洪雅萍 陳雪津 王鵬杰 谷夢雅 高婷 葉乃興

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

茉莉花［Jasminum sambac（L.）Ait］屬于木犀科（Oleaceae）素馨屬植物，是一種典型的氣質(zhì)花，其香氣隨著花朵的盛開而逐漸釋放［1］。香氣是評價(jià)茉莉花品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，萜類化合物是其香氣的重要組成部分，根據(jù)萜類化合物中異戊二烯（isoprene，C5）的單元數(shù)量的不同，可分為單萜（monoterpene，C10）、倍半萜（sesquiterpene，C15）、二 萜（diterpene，C20）、 三 萜（triterpenes，C30）、四萜（tetraterpenes，C40）及多萜（polyterpenes）等［2］。植物花香中最常見的單萜和倍半萜是具有揮發(fā)性或香氣物質(zhì)的小分子化合物，如：檸檬烯、芳樟醇、月桂烯、石竹烯、法尼烯等［3］。萜類化合物是茉莉花香氣中占比最大的一類揮發(fā)性化合物，含有芳樟醇、法尼烯、橙花叔醇和石竹烯等［4］。

萜類合成酶（terpenoid synthase，TPS）是萜類化合物合成中下游的關(guān)鍵酶，萜類合成酶種類和功能的多樣性構(gòu)成了復(fù)雜的TPS基因家族及多樣的萜類化合物。萜類化合物可以通過位于細(xì)胞質(zhì)的甲羥戊酸（MVA）途徑和位于質(zhì)體的甲基赤蘚糖磷酸（MEP）途徑合成，萜類合成酶利用兩條途徑生成的異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）作為合成前體，從而合成多種多樣的萜類化合物［3］。根據(jù)萜類合成酶氨基酸序列40%同源性作為區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，可將其劃分為7個(gè)亞家族為TPS-a～TPS-g，被子植物中的萜類合成酶主要分布于TPS-a、TPS-b 及 TPS-g，TPS-c是最原始的亞家族［5］；TPS-g為最后發(fā)現(xiàn)的亞家族［6］；TPS-e及TPS-f合稱為 TPS-e/f。近年來，已在擬南芥［7］、番茄［8］、茶樹［9］、水稻［10］等物種中對TPS基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，在姜花［11］、茶樹［12］和艾草［13］等物種中克隆得到TPS基因，此外，前期課題組也通過克隆得到茉莉花TPS基因［14］。萜類合成酶在植物組織中存在特異表達(dá)，陳雪津等［15］在茶樹中篩選出16個(gè)萜類合成代表基因分別在頂芽和嫩葉中高表達(dá)，程甜等［16］在中?？Х萒PS家族中發(fā)現(xiàn)20個(gè)基因僅在特定組織中表達(dá)。植物TPS基因的表達(dá)會受到外源激素的影響，茉莉花JsNES/LINS基因會受多種外源激素不同程度的誘導(dǎo)［17］；孟崔穎［18］使用5種不同的外源激素處理丹參植株，發(fā)現(xiàn)其中SA會使4個(gè)丹參TPS基因顯著下調(diào)表達(dá)；姜黃C-HMGR與C-FPS基因的表達(dá)量均可被IAA、ABA、SA、GA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)［19］。迄今為止，對茉莉花TPS基因家族系統(tǒng)的鑒定和表達(dá)模式分析未見報(bào)道。

為了更加全面地了解茉莉花TPS基因家族的信息，本研究利用前期課題組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中篩選出茉莉花TPS基因序列，利用生物信息學(xué)方法，對茉莉花TPS基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定及分析；采用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)，探究該家族基因在茉莉花不同組織中及不同激素處理下的表達(dá)模式。為今后探索茉莉花TPS基因家族的功能及外源激素脅迫下的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雙瓣茉莉花取自福建農(nóng)林大學(xué)茉莉花種質(zhì)資源圃。在自然生長狀態(tài)下，取茉莉花的根、莖、葉、花蕾和花瓣等不同組織，作為茉莉花TPS家族基因組織表達(dá)分析的材料。采用100 μmol/L的IAA（生長素）、30 μmol/L 的 GA（赤霉素）、1 000 μmol/L 的SA（水楊酸）和100 μmol/L的 MeJA（茉莉酸甲酯）等不同激素分別處理茉莉花植株，具體濃度設(shè)置參照前人［17，20］的方法 ；取處理 0、2、4、6、9和 12 h后的茉莉花瓣，作為茉莉花TPS家族對不同激素表達(dá)響應(yīng)研究的材料。以上材料設(shè)3次重復(fù)，用錫箔紙包裹、液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱用于后續(xù)的RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 茉莉花TPS基因家族成員的鑒定 本研究基于課題組前期獲得的茉莉花轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)［21］，對茉莉花中的萜類合成酶基因進(jìn)行鑒定。從Pfam（http://pfam.xfam.org）數(shù)據(jù)庫下載含有TPS基因家族的特征結(jié)構(gòu)域PF01397和PF03936的隱馬爾可夫模型，以此作為種子序列進(jìn)行比對，并利用HMMER軟件及 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）網(wǎng)站鑒定，確認(rèn)候選序列是否具有完整的TPS特征結(jié)構(gòu)域，即Terpene_synthase（PF01397）和Terpene_synthase_C（PF03936），經(jīng)校對后留下同時(shí)具有兩個(gè)特征結(jié)構(gòu)域的序列。在ExPASy（https://www.expasy.org）網(wǎng)站對茉莉花TPS蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析。利用在線網(wǎng)站W(wǎng)OLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站對茉莉花TPS基因進(jìn)行功能預(yù)測。

1.2.2 茉莉花TPS基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及序列比對分析 根據(jù)擬南芥、番茄和茶樹關(guān)于TPS基因的相關(guān)文獻(xiàn)［7-9］整理基因登錄號，隨后從TAIR（https://www.arabidopsis.org/）、SOL（http://solgenomics.net/organism/Solanum_lycopersicum/genome）和TPIA（http://tpia.teaplant.org/）數(shù)據(jù)庫下載對應(yīng)序列，均保留原文獻(xiàn)命名方式；從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫下載油橄欖和桂花的TPS基因家族成員序列。將擬南芥、番茄、茶樹、油橄欖和桂花的蛋白序列與茉莉花TPS蛋白序列共同使用MEGA7.0軟件，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)置為1 000［22］。為預(yù)測茉莉花TPS家族結(jié)構(gòu)，采用DNAMAN7.0軟件和Web Logo（http://weblogo.berkeley. edu/logo.cgi）在線軟件分析茉莉花TPS家族的保守序列。

1.2.3 茉莉花TPS保守基序分析 茉莉花TPS蛋白序列利用MEME在線軟件（http://meme-suit.org/tools/meme）對茉莉花TPS蛋白序列進(jìn)行保守基序預(yù)測，基序最大的數(shù)目設(shè)置為13，其余為默認(rèn)［23］。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 分別提取上述處理的茉莉花瓣的總RNA，RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板。茉莉花Actin基因作為內(nèi)參，以茉莉花TPS家族基因的CDS序列在Primer3 Plus在線網(wǎng)站（http://www.primer3plus.com/）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。通過Bio-Rad的CFX96 Touch熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系使用Transstart? Tip Green qPCR superMix試劑盒的方法，程序?yàn)?4℃，30 s；94℃，5 s；60℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。利用2-△△Ct算法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。不同組織的相對表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理并使用TBtools軟件制作熱圖，使用SPSS17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05），然后在Prism8軟件中制作柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 JsTPS基因家族的鑒定及序列分析

本研究基于課題組前期獲得的茉莉花轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，于Pfam數(shù)據(jù)庫中下載PF01397和PF03936的隱馬爾可夫模型作為種子序列進(jìn)行比對，并通過HAMMER和SMART網(wǎng)站進(jìn)行鑒定，最終獲得8條同時(shí)具有PF01397和PF03936結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，分別命名為JsTPS1-JsTPS8（表2）。通過蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，JsTPS家族成員的蛋白長度在163-844個(gè)氨基酸范圍內(nèi)；分子量在19 103.6-96 887.4 kD之間；等電點(diǎn)在5.18-6.09之間，為酸性蛋白；茉莉花TPS成員平均親水性均為負(fù)值，屬于疏水性蛋白；亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，JsTPS1、JsTPS3、JsTPS4和JsTPS6定位于葉綠體，JsTPS2、JsTPS5和JsTPS7定位于細(xì)胞質(zhì)，JsTPS8未預(yù)測出。在NCBI對茉莉花JsTPS基因進(jìn)行手動功能注釋，依此推測JsTPS1、JsTPS5和JsTPS7分別是大根香葉烯D合酶、α-法尼烯合酶和（E，E）-香葉基芳樟醇合酶。

表2 茉莉花JsTPS基因家族的序列特征Table 2 Sequence characteristics of JsTPS genes in J. sambac

2.2 JsTPS家族系統(tǒng)進(jìn)化樹及序列比對分析

為了探索茉莉花TPS家族的分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將茉莉花與擬南芥、番茄、茶樹、油橄欖和桂花的TPS家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。本研究中TPS家族可分為5個(gè)亞家族。茉莉花TPS家族 分 布 在 TPS-a、TPS-b、TPS-e/f和 TPS-g這 4個(gè)亞家族，TPS-c亞家族中不含茉莉花TPS家族成員。其中TPS-b亞家族是茉莉花TPS家族最大的亞家 族， 包 含 JsTPS2、JsTPS3、JsTPS4和 JsTPS5；TPS-a、TPS-e/f和 TPS-g分別包含 JsTPS1、JsTPS7和JsTPS6。

圖1 茉莉花與其他植物TPS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the TPS proteins in the J. sambac and other plants

對茉莉花TPS蛋白序列的進(jìn)行序列比對及保守性logo分析（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅JsTPS1、JsTPS2和JsTPS5含有完整的位于N端的雙精氨酸殘基RRX8W序 列，JsTPS3、JsTPS4、JsTPS6和JsTPS7中RRX8W序列發(fā)生了不同程度的變化，JsTPS8中沒有發(fā)現(xiàn)該序列，說明RRX8W序列的保守性較差。RXR序列在JsTPS6和JsTPS7中發(fā)生了變化，表明其保守性也不高。除JsTPS8外，其余茉莉花TPS家族成員中均發(fā)現(xiàn)位于C端的富含天冬氨酸殘基的DDXXD和NSE/DTE保守序列，說明這兩個(gè)序列的保守性較高。

圖2 茉莉花TPS中RRX8W、RXR、DDXXD及NSE/DTE保守序列的比對Fig. 2 Alignment of the RRX8W，RXR，DDXXD and NSE/DTE conserved sequence among J. sambac TPS

2.3 JsTPS家族的保守基序分析

使用MEME在線網(wǎng)站對茉莉花TPS蛋白進(jìn)行保守基序預(yù)測，檢測到13個(gè)保守基序（圖3）。TPS-b中的JsTPS2、JsTPS3、JsTPS4和JsTPS5包含全部基序，但JsTPS8只含基序2、7、8和9；TPS-a中的JsTPS1僅缺少基序12；TPS-g中的JsTPS6僅缺少基序4；TPS-e/f中JsTPS7缺少5個(gè)基序，分別是基序2、3、5、10和12。同時(shí)發(fā)現(xiàn)基序7、8、9在茉莉花TPS家族中高度保守，存在于所有茉莉花TPS家族成員中，提示這3個(gè)基序在茉莉花TPS家族中具有重要作用。此外，亞家族中的保守基序不盡相同，說明茉莉花TPS家族成員在進(jìn)化和功能上的差異可能與亞家族的差異有關(guān)。

圖3 茉莉花TPS家族保守基序分析Fig. 3 Conservative motif analysis of TPS family in J. sambac

2.4 JsTPS基因在不同組織下的表達(dá)模式

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測茉莉花植株的根、莖、葉、花蕾及成熟花等不同組織中茉莉花TPS家族成員的相對表達(dá)量（圖4），結(jié)果表明，JsTPS4和JsTPS8不表達(dá)，其余6個(gè)茉莉花TPS家族成員均檢測到表達(dá)。茉莉花TPS家族中JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5和JsTPS7在花瓣中表達(dá)均高于其他組織，JsTPS6在花蕾中表達(dá)較高，表明茉莉花TPS可能在茉莉花的開放時(shí)具有重要作用?？傮w上，茉莉花TPS家族基因在茉莉花花瓣上表達(dá)量極高，在根、莖、葉和花蕾中低表達(dá)。

圖4 茉莉花JsTPS家族在不同組織的表達(dá)譜Fig.4 Expression patterns of J. sambac JsTPS family in different tissues

2.5 JsTPS基因家族在4種激素處理下的表達(dá)模式

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別測定噴施IAA、GA、SA和MeJA后不同時(shí)間（0、2、4、6、9和12 h）茉莉花TPS家族成員的相對表達(dá)量（圖5）。結(jié)果表明，JsTPS4和JsTPS8不表達(dá)，其余6個(gè)茉莉花TPS成員均檢測到表達(dá)。在IAA處理中，6個(gè)茉莉花TPS基因均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，峰值分別約為0 h的5、7、84、50、3和181倍；其中JsTPS7的表達(dá)量最高并于6 h出現(xiàn)峰值，與JsTPS1、JsTPS5、JsTPS6和JsTPS7都呈先上升后下降趨勢；此外，JsTPS2無明顯表達(dá)趨勢，JsTPS3呈上調(diào)表達(dá)；說明IAA對茉莉花TPS的誘導(dǎo)作用不同。在GA處理下，JsTPS3的表達(dá)量最大，于12 h達(dá)到峰值約為0 h的106倍；JsTPS1和JsTPS2的表達(dá)量呈下調(diào)趨勢，表明GA可能會抑制它們的表達(dá)。在SA處理下，JsTPS1、JsTPS2及JsTPS6的表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，說明這些基因可能受到SA的脅迫作用；JsTPS3表達(dá)量最高，于9 h時(shí)達(dá)到峰值約為0 h的9倍。在MeJA處理下，6個(gè)茉莉花TPS基因均可被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，最大值出現(xiàn)在4-9 h間，峰值分別約為0 h的11、52、35、190、18及74倍，其中JsTPS5基因的表達(dá)量最高。總體上，MeJA可顯著誘導(dǎo)茉莉花TPS家族成員的表達(dá)，IAA次之，GA和SA會抑制部分茉莉花TPS基因的表達(dá)。

圖5 茉莉花JsTPS在不同激素處理下的表達(dá)模式Fig.5 Expression analysis of JsTPS under different treatments of IAA，GA，SA and MeJA

3 討論

萜類化合物作為植物香氣中重要的揮發(fā)性化合物之一，距今已發(fā)現(xiàn)5萬多種萜類化合物［1］，萜類合成酶是參與萜類化合物合成的關(guān)鍵酶。本研究通過茉莉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并利用生物信息學(xué)方法，對茉莉花萜類合成酶基因進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定，得到8條同時(shí)具有Terpene_synthase和Terpene_synthase_C特征結(jié)構(gòu)域的茉莉花TPS基因。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)茉莉花TPS家族成員可分為4個(gè)亞家族，分別為 TPS-a、TPS-b、TPS-e/f及 TPS-g，與毛竹 TPS家族的分類結(jié)果一致［24］；TPS-a亞家族中茶樹TPS基因均預(yù)測是大根香葉烯D合酶［9］，JsTPS1和它們處在一個(gè)亞家族，推測同為大根香葉烯D合酶，且與在NCBI上的預(yù)測結(jié)果一致。此外，番茄的TPS37和TPS39的功能已知，編碼產(chǎn)物均為芳樟醇或橙花叔醇［8］，JsTPS6與這2個(gè)基因同源性高，據(jù)此推測JsTPS6的功能與TPS37或TPS39的功能相似。序列比對分析發(fā)現(xiàn)茉莉花TPS家族含有4段富有功能的保守序列，RRX8W和RXR序列的保守性較差，DDXXD及NSE/DTE序列的保守性較高；其中雙精氨酸殘基RRX8W序列的缺失會導(dǎo)致單萜合酶無法產(chǎn)生環(huán)狀單帖產(chǎn)物［6］；DDXXD序列被認(rèn)為是結(jié)合二價(jià)金屬離子的活性位點(diǎn)，在引導(dǎo)二價(jià)異戊二烯基二磷酸底物的催化中起重要作用［25］。

植物的萜類合成酶基因在組織中存在特異性表達(dá)，例如毛竹TPS基因家族中PeTPS2的表達(dá)量在早、晚花期中最高，PeTPS1的表達(dá)量在葉中最高［24］；棉花中GhTPS1和GhTPS3在果皮中的表達(dá)量最高，在子葉中最低，在花瓣中卻沒有檢測到［26］。俞瀅等［14］利用熒光定量 PCR 技術(shù)檢測JsTPS在茉莉花開放過程中的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)在花朵未開放時(shí)即花蕾時(shí)期JsTPS表達(dá)量最低，在半開放時(shí)最高，并推測JsTPS基因的表達(dá)量與茉莉花香氣形成有關(guān)。本研究中 JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5及 JsTPS7在花瓣中高表達(dá)，總體上在根、莖、葉和花蕾中低表達(dá)，與俞瀅等［14］的結(jié)果大體一致，推測JsTPS家族基因?qū)岳蚧ㄏ銡獾男纬捎兄匾饔?，同時(shí)也為茉莉花為“氣質(zhì)花”提供基因角度上的支持。

生長素、赤霉素、水楊酸及茉莉酸甲酯等外源激素可單獨(dú)或通過協(xié)同作用參與調(diào)控植物的生長發(fā)育過程［27］，茉莉酸甲酯還可以影響植物芳香化合物的合成［28-30］。崔孟穎［18］使用適宜濃度的5種外源激素處理丹參4 h，發(fā)現(xiàn)不同激素處理對4個(gè)丹參TPS基因誘導(dǎo)程度不同，ABA可以使YL-1的表達(dá)量上調(diào)，ETH和ABA會使YL-4、YL-5及YL-6上調(diào)表達(dá)，SA使YL-4、YL-5及YL-6下調(diào)表達(dá)。陳笛等［17］使用不同激素處理茉莉花植株，發(fā)現(xiàn)IAA、GA、MeJA和ABA等激素可不同程度誘導(dǎo)JsNEL/LINS基因的表達(dá)。本研究中利用IAA、GA、SA及MeJA等不同激素處理茉莉花植株，發(fā)現(xiàn)4種激素均可誘導(dǎo) JsTPS1、JsTPS2、JsTPS3、JsTPS5、JsTPS6和JsTPS7不同程度的表達(dá)，誘導(dǎo)作用從大到小分別是 MeJA＞IAA＞GA＞SA，GA和 SA會抑制部分茉莉花TPS基因表達(dá)，IAA和MeJA可顯著誘導(dǎo)茉莉花TPS基因的上調(diào)表達(dá)，表明外源激素可誘導(dǎo)茉莉花TPS基因的表達(dá)，從而催化萜類化合物的合成。此外，JsTPS3在各激素處理下表達(dá)量都較高，暗示著JsTPS3可能可響應(yīng)大部分激素的誘導(dǎo)；茉莉酸甲酯會顯著誘導(dǎo)植物中的萜類化合物的產(chǎn)生和積累，王力［31］使用茉莉酸甲酯處理茶葉鮮葉，發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯會使茶鮮葉中萜類化合物相對含量的提高，如α-畢澄茄油烯、石竹烯和α-法尼烯等香氣成分。本研究中6個(gè)茉莉花TPS基因均能被MeJA顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表明MeJA在誘導(dǎo)茉莉花TPS家族成員合成萜類化合物中作用顯著。

4 結(jié)論

本研究基于茉莉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對茉莉花TPS基因進(jìn)行鑒定，得到8條同時(shí)具有兩個(gè)特征結(jié)構(gòu)域的茉莉花TPS基因，茉莉花TPS家族基因主要在花瓣中高表達(dá)且與茉莉花香氣形成關(guān)系密切，還能夠被IAA和MeJA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，GA和SA可能會抑制部分茉莉花TPS基因的表達(dá)。