張斌 楊昕霞

（湖南科技學院 湖南省銀杏工程技術研究中心，永州 425199）

作為我國主要作物之一，水稻在糧食生產中占據著重要位置。但是，我國鹽堿地總面積達9 913萬hm2，約占全國土地面積的1/10［1］。鹽脅迫會使水稻受到滲透脅迫、離子毒害、氧化脅迫和營養(yǎng)脅迫，影響水稻生長發(fā)育，嚴重時甚至會導致植株死亡［2-3］，因此，有關水稻耐鹽機制的研究備受關注。面對鹽脅迫，植物在分子水平、生理代謝和形態(tài)結構上進化出復雜的調控機制，如調節(jié)關鍵基因的表達來改善代謝水平和形態(tài)結構［4］。轉錄因子（transcription factor，TF）通過激活或抑制靶標基因的轉錄表達，調控一系列的胞內信號轉導過程，在應激反應中起著重要的調控作用［5］。根據國家水稻數據中心網站（https://www.ricedata.cn）公布的數據，發(fā)現有大量功能基因和調節(jié)基因參與脅迫應答，然而利用RNASeq分析響應鹽脅迫相關TF的報到卻很少。因此，本研究利用鹽脅迫下水稻轉錄組數據分析與之相關的TF基因，通過蛋白互作篩選出重要模塊基因進行功能富集分析鑒定出關鍵TF基因，并進行qRTPCR驗證，為后續(xù)進行水稻遺傳改良提供了候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻鹽脅迫的轉錄組數據從（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA530826/）下載。水稻種子為日本晴（Nipponbare）。

1.2 方法

1.2.1 差異表達基因的篩選 利用hisat2軟件建立索引以及比對到參考基因組，通過stringtie軟件進行轉錄本組裝、合并和定量，篩選出網站（http://planttfdb.gao-lab.org/）中所有TF基因所對應的表達數據，通過DESeq2軟件進行差異分析。以P值≤0.01且|log2foldChange|≥2為條件篩選鹽脅迫1 h（0 h vs 1 h）、3 h（0 h vs 3 h）和6 h（0 h vs 6 h）時間段的差異表達TF基因，利用ggplot2軟件繪制差異表達TF基因的樣品間PCA圖，樣品相關性熱圖、火山圖和韋恩圖。

1.2.2 蛋白互作網絡構建、重要模塊篩選和關鍵TF鑒定 利用數據庫（http://string-db.org），設置參數interaction score≥0.15，構建蛋白互作網絡；利用MCODE插件，篩選核心模塊；核心模塊中的差異表達TF基因為關鍵TF基因。

1.2.3 重要模塊中基因的富集分析 設置FDR值≤0.05，利用在線軟件（http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/）對重要模塊中的基因進行GO富集分析；設置P值≤0.05，利用在線軟件（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/）對重要模塊中的基因進行KEGG富集分析，利用ggplot2插件進行繪圖。

1.2.4 qRT-PCR檢測基因表達 水稻種子發(fā)芽后培養(yǎng)14 d（28℃，14 h白天/10 h黑夜），將幼苗轉移到含200 mmol/L NaCl的1/10的MS培養(yǎng)基中，0 h、1 h、3 h和6 h采集莖葉組織，液氮中速凍，-80℃下保存。利用TRIzol法提取總RNA，添加Dnase I去除DNA污染，反轉錄試劑盒SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix（Thermo）合成 cDNA。利用ABI7500定量PCR儀進行qRT-PCR檢測，2-ΔΔCT法計算基因相對表達水平。反應程序：94℃預變性32 min；94℃變性 10 s，60℃退火 10 s，72℃延伸10 s，40 個循環(huán) ；總體系 20 μL ：10 μL SYBR Green Mix（Thermo），8 μL RNAase-free水，0.5 μL 引物，1.0 μL模板。Os10g0510000為內參，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR反應引物序列和基因注釋信息Table 1 Primer sequence for qRT-PCR and gene annotation information

2 結果

2.1 樣本關系分析

從圖1中可知，相同處理測序樣品間距離較近，不同處理及品種間樣品基因表達水平存在明顯差異，距離較遠；根據重復性分析結果，相同處理樣品間測序樣品間重復性高，系統(tǒng)誤差較小，結果可信度高。

圖1 測序樣品關系Fig. 1 Relationship among sequencing samples

2.2 差異表達基因篩選

鹽脅迫1 h檢測到125個差異表達TF基因，85個上調，40個下調（圖2-A）；3 h檢測到162個，88個上調，74個下調（圖2-B）；6 h 檢測到172個，88個上調，84個下調（圖2-C）。鹽脅迫1、3和6 h共有26個相同差異表達TF基因（表2），分別有49個、75個和89個獨特差異表達TF基因（圖2-D）。

表2 26個相同差異表達TF基因在STRING中的注釋Table 2 Notes of 26 identical differentially expressed TF genes in STRING

圖2 鹽脅迫差異表達基因和相同差異表達基因篩選圖Fig. 2 Screening of differentially expressed genes(DEGs)and identifical DEGs under salt stress

2.3 基因互作網絡與關鍵基因篩選

26個相同差異表達TF基因主要有：ERF、C2H2、MYB、NAC和HSF家族，其中ERF家族數量最多，占總數的26.9%（圖3-A）。利用在線數據庫分析26個差異表達TF的蛋白互作關系，篩選出含有14個基因的重要模塊（圖3-B）；在重要模塊中，有 6個 HSP70、3個 HSP90、5個 HSF基 因， 其中Os03g0745000和Os06g0553100為關鍵TF基因（圖3-C）。

圖3 相同差異表達基因分類、重要模塊篩選和關鍵TF篩選圖Fig. 3 Classification of the identical differentially expressed genes，important module and key TF screening

2.4 重要模塊基因GO和KEGG富集分析

核心模塊中14個基因的GO分析顯示分子功能主要富集在ATP結合、細胞組分主要富集在細胞質膜囊泡組分上和生物學過程主要富集在對脅迫的反應上（圖4-A-C）。KEGG分析顯示14個基因主要富集在內質網蛋白質加工和內吞作用的通路上（圖4-D）。

圖4 重要模塊基因GO和KEGG富集圖Fig. 4 GO and KEGG enrichment map of important module genes

2.5 TF基因差異表達驗證

為驗證測序結果的可靠性，在水稻幼苗經鹽脅迫處理1 h后，選取2個已報道鹽脅迫相關基因Os03g0322900和Os11g0454300進行qRT-PCR檢測，驗證鹽脅迫處理是否適當；并對Os03g0745000和Os06g05531005兩個關鍵TF基因進行驗證。結果顯示，在鹽脅迫后Os03g0322900和Os11g0454300表達量顯著升高（圖5-A），表明模擬鹽旱脅迫處理適當。Os06g0553100和Os03g0745000兩個關鍵TF基因表達上調與測序結果一致（圖5-B），進一步說明了通過轉錄組鑒定水稻中響應鹽脅迫關鍵TF基因的可靠性。

圖5 鹽脅迫相關基因表達驗證Fig. 5 Expression verification of salt stress related genes

2.6 鹽脅迫不同時段相關基因的表達檢測

驗證測序可靠后，檢測了重要模塊中4個基因在不同鹽脅迫時間點（0、1、3和6 h）的表達水平，相關注釋信息（表2）。從圖6可以看出，隨著鹽脅迫時間的延長，兩個關鍵轉錄因子和熱激蛋白的表達量都呈現先上升后下降的表達模式。

圖6 鹽脅迫不同時段相關基因的表達檢測Fig. 6 Expression detection of related genes at different time points of salt stress

3 討論

TF通過激活或抑制靶標基因的轉錄表達，在植物應對逆境脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。目前已鑒定與脅迫相關TF基因家族有NAC、MYB、WRKY、bZIP和ERF/DREB等［8］。本研究對水稻鹽脅迫1、3和6 h三個時間點的轉錄組原始數據進行分析，共有26個相同差異表達TF基因，主要為ERF、C2H2和HSF等家族基因，說明這些TF在參與響應鹽脅迫過程中發(fā)揮一定的功能。鹽脅迫可以引起蛋白質的錯誤折疊和組裝，從內質網中輸出錯誤折疊蛋白質到溶酶體中降解的過程中，需要消耗ATP。研究結果顯示重要模塊中的14個基因GO分析主要富集在ATP結合、對脅迫的反應和細胞質膜囊泡組上；KEGG分析顯示主要富集在內質網蛋白質加工和內吞作用等途徑上。HSP70是蛋白質質量控制系統(tǒng)組件之一，在內質網應激中具有重要作用［9］。HSP70的缺失賦予酵母鎘耐受性，與HSP101和sHSP共同作用促進細胞毒性聚集物的去除［10］；可以通過影響HsfAs和HSP101的活性負調控擬南芥的耐熱性［11］；擬南芥過表達OsHSP增加了耐熱性和耐鹽性［12］。Leng等［13］認為 HSP70參與擬南芥的發(fā)育調控和非生物脅迫反應。本研究重要模塊中14個基因含有6個HSP70基因。熱激轉錄因子（heat shock transcriptional factor，Hsf）通過調控一系列熱激蛋白基因的轉錄和表達，參與生物與非生物脅迫的反應過程。本研究鑒定Os03g0745000和Os06g0553100同屬Hsf基因。Os03g0745000受多種脅迫的誘導，與OsHsfB4b相互作用［14-16］；在熱激反應中OsHsfB4b參與水稻細胞質OsClpB基因的轉錄調控［17］；同一家族成員OsHsfA2e在擬南芥中過度表達可以增強耐熱性和耐鹽性［18］。本研究表明，隨著鹽脅迫時間的延長，兩個關鍵Hsf和兩個HSP70基因的表達量呈現出先上升后下降的趨勢，因此，我們推測這兩個Hsf可能通過調控熱激蛋白基因的轉錄表達，影響蛋白質折疊和組裝，從而在水稻響應鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用，但是需要進一步研究來驗證。

4 結論

水稻在鹽脅迫1 h、3 h和6 h三個時間點共有26個相同的差異表達TF；通過蛋白互作篩選出14個基因的核心模塊；GO分析14個基因顯著富集在ATP結合、對脅迫的反應和細胞質膜囊泡組上；KEGG分析顯著富集在內質網蛋白質加工和內吞作用途徑上。鑒定出Os03g0745000和Os06g0553100兩個關鍵Hsf，qRT-PCR檢測結果也進一步驗證了其可靠性。