靈敏度，而5種高通量方法中的10× Chromium檢測到的單個細(xì)胞的基因數(shù)最多；Drop-seq，Seq-Well，inDrops測序成本最低，Smart-seq2測序成本最高［11］。綜合來看，當(dāng)樣品細(xì)胞數(shù)量大，研究以鑒定細(xì)胞類型和稀有細(xì)胞為目的，Drop-seq是較適合的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法，若樣品細(xì)胞數(shù)量少，研究目的是轉(zhuǎn)錄組注釋，檢測遺傳變異及發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本亞型，Smart-seq2是比較好的選擇［10-11］。

另外，測序細(xì)胞數(shù)和測序深度是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒炘O(shè)計需要考慮的重要參數(shù)。由于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序細(xì)胞數(shù)受到細(xì)胞亞群多樣性，稀有細(xì)胞的比率及測序方法的影響，因此很難估計準(zhǔn)確的測序細(xì)胞數(shù)，目前對腫瘤細(xì)胞的測序數(shù)估計方法是利用公式P（d）= 1-（1-s）n，其中P（d）表示檢測力，s代表亞克隆頻率，n代表測序細(xì)胞數(shù)量。依據(jù)公式，當(dāng)目的細(xì)胞的比率為1%時，測序250個細(xì)胞能達(dá)到0.9的檢測力，而測序500個細(xì)胞達(dá)到1.0的檢測力［12］。Ziegenhain 等［10］通過對 CEL-seq2/C1、Dropseq、MARS-seq、SCRB-seq、Smart-seq/C1、Smartseq2六種方法的測序深度與敏感性關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)單個樣本測序reads達(dá)1 million reads時，測序靈敏性逐漸穩(wěn)定，當(dāng)測序reads從1 million增加到4.5 million時，測序靈敏性沒有明顯改變。Pollen等研究發(fā)現(xiàn)若以細(xì)胞分類和稀有細(xì)胞的鑒定為研究目的，建議單個細(xì)胞測序50 000到100 000 reads［13］，而Smart-seq2單細(xì)胞測序達(dá)到約1 million reads 時利于后續(xù)等位基因表達(dá)及可變剪切分析［14］。

2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的生物學(xué)應(yīng)用

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序通過單個細(xì)胞高精度的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜對細(xì)胞類型及細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間差異及變化，分析細(xì)胞動態(tài)變化過程以及細(xì)胞間互作關(guān)系，鑒別正常細(xì)胞與異常細(xì)胞等。

2.1 細(xì)胞類型鑒定

細(xì)胞類型的鑒定是深入認(rèn)識細(xì)胞功能的先決條件，而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序最基礎(chǔ)和最重要的應(yīng)用就是細(xì)胞類型的鑒定。17世紀(jì)羅伯特·胡克在顯微鏡下首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞以來，人們對細(xì)胞的表征描述及分類的準(zhǔn)確度已經(jīng)大大提高，但人們對細(xì)胞的分類多基于細(xì)胞形態(tài)、功能、位置及有限的分子標(biāo)記，而非基于系統(tǒng)性或綜合性的指標(biāo)，因此，到目前人們對細(xì)胞類型、狀態(tài)的描述及數(shù)量的認(rèn)識仍非常有限［2，15］。細(xì)胞類型決定于細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜［1，16］，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序通過獲得單個細(xì)胞基因表達(dá)譜，為細(xì)胞類型的鑒定提供了高精度系統(tǒng)性的方法。2020年，浙江大學(xué)郭國驥教授團(tuán)隊發(fā)表了利用微孔板單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對人體60種組織樣品和7種細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序研究結(jié)果，研究鑒定了人體100余種細(xì)胞大類和800余種細(xì)胞亞類，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于傳統(tǒng)認(rèn)為人體細(xì)胞約有300種細(xì)胞類型的數(shù)量［2，17-18］。哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)由數(shù)以萬計到數(shù)十億計的神經(jīng)元組成，并且具有多種功能，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，即使微升級的大腦組織擁有成千上萬種不同類型細(xì)胞，甚至傳統(tǒng)認(rèn)為同質(zhì)的細(xì)胞，其細(xì)胞也表現(xiàn)出很大的異質(zhì)性，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序為復(fù)雜神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元分類提供了強(qiáng)大工具［12，16］。

2016年10月人類細(xì)胞圖譜計劃啟動，其基本目標(biāo)是采用特定的分子表達(dá)譜來確定人體的所有細(xì)胞類型，并與經(jīng)典的細(xì)胞空間位置和形態(tài)的描述連接起來，最終建立綜合性的人類細(xì)胞參考圖譜，以促進(jìn)生命科學(xué)、疾病診斷、監(jiān)測以及疾病精準(zhǔn)治療的研究。細(xì)胞圖譜構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是細(xì)胞類型的鑒定，因此單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在人類細(xì)胞圖譜計劃中發(fā)揮著巨大的驅(qū)動作用。2020年，Han等［17］繪制了首個人類全細(xì)胞圖譜，圖譜涵蓋胚胎和成年期八大系統(tǒng)的細(xì)胞，包括100余種細(xì)胞大類和800余種細(xì)胞亞類。隨著科研人員的大量投入及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)不斷發(fā)展，目前與人和模式動物相關(guān)的多個細(xì)胞圖譜構(gòu)建出來。研究發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞圖譜，如人青春期睪丸發(fā)育的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞圖譜［19］、小鼠小腦胚胎8個發(fā)育階段及出生后4個時期繪制小鼠小腦發(fā)育細(xì)胞圖譜［20］；研究免疫器官的細(xì)胞圖譜，如人胸腺發(fā)育細(xì)胞圖譜［21］、斑馬魚淋巴細(xì)胞在組織穩(wěn)態(tài)期和免疫攻擊后淋巴細(xì)胞的綜合圖譜［22］、乳腺癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞圖譜［23］。2018年，Han等［24］利用微孔板單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對小鼠近50種器官組織的40余萬個細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)性的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建了首個哺乳動物的全細(xì)胞圖譜，研究涵蓋了哺乳動物體內(nèi)的各種主要細(xì)胞類型，并對每一種器官內(nèi)的組織細(xì)胞亞型、基質(zhì)細(xì)胞亞型、血管內(nèi)皮細(xì)胞亞群和免疫細(xì)胞亞型的基因表達(dá)譜進(jìn)行詳細(xì)描述。細(xì)胞圖譜的構(gòu)建提供了大量的細(xì)胞類型、標(biāo)記基因參考，對促進(jìn)細(xì)胞功能及精準(zhǔn)醫(yī)療研究具有重要意義。

2.2 擬時序分析

研究發(fā)現(xiàn)在同一時期捕獲的同一組細(xì)胞中往往同時含有處于不同分化階段的同類細(xì)胞，其主要表現(xiàn)為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的變化［25］，因此根據(jù)單個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的相近程度對單細(xì)胞變化軌跡進(jìn)行排序，以此模擬細(xì)胞動態(tài)變化過程，推導(dǎo)細(xì)胞可能存在的分化/演化軌跡，即擬時序分析（pseudotime analysis）［25-26］，通過分化軌跡中的基因表達(dá)模式的分析可以研究細(xì)胞命運決定的調(diào)控因子及細(xì)胞變化的驅(qū)動基因。機(jī)體發(fā)育的各個時期均存在細(xì)胞分化事件，胚胎期單個受精卵發(fā)育形成一個完整的生命體，細(xì)胞也由全能細(xì)胞逐漸分化為具有各種功能的終末細(xì)胞；機(jī)體出生后以及成年個體也存在祖細(xì)胞或干細(xì)胞分化的過程，因此單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)以研究多能細(xì)胞分化過程中其細(xì)胞動態(tài)變化及細(xì)胞命運決定及分化機(jī)制。

小鼠胚胎 E6.5-E8.5是原腸胚形成及早期器官形成的關(guān)鍵時期，Pijuan等［27］采集E6.5-E8.5 d的9個連續(xù)時間點的小鼠胚胎進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建了從多能細(xì)胞到所有主要細(xì)胞譜系的細(xì)胞分化圖，解析了多能細(xì)胞分化為各細(xì)胞譜系的發(fā)育軌跡和涉及的分子過程；小鼠胚胎E9.5- E13.5時期，胚胎從數(shù)十萬個細(xì)胞增殖到超過一千萬個細(xì)胞，并同時發(fā)育形成幾乎所有主要器官系統(tǒng)，Cao等［28］通過對61只小鼠E9.5- E13.5時期5個時間點～200萬胚胎細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，研究發(fā)現(xiàn)此時期的胚胎主要有38種細(xì)胞類型，包括10種主要的胚胎細(xì)胞發(fā)育分化軌跡和56種涵蓋所有主要器官系統(tǒng)的亞分化軌跡，研究還發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育軌跡趨向形成相同的細(xì)胞類型，如肌細(xì)胞由兩條發(fā)育軌跡會聚形成，興奮性神經(jīng)元以及抑制性神經(jīng)元由幾條發(fā)育軌跡會聚形成。胰島形成機(jī)制研究對治療糖尿病具有重要意義，對小鼠胚胎期胰腺細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，通過對內(nèi)分泌祖細(xì)胞分化軌跡分析，發(fā)現(xiàn)α細(xì)胞首先分化并形成胰島外層，其次β細(xì)胞分化以形成胰島內(nèi)層；通過分化過程中基因表達(dá)特征變化分析發(fā)現(xiàn)，α細(xì)胞的形成與基因Gcg、Gast、Etv1和Pou3f4有關(guān)，β細(xì)胞的形成與Lns1、Lns2、Lapp和 Pdx1 有關(guān)［26］。

2.3 細(xì)胞間互作關(guān)系分析

機(jī)體的正常運轉(zhuǎn)依賴于細(xì)胞間的有序協(xié)作［29］，傳統(tǒng)研究細(xì)胞互作的方法大都需要已知細(xì)胞類型，無法研究未知細(xì)胞類型間的互作，并且傳統(tǒng)的研究技術(shù)諸如同位素標(biāo)記、免疫熒光等存在檢測通量低，時間人力成本高等缺點，因此細(xì)胞間互作是生物學(xué)的研究難題。而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序由于單次實現(xiàn)對成千上萬個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，在單個細(xì)胞分辨率的基礎(chǔ)上，基于單個細(xì)胞的基因表達(dá)譜，為細(xì)胞間互作研究開啟了新篇章。細(xì)胞間互作關(guān)系利用單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，計算基因表達(dá)量矩陣，基于已有的配體-受體信息數(shù)據(jù)庫，量化配體-受體的互作強(qiáng)度來進(jìn)行統(tǒng)計預(yù)測［29］。胚胎發(fā)育過程中，滋養(yǎng)層與蛻膜的相互作用發(fā)生異常會導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生，Vento等［30］對妊娠前3個月胎盤以及和其相連的母體血液和蛻膜約70 000個細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，同時開發(fā)了配體-受體復(fù)合物數(shù)據(jù)庫和統(tǒng)計工具來預(yù)測不同細(xì)胞類型之間的細(xì)胞互作關(guān)系，研究通過確定細(xì)胞間的互作關(guān)系，可以防止有害的先天或適應(yīng)性的免疫反應(yīng)，這對胎盤形成及胎盤的正常發(fā)育至關(guān)重要。為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，腫瘤組織會形成一個包括正常組織的腫瘤微環(huán)境，這個微環(huán)境包括大量免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，為研究腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞間的相互作用，Davidson等［31］通過對腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，基于CellPhoneDB數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)統(tǒng)計腫瘤微環(huán)境細(xì)胞間互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間存在復(fù)雜的相互作用，如表達(dá)C3/CXCL12/CSF1的基質(zhì)細(xì)胞與C3AR1、CXCR4和CSFR1陽性的巨噬細(xì)胞之間存在基質(zhì)與免疫細(xì)胞的互作，瘤內(nèi)髓樣細(xì)胞群具有通過特定細(xì)胞因子受體信號如CXCL10、CCL22、CCL5吸引T細(xì)胞的能力，通過PDL1-PD1軸抑制T細(xì)胞的功能，并且還存在其他多種免疫抑制機(jī)制。

3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在動物上的應(yīng)用

目前，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序已有多個模式動物細(xì)胞圖譜構(gòu)建出來，如小鼠全細(xì)胞圖譜［24］、小鼠胚胎發(fā)育細(xì)胞圖譜［27-28］、小鼠內(nèi)皮細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜［32］，細(xì)胞圖譜的構(gòu)建一方面為細(xì)胞類型及分子標(biāo)記的鑒定提供參考數(shù)據(jù)庫以促進(jìn)細(xì)胞功能研究，另一方面也為與特定目標(biāo)細(xì)胞群或相關(guān)性狀形成的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。至今，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序解析性狀形成機(jī)制的研究主要應(yīng)用于疾病相關(guān)的模型動物，如通過果蠅大腦［33］、大鼠限制熱量攝入［34］、靈長類動物心肺［35］、靈長類動物卵巢［36］、小鼠［37］研究衰老機(jī)制，利用雞研究褪黑素的減肥機(jī)制［38］，通過斑馬魚端腦研究阿爾茲海默癥形成機(jī)制［39］，利用新生仔豬研究囊性纖維化肝膽疾病機(jī)制［40］，而利用該技術(shù)解析各物種性狀相關(guān)形成機(jī)制的研究相對較少，以下將主要介紹近年來利用該技術(shù)解析動物復(fù)雜性狀形成機(jī)制的相關(guān)研究，為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

3.1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在禽上的應(yīng)用

Estermann等［41］利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)﹄u胚性腺性別分化過程的研究揭示雞和小鼠之間性腺性別分化的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制存在根本差異，研究刷新了對性腺細(xì)胞譜系復(fù)雜性的認(rèn)識，鑒定到轉(zhuǎn)錄組不同的兩個支持細(xì)胞亞群，并從分化出的支持細(xì)胞前體衍生了類固醇生成譜系；與其他脊椎動物不同的是，雞胚支持細(xì)胞不是源自雞的腔上皮，而是源自間充質(zhì)來源的PAX2+ / OSR1+ /WNT4 + / DMRT1 +細(xì)胞群體；更為重要的是發(fā)現(xiàn)PAX2 +細(xì)胞從中腎遷移到性腺中。

雞的四肢發(fā)育一直是研究脊椎動物肢體發(fā)育的遺傳及分子機(jī)制的模式動物，為在細(xì)胞尺度上闡明雞四肢發(fā)育的細(xì)胞及分子機(jī)制，通過對雞四肢發(fā)育的3個關(guān)鍵時期的雞胚四肢進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，獲得其全基因組水平的轉(zhuǎn)錄譜的動態(tài)變化及相應(yīng)細(xì)胞的動態(tài)變化，鑒定到一系列不同細(xì)胞類型形成相關(guān)的標(biāo)記基因，從細(xì)胞維度解析了雞四肢發(fā)育的細(xì)胞及分子機(jī)制，也為后續(xù)研究提供了大量的研究雞四肢形成及多樣性的候選基因［42］。

3.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在豬上的應(yīng)用

由于與人具有相似的解剖、生理和基因組特征，豬是人類生物醫(yī)學(xué)研究非常好的模型［43］，早期胚胎發(fā)育機(jī)制的研究有助于推動豬作為生物醫(yī)學(xué)模式動物的探索工作。通過對豬早期胚胎各個時期的單卵裂球共106個樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，揭示了豬早期胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄譜隨著胚胎發(fā)育而發(fā)生的動態(tài)變化，確定合子基因組的激活發(fā)生在四時期到八時期；鑒定到73個桑椹胚中參與調(diào)控卵裂球異質(zhì)性的關(guān)鍵候選基因；最后通過與人、小鼠和牛基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)豬早期胚胎發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能與小型動物存在巨大差別［44］。

骨骼肌是復(fù)雜的異質(zhì)組織，約占體重的40%，其機(jī)械功能和代謝作用對機(jī)體健康至關(guān)重要［45］。Qiu等［43］通過對瘦肉型和脂肪型豬的肌肉進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，瘦肉型豬顯著的骨骼肌特征主要表現(xiàn)為對肌細(xì)胞生成的促進(jìn)及對脂肪細(xì)胞形成的抑制作用；細(xì)胞軌跡分析表明，肌祖細(xì)胞分化為衛(wèi)星干細(xì)胞，隨后分化為衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞，成肌細(xì)胞進(jìn)一步分化為肌細(xì)胞；與肥胖型豬相比，瘦肉型豬的肌系細(xì)胞更接近于肌源祖細(xì)胞的原始階段。

3.3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在綿、山羊上的應(yīng)用

精子形成過程中雄性生殖細(xì)胞與體細(xì)胞之間的相互作用對于雄性生殖活動是必需的。由于細(xì)胞異質(zhì)性使得很難在不同發(fā)育階段描述不同的細(xì)胞類型，Yang等［46］通過對成年綿羊睪丸的11 722個細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定到了所有已知的生殖細(xì)胞（包括早期精子細(xì)胞、晚期精子細(xì)胞、圓形精子、細(xì)長精子和精子）和體細(xì)胞，以及不常見的具有白細(xì)胞特征的體細(xì)胞。通過不同類型細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析鑒定到幾個不同階段生殖細(xì)胞特異的分子標(biāo)記，如 EZH2、SOX18、SCP2、PCNA和 PRKCD。 研 究首次全面的研究了精子發(fā)生過程中不同階段細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，促進(jìn)了對綿羊精子發(fā)生及精子發(fā)育的全面理解。

陜北白絨山羊是優(yōu)秀的絨山羊品種，其毛囊發(fā)育過程中分子調(diào)控機(jī)制的研究對毛絨性狀的選育具有重要的指導(dǎo)意義。葛偉通過對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序構(gòu)建了陜北白絨山羊毛囊發(fā)育主要轉(zhuǎn)錄圖譜；成功鑒定了絨山羊毛囊發(fā)育過程中的真皮細(xì)胞譜系、表皮細(xì)胞譜系、毛乳頭細(xì)胞等細(xì)胞類型；基于不同細(xì)胞類型之間的差異分析，發(fā)現(xiàn)了一系列細(xì)胞標(biāo)記基因，如真皮細(xì)胞的Lum、Col1a1和Postn，表皮細(xì)胞的Sox9、Krt14和Klf5l，毛乳頭細(xì)胞的Rspo2、Apod和Sox18等；根據(jù)細(xì)胞分化軌跡分析，對真皮細(xì)胞譜系的真皮聚集、毛乳頭細(xì)胞和表皮細(xì)胞譜系表皮細(xì)胞、毛干細(xì)胞和角化細(xì)胞的特化過程及細(xì)胞特化過程中基因表達(dá)特征進(jìn)行了動態(tài)分析。研究結(jié)果促進(jìn)了對絨山羊早期毛囊形態(tài)發(fā)生過程的認(rèn)識，為其育種研究提供了重要的理論參考［47］。

4 總結(jié)與展望

細(xì)胞是生命體的最基本功能單位，基因功能的實現(xiàn)需要依賴于細(xì)胞這一載體，普通轉(zhuǎn)錄組反映的是所有細(xì)胞基因表達(dá)的均值水平，不能確定基因與細(xì)胞的關(guān)系，也忽略了細(xì)胞的動態(tài)變化及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組變化，因此在解析復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制的過程中研究僅從基因及表型兩個維度開展，而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序為生物學(xué)機(jī)制的解析增加了細(xì)胞這一維度，由此對目標(biāo)性狀的研究可以定位到目標(biāo)細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞，分析目標(biāo)細(xì)胞的動態(tài)變化及細(xì)胞間的相互關(guān)系，解析性狀形成的細(xì)胞分子機(jī)制，可以預(yù)見其在動物復(fù)雜性狀遺傳機(jī)制的解析及疫病防治研究方面將具有廣闊的應(yīng)用前景，如肌內(nèi)脂肪細(xì)胞、皮下脂肪細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制解析將極大促進(jìn)優(yōu)質(zhì)畜禽肉產(chǎn)品的生產(chǎn)；重要畜禽傳染病對宿主細(xì)胞的侵襲及損傷機(jī)制研究是疫苗及藥物開發(fā)的重要理論依據(jù)；不同品種免疫細(xì)胞類型分析將是抗病育種的一個方向；毛囊及其微環(huán)境細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制研究將促進(jìn)毛色育種。另外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嵸|(zhì)同普通轉(zhuǎn)錄組測序一樣，都是反映轉(zhuǎn)錄組的變化，若同其他組學(xué)聯(lián)合分析將更全面解析生物學(xué)機(jī)制，如同基因組整合分析可以揭示基因變異對轉(zhuǎn)錄水平的影響，進(jìn)而解析性狀的遺傳機(jī)制［48］，同單細(xì)胞染色質(zhì)可及性（ATAC-seq）聯(lián)合分析可以構(gòu)建DNA到RNA再到表型的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鑒定與表型相關(guān)性強(qiáng)的核心調(diào)控因子［49-50］。