張銘，馬麗穎

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

百效丸由玄參、巴豆霜、厚樸、川貝母、柴胡等12味中藥材加工而成，為棕紅色的大蜜丸，氣香、味涼、微辛，具有消積理滯、鎮(zhèn)驚化痰的功效，臨床用于寒熱凝結(jié)、停食宿水、腹疼腹脹、痰喘氣促、慢驚風(fēng)癥等。百效丸收載于《中藥成方制劑第二冊(cè)》，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)百效丸中任何成分進(jìn)行定量測(cè)定[1]，也未檢索到對(duì)該制劑進(jìn)行多組分測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道，為全面控制本品質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜(HPLC)波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定處方中玄參[2]主成分哈巴苷、安格洛苷C和哈巴俄苷，巴豆霜主成分巴豆苷，厚樸[2]主成分和厚樸酚[3]、厚樸酚的含量，為提高百效丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(型號(hào)：Agilent 1100系列，生產(chǎn)廠家：美國(guó)安捷倫公司)； 電子天平(型號(hào)：AXS205DU型，生產(chǎn)廠家：梅特勒-托利多儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(型號(hào)：KQ3200DB型，生產(chǎn)廠家：昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥與試劑百效丸來(lái)源于天津達(dá)仁堂京萬(wàn)紅藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為162156、162175、162182；乙腈、甲醇為色譜純，其它試劑為分析純；哈巴苷對(duì)照品(111729-201506)、哈巴俄苷對(duì)照品(111730-201508)、巴豆苷對(duì)照品(111856-201001)、和厚樸酚對(duì)照品(110730-201614)、厚樸酚對(duì)照品(110729-201513)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；安格洛苷C對(duì)照品(115909-22-3)購(gòu)于上海寶曼生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件采用Venusil MP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A：乙腈-甲醇(1∶4)，流動(dòng)相B：0.2%磷酸溶液，梯度洗脫(0～20 min，48.0%A；20～26 min，48.0%A→54.0%A；26～35 min，54.0%A→60.0%A；35～49 min，60.0%A→75.0%A；49～55 min，75.0%A→48.0%A)；0～20 min時(shí)在210 nm[4-7]波長(zhǎng)下檢測(cè)哈巴苷，20～26 min在280 nm[4,6,8-9]波長(zhǎng)下檢測(cè)安格洛苷C和哈巴俄苷；26～55 min在294 nm[10-11]波長(zhǎng)下檢測(cè)巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流速：0.9 mL·min-1。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取對(duì)照品哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚各適量，用50%甲醇分別制成每毫升中含哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚各為0.796、0.530、0.490、1.382、1.058、1.874 mg的單成分對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再分別依次量取2.5、1.0、1.0、2.5、2.5、2.5 mL，置同一量瓶中(50 mL)，用50%甲醇稀釋制成百效丸檢測(cè)用混合對(duì)照品溶液。

2.2.2百效丸供試品溶液 取百效丸適量，剪碎，稱(chēng)取4.0 g，精密稱(chēng)定，將其置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱(chēng)定其重量，KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器超聲提取30 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得百效丸供試品溶液。

2.2.3陰性樣品溶液 按百效丸的處方和工藝過(guò)程，分別制備不含玄參、巴豆霜、厚樸(姜制)的陰性樣品，再按“2.2.2” 項(xiàng)下的方法制成玄參陰性樣品溶液、巴豆霜陰性樣品溶液、厚樸陰性樣品溶液。

2.3專(zhuān)屬性試驗(yàn)精密吸取“2.2.1～2.2.3”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、百效丸供試品溶液、玄參陰性樣品溶液、巴豆霜陰性樣品溶液和厚樸陰性樣品溶液各適量，按上述方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果陰性樣品色譜圖中，在對(duì)照品混合液所顯示的哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚對(duì)應(yīng)的位置無(wú)干擾，各峰之間的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)均大于3 500，色譜圖詳見(jiàn)圖1。

注：1為哈巴苷,2為安格洛苷C,3為哈巴俄苷,4為巴豆苷,5為和厚樸酚,6為厚樸酚

2.4線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別用50%甲醇稀釋至20 mL，振搖均勻，制成20倍濃度差的6種不同濃度的混合對(duì)照品溶液，依法測(cè)定，以哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚及厚樸酚的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，測(cè)得的哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，如表1所示。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱(chēng)取對(duì)照品哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚及厚樸酚各適量，用50%甲醇分別溶解并稀釋制成含哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚及厚樸酚為0.916、0.323、0.281、0.807、0.719、0.596 g·mL-1單一成分對(duì)照品溶液，備用。

取百效丸(批號(hào)162156)6份，剪碎，每份約2.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，依次精密加入上述備用對(duì)照品溶液1.0、1.0、1.0、2.0、2.0、4.0 mL，再按“2.2.2”的方法制備加樣回收樣品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚及厚樸酚的回收率及相應(yīng)的RSD，結(jié)果它們的回收率與相應(yīng)的RSD見(jiàn)表2～4。

表2 哈巴苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 安格洛苷C加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取百效丸樣品(批號(hào)162156)，按“2.2.2”項(xiàng)下制備方法制備百效丸供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件及檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚的含量，結(jié)果所測(cè)6種組分含量的RSD依次為0.42%、1.51%、0.76%、1.13%、1.24%和0.90%。

2.7精密度試驗(yàn)取“ 2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定各成分峰面積，結(jié)果哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚峰面積的RSD (n=6)分別為1.16%、0.25%、1.29%、0.93%、1.10%和0.82%。

2.8供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份百效丸供試品溶液，于室溫下0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h進(jìn)樣測(cè)定哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚的峰面積值，結(jié)果室溫下10 h內(nèi)穩(wěn)定，所測(cè)6種組分峰面積的RSD分別為1.18%、0.74%、1.30%、0.96%、1.05%和0.54%。

2.9樣品測(cè)定取三批百效丸樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下制備方法制備百效丸供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 含量測(cè)定結(jié)果/mg·g-1

3 討論

3.1流動(dòng)相的選擇在試驗(yàn)過(guò)程中，作者首先考察了甲醇-水[12-13]、乙腈-水[4]、乙腈-甲醇(1∶4)與水[14-16]流動(dòng)相體系，以色譜峰基線平穩(wěn)情況和所測(cè)各成分的峰形、分離效果為指標(biāo)，優(yōu)選最佳的流動(dòng)相體系。結(jié)果顯示乙腈-甲醇(1∶4)與水流動(dòng)相體系優(yōu)于甲醇-水流動(dòng)相體系和乙腈-水流動(dòng)相體系，但個(gè)別色譜峰峰形和分離效果還欠佳。在此基礎(chǔ)上，作者又考察了乙腈-甲醇(1∶4)與1.0%冰醋酸溶液[5]、乙腈-甲醇(1∶4)與2.0%冰醋酸溶液[11]、乙腈-甲醇(1∶4)與0.2%磷酸溶液[17]、乙腈-甲醇(1∶4)與0.5%磷酸溶液[10]流動(dòng)相體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示以乙腈-甲醇(1∶4)與0.2%磷酸溶液作為流動(dòng)相按照文中的梯度洗脫比例進(jìn)行洗脫時(shí)，所測(cè)各成分哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚峰形較好，各色譜峰之間以及各色譜峰與雜質(zhì)峰之間均能達(dá)到有效分離。

3.2提取方法的選擇在提取方式的選擇上，作者分別嘗試了加熱回流提取和超聲提取，結(jié)果加熱回流提取和超聲提取效果差異不大，考慮到檢驗(yàn)過(guò)程操作的便捷性，優(yōu)選超聲提取作為百效丸供試品溶液的提取方式；在此基礎(chǔ)上，作者又以所測(cè)成分哈巴苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、巴豆苷、和厚樸酚、厚樸酚提取率為指標(biāo)，對(duì)比考察了超聲提取時(shí)間(15、30、45 min)和提取溶劑(水、50%甲醇、70%甲醇)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以50%甲醇為提取溶劑時(shí)，所測(cè)各成分綜合提取率最佳；超聲提取15 min時(shí)，部分所測(cè)成分含量偏低，超聲提取30 min和超聲提取45 min所測(cè)各成分含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故本文采用50%甲醇超聲提取30 min作為百效丸供試品溶液的制備方法。

4 小結(jié)

本研究建立的百效丸中6種主成分含量同時(shí)測(cè)定的方法，填補(bǔ)了本品在液相色譜定量分析方面的空白，可進(jìn)一步保證百效丸產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效，所建立的方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好。但也存在著一定的不足之處，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照品使用量較大，檢驗(yàn)成本偏高，采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定百效丸中多成分含量還在進(jìn)一步研究中。

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