于 春,李 軍,秦 旭,岑延利,王 祺

( 貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

有機(jī)氯農(nóng)藥在正常環(huán)境條件下不易降解，難溶于水，可溶于多種有機(jī)溶劑中；易于體內(nèi)蓄積，對健康構(gòu)成很大的威脅。可以通過呼吸道、消化道和皮膚吸收，進(jìn)入機(jī)體后隨血液分布到肝臟、腎臟、心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脂肪等各組織和器官中,在體內(nèi)激活或抑制內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，破壞機(jī)體穩(wěn)定性；長期攝入可影響我們的行為、腎臟、甚至?xí)?dǎo)致癌癥[1-2]。95%二甲四氯原藥屬于有機(jī)氯農(nóng)藥，無色結(jié)晶。二甲四氯為苯氧乙酸類選擇性激素型除草劑，具有較強(qiáng)內(nèi)吸傳導(dǎo)性，在我國具有較大開發(fā)價(jià)值及較好的推廣使用前景，越來越受到生產(chǎn)廠家的重視以及農(nóng)民的青睞。目前，國內(nèi)關(guān)于二甲四氯短期重復(fù)染毒經(jīng)口試驗(yàn)對大鼠腎臟損害的相關(guān)文獻(xiàn)以及報(bào)道資料較少。本實(shí)驗(yàn)采用灌胃法建立95%二甲四氯原藥短期重復(fù)染毒大鼠模型，通過觀察各劑量組大鼠一般癥狀、體重；臟器系數(shù)、尿肌酐(Cr)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)；血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)；腎NAG的變化，了解95%二甲四氯原藥對大鼠腎臟相關(guān)指標(biāo)的影響，為二甲四氯農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康成年SD大鼠40只，體重180g～220g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：[SCXK(黔)2012-001]，雌雄各半。大鼠飼養(yǎng)于室溫18～22℃，濕度：40%～70%，噪聲≤50db動物實(shí)驗(yàn)室。期間，自由攝食飲水。

1.2 儀器和試劑

AU400全自動生化分析儀(奧林巴斯，日本)；Csan-XL全自動尿液分析儀(科寶，德國)；酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司，美國)；95%二甲四氯原藥(某公司提供)；二甲基亞砜(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；Cr、NAG、BUN試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

正式試驗(yàn)分組及染毒方式：隨機(jī)分為四組，每組10只，雌雄各半，每天同一時(shí)間灌胃，期間正常攝食飲水；

溶劑對照組:采用50%二甲基亞砜作為溶劑對照，10mL/kg.bw灌胃，連續(xù)28天。

低劑量組：設(shè)95%二甲四氯原藥的40%LD50作為低劑量組，以50%二甲基亞砜配制，10mL/kg.bw灌胃，連續(xù)28天。

中劑量組：設(shè)95%二甲四氯原藥的20%LD50作為中劑量組，以50%二甲基亞砜配制，10mL/kg.bw灌胃，連續(xù)28天。

高劑量組：設(shè)95%二甲四氯原藥的10%LD50作為高劑量組，以50%二甲基亞砜配制，10mL/kg.bw灌胃，連續(xù)28天。

1.4 臟器系數(shù)檢測

解剖分離大鼠腎臟器官，稱重并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算腎臟臟器系數(shù)。

1.5 尿NAG、Cr檢測

按照測試盒進(jìn)行試驗(yàn)。

1.6 血Cr、BUN檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠稱重并記錄數(shù)據(jù)，采用戊巴比妥鈉麻醉后心臟采血，以2500r /min 離心15 min分離血清，全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.7 腎NAG檢測

采血結(jié)束后，解剖分離大鼠腎臟器官，置于-80℃冰箱備用。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布者采用單因素方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 腎臟臟器系數(shù)

各劑量組雌、雄大鼠腎臟臟器系數(shù)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 95%二甲四氯原藥短期重復(fù)染毒 對大鼠腎臟臟器系數(shù)的影響( x±s，n=5)

注：P>0.05

3.2 尿NAG、Cr檢測

雌鼠尿NAG各劑量組與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.774，P<0.05)；雄鼠尿NAG高劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雌鼠尿Cr各劑量組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雄鼠尿Cr各劑量組與對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 95%二甲四氯原藥短期重復(fù)染毒 對大鼠尿NAG、Cr的影響( x±s,n=5)

注:*：p<0.05

3.3 血BUN、Cr檢測

雌鼠血Cr中劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雌鼠血BUN各劑量組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);雄鼠血BUN、Cr各劑量組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 95%二甲四氯原藥短期重復(fù)染毒 對大鼠血BUN、Cr的影響( x±s,n=5)

注:*：p<0.05

3.4 大鼠腎NAG檢測

雄鼠腎NAG中劑量組、高劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雌鼠各劑量組腎NAG與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 95%二甲四氯原藥短期重復(fù)染毒 對大鼠腎NAG酶活力影響( x±s,n=5)

注:*：p<0.05

3.5 大鼠尿NAG、Cr、血Cr、BUN、腎NAG相關(guān)性分析

尿NAG和腎NAG有相關(guān)性(r=0.341，P<0.05)；尿Cr和尿NAG有相關(guān)性(r=0.374,P<0.05)；尿Cr和血Cr有相關(guān)性(r=0.379,P<0.05)。見表5。

表5 大鼠尿NAG、Cr、血Cr、 BUN、腎NAG相關(guān)性分析

注:*：P<0.05

4 討論

二甲四氯有機(jī)氯農(nóng)藥，屬于苯氧乙酸類選擇性激素型除草劑，在我國具有較大開發(fā)價(jià)值及較好的推廣使用前景。目前，國內(nèi)關(guān)于二甲四氯短期重復(fù)染毒經(jīng)口試驗(yàn)對大鼠腎臟損害的相關(guān)文獻(xiàn)以及報(bào)道資料較少。因此本文建立95%二甲四氯原藥短期重復(fù)染毒大鼠模型，檢測大鼠NAG、BUN、Cr等指標(biāo)，了解95%二甲四氯原藥對大鼠腎臟的損傷情況，為二甲四氯農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

臟器系數(shù)是提供受試化合物靶器官的重要指標(biāo)[3]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：雄鼠各劑量組臟器系數(shù)均高于雌鼠臟器系數(shù)，且雄鼠高劑量組臟器系數(shù)高于所有分組；說明可能由于95%二甲四氯原藥毒性作用使其雄性高劑量體重下降，也可能與受試物引起的臟器損害相關(guān)；提示95%二甲四氯原藥對雄性大鼠腎臟可能更為敏感，具體機(jī)制需做進(jìn)一步研究。

NAG酶主要存在于近端腎小管上皮細(xì)胞的溶酶體內(nèi)，是反映腎損害的標(biāo)志酶[4-6]；并且是腎臟早期受損的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：雌鼠尿NAG各劑量組與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.774，P<0.05)；提示該受試物對雌鼠腎臟功能有損傷影響。雄鼠腎NAG中劑量組、高劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示該受試物在一定劑量下，可對雄鼠腎臟功能有一定的損傷作用。其中雌鼠腎NAG、雄鼠尿NAG各劑量組與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；提示可能與腎細(xì)胞的異源性使NAG酶在不同節(jié)段存在差異相關(guān)。

血BUN、Cr可間接反映腎小球過濾(GFR)功能，尿Cr可直接反映GFR；而GFR是衡量腎功能重要指標(biāo)；其中血Cr可反映腎實(shí)質(zhì)受損的情況[7-8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：雌鼠血Cr中劑量組與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示提示該受試物在一定劑量下，可對雌鼠腎臟功能有一定的損傷影響。其中雌鼠血BUN、尿Cr以及雄鼠血BUN、Cr、尿Cr各劑量組分別與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；提示可能與95%二甲四氯原藥毒性蓄積濃度有關(guān)，也可能與GFR未下降50%～70%有關(guān)。

根據(jù)大鼠BUN、Cr、NAG相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，尿Cr和尿NAG有相關(guān)性(r=0.341，P<0.05)；提示大鼠腎臟功能出現(xiàn)損傷時(shí)，可通過檢測尿Cr值的變化情況，判斷機(jī)體腎臟的損傷情況。

綜上，95%二甲四氯原藥短期重復(fù)染毒可引起大鼠生長發(fā)育遲緩，導(dǎo)致大鼠Cr、BUN、NAG的改變，對大鼠腎臟功能造成一定損傷，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。尿NAG、Cr有顯著相關(guān)性，說明大鼠腎臟功能出現(xiàn)損傷時(shí)，可通過檢測尿Cr值的變化情況對其腎臟損傷情況做出快速、有效判斷。通過本次研究結(jié)果，建議在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)避免長期攝入95%二甲四氯原藥；并且不斷創(chuàng)新、提高農(nóng)藥生產(chǎn)技術(shù)，開發(fā)高效、低毒、廣譜、低用量的二甲四氯農(nóng)藥廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

[1] 盧 青,張盼紅,高俊宏,等.1，1-二氨基-2，2-二硝基乙烯對大鼠亞急性經(jīng)口毒性研究[J].環(huán)境與健康雜志,2016,33(3):263-266.

[2] 王心如.毒理學(xué)基礎(chǔ)[M].6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012.

[3] Idasiad-Piechocka I,Krzymanski M.The role of tubulointers titial changes in progression of kidney function failure in patients wthchronic glomerulonep-hritis[J].Przegl Lek.1996,53:443-453.

[4] 黃振烈,陳潤濤,宋向榮,等.大鼠亞急性吸入高效氯氰菊酯的毒性研究[J].中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2009,22(5)：340-343.

[5] 冉海霞，趙 海，杜 江，等.苗藥半截爛對小鼠肝、腎毒性實(shí)驗(yàn)的初步研究[J].實(shí)驗(yàn)動物科學(xué),2015，32(2):27-30.

[6] 李永明.丹參多糖的急性和亞急性毒性試驗(yàn)研究[J].藥學(xué)研究，2016,35(1)：16-18.

[7] 成 遙,張 賀,孟楣,等.新風(fēng)膠囊肝腎亞急性毒性實(shí)驗(yàn)研究[J].安徽醫(yī)藥，2015,19(8)：1450-1453.

[8] 陳 力,熊筱娟，高守紅，等.UHPLC-MS/MS法測定大鼠血漿中環(huán)磷酰胺及其代謝物的濃度[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,37(9)：1063-1069.