毛登啟， 鄧 瓊， 張建文， 植 凡，王 瑞， 張 穎， 方 維， 王宏亮， 梁 輝

(深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院 泌尿外科，深圳 518109)

引 言

雄激素及其受體(Androgen receptor，AR)對精子發(fā)生和維持男性生育力具有非常重要的作用[1]。大鼠睪丸中睪酮的濃度為200～300nM，當(dāng)睪酮濃度低于70nM時，精子發(fā)生無法正常進(jìn)行[2]。缺少雄激素或者AR，會導(dǎo)致男性的生殖力受損，包括無法形成血睪屏障，精母細(xì)胞發(fā)育停滯在減數(shù)分裂前期，未成熟的精細(xì)胞從支持細(xì)胞解離，成熟的精子無法釋放等[3]。睪丸組織不同細(xì)胞類型的條件性Ar基因敲除小鼠表現(xiàn)為不同程度的生精障礙。睪丸支持細(xì)胞選擇性Ar基因敲除(SCARKO)小鼠和全身性Ar基因敲除(ARKO)小鼠，其生精過程分別停滯在減數(shù)分裂前期的粗線期和細(xì)線期[4],曲精細(xì)管內(nèi)的生殖細(xì)胞中AR并不具有相應(yīng)的功能作用[5]。這些研究數(shù)據(jù)表明，雄激素主要通過睪丸支持細(xì)胞中的AR調(diào)控精子發(fā)生的過程。

雄激素可以經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑兩種作用方式調(diào)控睪丸支持細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄水平以及代謝。經(jīng)典途徑是指細(xì)胞外的雄激素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與受體結(jié)合，復(fù)合體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與雄激素反應(yīng)元件(Androgen response element,ARE)結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá),然而，經(jīng)典途徑的效應(yīng)涉及靶基因轉(zhuǎn)錄水平的改變及新的效應(yīng)蛋白的合成和分泌，往往需要數(shù)個小時[6]。在睪丸支持細(xì)胞中，至少存在兩條非經(jīng)典途徑：第一條是雄激素刺激導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，引起Ca2+震蕩，進(jìn)而觸發(fā)一系列細(xì)胞生理活動的改變,包括激活PKA和PKC等。在分離的睪丸支持細(xì)胞給予睪酮刺激，20～40秒內(nèi)可觀察到Ca2+內(nèi)流現(xiàn)象[7]。第二條是與膜上的受體結(jié)合，快速觸發(fā)一系列的磷酸化反應(yīng)，最終引起cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，引起調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的激活或抑制[3]。有研究報道，雄激素的非經(jīng)典途徑可通過調(diào)節(jié)支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞的粘附維持正常的精子發(fā)生[3]。有證據(jù)表明，AR與細(xì)胞膜上的脂筏(Lipid rafts)結(jié)合，促進(jìn)激活A(yù)R信號通路[8],AR可能直接定位于細(xì)胞膜或者與膜上脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中富含鞘脂，Caveolins，Src家族激酶，G蛋白和信號調(diào)節(jié)子的脂筏結(jié)合[9],細(xì)胞膜上的AR介導(dǎo)雙氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)誘導(dǎo)的PI3K/Akt，Ras/Raf和PKC通路的激活[8]。

本研究從小鼠睪丸中分離支持細(xì)胞原代培養(yǎng)，采用磷酸化抗體芯片尋找睪酮激活的信號通路，進(jìn)一步在小鼠睪丸支持細(xì)胞系TM4細(xì)胞中驗證芯片分析結(jié)果。本研究將進(jìn)一步豐富睪丸支持細(xì)胞中雄激素/AR信號通路，為精子發(fā)生障礙引起的男性不育的臨床診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

C57BL/6J小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，細(xì)胞分離培養(yǎng)用的膠原酶(C5138)、Deoxyribonuclease Ⅰ(DnaseⅠ，DN25)、透明質(zhì)酸酶(H3506)及胰蛋白酶(T1426)購自Sigma-Aldrich，細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基DMEM、F12(1：1)、雙抗和胎牛血清均購自Gibco,支持細(xì)胞的標(biāo)記物為Sox-9抗體(AB5355，Millipore)，Hochest 33342(1：2000)購自Invitrogen。所有的動物實驗經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)。EGFR、Akt、RTK及胞內(nèi)信號通路蛋白磷酸化抗體芯片購自于CST(Cell Signaling Technology，USA)。實驗中所用到的抗體其他抗體均來源于CST，均為兔源，且使用時按1：1000稀釋，包括:Phospho-Akt(位點Ser473，貨號4058)，Akt(貨號4685)，Phospho-Erk1/2(位點Thr202/Tyr204，貨號4370)，Erk1/2(貨號4695)，Phospho-MEK1/2(位點Ser217/221，貨號9154)，MEK1/2(貨號8727)，Phospho-GSK-3α/β(位點Ser21/9，貨號8566)，GSK-3α/β(貨號5676)，Phospho-p70 S6 Kinase(位點Thr421/Ser424，貨號9204)，p70 S6 Kinase(貨號2708)。

1.2 小鼠睪丸支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)

方法如文獻(xiàn)[10]所示，無菌條件下取出6～8周的健康雄鼠睪丸組織，剝離白膜后以5～10ml的PBS洗滌3次，加入37℃預(yù)熱的消化液1(0.1%膠原酶和DnaseⅠ)，水浴鍋中震蕩(37℃，60rpm)消化20min,靜置1min，待組織緩慢沉降后棄上清，用冷的PBS洗滌3次。加消化液2(0.1%膠原酶，0.1%透明質(zhì)酸酶和DnaseⅠ)，水浴鍋中震蕩消化10min。500rpm離心1min，棄上清，加PBS清洗，重復(fù)3遍。加37℃預(yù)熱的消化液3(含0.1%膠原酶，0.1%透明質(zhì)酸酶，0.25%胰蛋白酶和DnaseⅠ)，37℃水浴鍋中震蕩(60rpm)消化20min。加入與細(xì)胞懸液等量的細(xì)胞完全培養(yǎng)液終止消化，移液器輕輕吹打細(xì)胞懸液至單個細(xì)胞，將細(xì)胞懸液以40μm濾器(Corning)過濾,1000rpm離心3min，棄上清。重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)。

1.3 蛋白免疫印跡

蛋白提取試劑盒(Pierce)提取總蛋白。BCA法測定樣品濃度，并調(diào)整濃度為1μg/μL，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，98℃蛋白變性5min。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉1h，加一抗4℃孵育過夜。TBST洗3遍，每次5min。室溫孵育二抗1h，TBST洗3遍，每次5nin，ECL發(fā)光液孵育。用凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-5520)拍照保存。蛋白的表達(dá)是采用軟件ImageJ，對曝光的目的蛋白條帶測定的數(shù)值，以持家蛋白條帶數(shù)值為校準(zhǔn)，計算得到的相對表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

小鼠睪丸支持細(xì)胞系TM4細(xì)胞購自ATCC，TM4細(xì)胞及原代培養(yǎng)的支持細(xì)胞的培養(yǎng)條件均為DMEM高糖培養(yǎng)基，添加10%FBS、100IU/ml青霉素及100IU/ml鏈霉素。原代細(xì)胞或TM4細(xì)胞培養(yǎng)的匯合度達(dá)60%-70%時，換含剝離血清的培養(yǎng)基孵育過夜；次日，換含0.1%BSA無血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育6h。Flutamide給藥實驗中，需提前與細(xì)胞共孵育6h，即在0.1%BSA中添加，并孵育6h。10nM睪酮(大連美侖生物)給藥刺激。

1.5 細(xì)胞免疫熒光

爬片的原代睪丸支持細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)7天，棄培養(yǎng)基，PBS洗2次后甲醇-20℃固定30min。PBS洗1次，0.1%TritonX-100打孔10min。PBS洗兩次后，以10%BSA室溫封閉60min，兔IgG(陰性對照)或兔源一抗4℃孵育過夜(Sox-9，1：100)。加PBS(PBS加0.05%Trixon-100)洗3次，每次5min；加熒光二抗(羊抗兔IgG，1：500)室溫孵育2h；加Hochest33342繼續(xù)孵育10min；最后，PBST洗3次，每次10min；以防淬滅劑封片;熒光顯微鏡拍照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SigmaPlot進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，差異性檢驗采用t檢驗或One/Two way ANOVA分析，后以Fisher配對檢驗。P<0.05設(shè)置為差異有顯著性。

2 實驗結(jié)果

2.1 小鼠睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立

采用三步酶消化分離法，成功建立并優(yōu)化了小鼠睪丸支持細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。如圖1所示，A～F分別表示小鼠睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)1～6天生長和貼壁情況。第1天(圖1A)，部分支持細(xì)胞開始貼壁生長，精細(xì)胞則仍懸浮生長；第2天(圖1B)，換液后，大部分的精細(xì)胞被分離出去，更多的支持細(xì)胞貼壁生長；其后3～6天(圖1C～1F)，支持細(xì)胞開始增殖，圖片顯示支持細(xì)胞生長狀態(tài)良好；第6天，取部分細(xì)胞進(jìn)行鑒定，如圖1H～1G顯示，分離的支持細(xì)胞的純度超過95%。

圖1 小鼠睪丸支持細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

2.2 磷酸化抗體芯片顯示睪酮刺激迅速促進(jìn)Akt和MEK/Erk磷酸化

圖2 睪酮快速促進(jìn)支持細(xì)胞激酶的磷酸化A：磷酸化抗體芯片結(jié)果顯示，睪酮刺激快速誘導(dǎo)MEK/Erk及Akt激酶的磷酸化；B：蛋白免疫印跡驗證芯片分析結(jié)果。Figure 2 Testosterone induces fast phosphorylation of the kinases in Sertoli cellsA:Results from phosphorylation signaling pathway antibody array showed that testosterone induces fast phosphorylation of kinase MEK/Erk and Akt.B:Results of the arrays were verified by Western blot

原代睪丸支持細(xì)胞穩(wěn)定貼壁培養(yǎng)，長滿培養(yǎng)板60%～70%時，含剝離血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜；10nM睪酮刺激后，提取細(xì)胞總蛋白。磷酸化抗體芯片結(jié)果顯示(圖2A)，睪酮刺激5min后，MEK/Erk和Akt等位點的磷酸化水平快速升高，其后，開始下降并逐漸恢復(fù)至生理水平。其中，Akt信號通路下游多個位點也出現(xiàn)了快速磷酸化,如GSK-3以及p70S6激酶的磷酸化水平在睪酮刺激下迅速升高。我們采用小鼠睪丸支持細(xì)胞系TM4細(xì)胞進(jìn)一步驗證芯片分析結(jié)果,蛋白免疫印跡結(jié)果顯示(圖2B)，與芯片分析結(jié)果一致，MEK/Erk和Akt激酶磷酸化水平在睪酮刺激下迅速升高。

2.3 MEK/Erk和Akt磷酸化的快速激活由AR介導(dǎo)

圖3 AR介導(dǎo)Akt和MEK/Erk的快速磷酸化A：Flutamide對MEK/Erk和Akt磷酸化的影響；B：多個實驗的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果(n=3)Figure 3 Fast phosphorylation of MEK/Erk and Akt were mediated by AR.A,The representative Western blot images showed the effect of flutamide on the phosphorylation of MEK/Erk and Akt.B,Statistic analysis of the data collected from several experiments(n=3)

為進(jìn)一步確定Akt及MEK/Erk磷酸化快速激活是否由AR介導(dǎo)，TM4細(xì)胞以AR拮抗劑Flutamide孵育。TM4細(xì)胞以含剝離血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,次日，更換以含F(xiàn)lutamide或DMSO的0.1%BSA孵育6h，10nM睪酮刺激5min，提取細(xì)胞總蛋白。蛋白免疫印跡顯示(圖3A)，30μM和100μM的Flutamide不僅降低了對照組TM4細(xì)胞中Akt和MEK/Erk的磷酸化水平，也抑制了睪酮刺激誘導(dǎo)的Akt和MEK/Erk磷酸化水平的升高。多個重復(fù)實驗的統(tǒng)計結(jié)果也表明Flutamide抑制了由睪酮刺激誘導(dǎo)的激酶磷酸化水平的升高(圖3B)。

3 討 論

精子發(fā)生是一個復(fù)雜而有序的生理過程，可以分為精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成三個階段[11]。精子發(fā)生障礙會導(dǎo)致男性不育或精子活力降低,數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，男性不育人數(shù)呈逐年上升趨勢，男性精液質(zhì)量下降，男性生殖健康已成為社會關(guān)注的重要問題。世界衛(wèi)生組織已將不孕不育癥列為僅次于腫瘤和心腦血管的第三大疾病[12]。研究男性不育癥的發(fā)病機理，尋找有效的診斷和治療方法是當(dāng)今生殖醫(yī)學(xué)工作者的研究導(dǎo)向。大量的臨床與實驗研究資料表明，雄激素及其受體(AR)在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[1]。

通過蛋白磷酸化抗體芯片，我們發(fā)現(xiàn)睪酮能快速誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞中的Akt和MEK/Erk磷酸化。有研究表明，DHT介導(dǎo)的PI3K/Akt通路是AR依賴的[13],AR與PI3K的p85α調(diào)節(jié)亞基直接結(jié)合，激活PI3K/Akt通路[8]。Akt活化后，激活mTOR-Raptor復(fù)合體，進(jìn)一步磷酸化下游靶標(biāo)，4E-BP1和S6激酶等[14]。PI3K/Akt通路活化后，激活下游的mTOR，觸發(fā)MAPK/Erk磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，這一信號通路受PTEN調(diào)控。PTEN是一種蛋白磷酸酶，導(dǎo)致PIP3去磷酸化，從而抑制PI3K誘導(dǎo)的Akt活化[15,16]。

DHT刺激AR依賴的前列腺癌細(xì)胞，Erk磷酸化水平呈劑量依賴的方式在5min內(nèi)顯著升高。AR拮抗劑Casdex和Flutamide處理，不影響Erk的磷酸化[17]。Erk激酶的活性與血睪屏障的維持有關(guān)[18]，AR一方面可以通過表皮生長因子受體(EGFR)途徑，激活Ras/Raf，促進(jìn)MEK磷酸化，活化Erk；另一方面，AR還可以通過PKC調(diào)節(jié)MAPK/Erk通路[17,19]。同時，PI3K/Akt也可在PTEN調(diào)節(jié)下，引起MAPK/Erk通路的活化[15]。

有研究指出，AR的非經(jīng)典途徑對于精子發(fā)生過程中生殖細(xì)胞與支持細(xì)胞的黏附是必要的[3]。由于睪丸組織中睪酮的濃度遠(yuǎn)高于ARE轉(zhuǎn)錄調(diào)控所需要的水平,研究者在睪丸支持細(xì)胞中所鑒定的受雄激素調(diào)控的靶基因數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期，且這些基因中只有一部分是通過ARE調(diào)控的,而在缺少AR或者AR的功能被抑制時，這些所鑒定的雄激素調(diào)控的基因中大部分的表達(dá)都是下調(diào)的。這些都將研究者的研究重點轉(zhuǎn)向雄激素誘導(dǎo)激活的激酶信號通路[20]，它們可以快速改變不依賴AR啟動子作用或者不含ARE的基因的表達(dá)水平，并且具有時效快，效果顯著的特點。

4 結(jié) 論

本研究通過對原代培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞以睪酮刺激，采用蛋白磷酸化抗體芯片分析發(fā)現(xiàn)Akt和MEK/Erk快速磷酸化，進(jìn)一步采用Western Blot技術(shù)，驗證了芯片分析結(jié)果,同時，采用AR拮抗劑，驗證支持細(xì)胞中Akt和MEK/Erk磷酸化的激活是由AR介導(dǎo)的。而支持細(xì)胞中睪酮誘導(dǎo)的AR-Akt和AR-MEK/Erk通路的相關(guān)蛋白的磷酸化以及二者在小鼠精子發(fā)生過程中的作用及其分子機制，仍需要進(jìn)一步的深入研究。本研究進(jìn)一步豐富了雄激素作用“非經(jīng)典途徑”的科學(xué)內(nèi)涵，對于闡明精子發(fā)生的分子機制具有重要的學(xué)術(shù)意義，也將為生精障礙的診斷和治療提供新的思路。

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