陳銳 孫曉宇 鄧媛 路鵬鵬 趙玲俠 瞿佳 沈衛(wèi)榮

（陜西省微生物研究所，西安 710043）

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化學(xué)農(nóng)藥的不科學(xué)施用以及連作土壤自凈化能力的降低，致使農(nóng)產(chǎn)品及農(nóng)業(yè)用地的土壤農(nóng)藥殘留問題日益突出［1-2］。殘留農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境［3］及人類身體健康［4］產(chǎn)生了巨大威脅。多菌靈是一種氨基甲酸甲酯類殺菌劑，過量使用不僅會改變土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)［5］，還會對土壤中的無脊椎動物造成影響［6］，有研究表明多菌靈對人生殖細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞有毒害作用［7-8］。利用微生物的生命代謝活動，從土壤中篩選能夠有效降解特定農(nóng)藥的微生物菌株［9-10］，將其制備成降解菌劑，可在短時有效降低土壤中農(nóng)藥殘留的水平，使土壤恢復(fù)健康狀態(tài)［11］。目前已有很多文獻(xiàn)報道篩選獲得搖瓶發(fā)酵高效降解多菌靈的菌株，但這些菌株在盆栽及田間實(shí)驗(yàn)中降解效果不佳。分析其原因可能與菌株耐受土壤復(fù)雜的生境有關(guān)。本研究通過唯一碳源平板篩選法，從長期使用多菌靈的棚室土壤中篩選出高效分解利用多菌靈的降解菌株，該菌可以在較寬泛的條件下生存，對環(huán)境條件耐受度高，以該菌作為出發(fā)菌株，或能解決土壤中殘留農(nóng)藥多菌靈的問題。

1.1 材料

采集土壤樣本于陜西省大荔縣埝橋鄉(xiāng)東埝村（N34°49'30″，E109°51'52″，海拔 357 m）菜農(nóng)長期使用多菌靈的棚室，采用5點(diǎn)采樣法，采樣后將土壤樣本均勻混合。

1.2 方法

1.2.1 多菌靈降解菌的分離 細(xì)菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NH4NO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，（NH4）2SO40.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 0.5 g，K2HPO41.5 g，酵母提取物0.05 g。平板篩選實(shí)驗(yàn)用多菌靈為四川國光50%可濕性粉劑，待滅菌細(xì)菌無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基冷卻至60℃后加入50%多菌靈（碳源終濃度0.2%）。采用梯度稀釋法將土壤樣本涂布于平板上，28℃培養(yǎng)3 d，待平板長出單菌后，進(jìn)行2次劃線純化，選擇單菌落，LB増菌，甘油低溫保藏。

1.2.2 多菌靈降解菌的篩選 采用紫外分光光度法對篩選出的菌株進(jìn)行多菌靈農(nóng)藥降解菌的初步篩選。將多菌靈加入100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中（終濃度100 mg/L），接入菌液100 μL，設(shè)3個重復(fù)，以無菌發(fā)酵液及水加入多菌靈（終濃度100 mg/L）作為平行對照，28℃，180 r/min培養(yǎng)，每48 h、72 h及120 h分別取發(fā)酵液1 mL測定多菌靈殘留濃度。標(biāo)準(zhǔn)試劑購自沈陽化工研究院（含量大于99.5%），方法參照文獻(xiàn)［12］，如果樣品的多菌靈濃度過高則需用稀鹽酸進(jìn)行稀釋。

1.2.3 多菌靈降解菌的形態(tài)及生化鑒定 對多菌靈降解率在30%以上的菌株進(jìn)行種屬鑒定。取菌株在LB平板上劃線，28℃培養(yǎng)48 h，觀察其菌落形態(tài)，取菌體涂片進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。生理生化鑒定部分參照文獻(xiàn)［13］，菌株等進(jìn)行明膠、接觸酶、七葉苷檢測，利用康泰微生物鑒定分析系統(tǒng)的BIOKONT20E平板對鄰硝基苯半乳糖苷（ONPG）、色氨酸（TDA）、密二糖（MEL）、阿拉伯糖（ARA）、硝酸鹽（NO2）、氧化酶（OX）等20項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行檢測，檢測后與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

1.2.4 多菌靈降解菌的生長特性

1.2.4.1 菌株生長曲線 取保藏菌種轉(zhuǎn)接斜面，28℃培養(yǎng)18 h復(fù)壯，接入LB液體培養(yǎng)基搖菌管中，28℃，180 r/min培養(yǎng)16 h，至對數(shù)生長期。100 mL LB培養(yǎng)基，按照1%接種，定時從搖瓶中取樣，測定在600 nm波長處的吸光值，繪制生長曲線圖。

1.2.4.2 菌株生長pH范圍 取LB液體培養(yǎng)基100 mL 15瓶，分別調(diào)節(jié)其pH為 3.0，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5及10，按照1%接種，28℃ 180 r/min培養(yǎng)28 h，從每個瓶內(nèi)取樣，測定培養(yǎng)基在600 nm波長處的吸光值。

1.2.4.3 菌株生長溫度范圍 取LB液體培養(yǎng)基100 mL 9瓶，按照1%接種，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度為15℃，20℃，25℃，28℃，30℃，32℃，37℃，40℃，45℃，180 r/min培養(yǎng)28 h，從每個瓶內(nèi)取樣，測定培養(yǎng)基在600 nm波長處的吸光值。

1.2.4.4 菌株耐鹽范圍 取LB液體培養(yǎng)基100 mL 5瓶，按照1%接種，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基含鹽量為1%，2%，3%，4%和5%，28℃，180 r/min培養(yǎng)28 h，從每個瓶內(nèi)取樣，測定培養(yǎng)基在600 nm波長處的吸光值。

1.2.4.5 菌株耐受其他農(nóng)藥檢測 活的菌株在土壤中能否定殖與其是否在土壤復(fù)雜環(huán)境中耐受多重不利因素有關(guān)，因此檢測該菌株對百菌清（青島奧的斯），氯氰菊酯（中保殺蟲），啶蟲脒（深圳諾普信），腐霉利（江西禾益化工），吡蟲啉（淄博新農(nóng)基比巧）及氧化樂果6種農(nóng)藥的耐受能力，待滅菌LB固體培養(yǎng)基冷卻至60℃后加入農(nóng)藥（藥物終濃度0.2%），混合均勻，傾制平板。在農(nóng)藥平板上劃線，28℃ 培養(yǎng)72 h，觀察菌株在平板上的生長。

1.2.5 多菌靈降解菌的16S rDNA序列鑒定 取保藏菌種轉(zhuǎn)接斜面，28℃培養(yǎng)18 h復(fù)壯，接入LB液體培養(yǎng)基搖菌管中，28℃，180 r/min培養(yǎng)16 h，吸取菌液1 mL轉(zhuǎn)入EP管，10 000 r/min離心1 min，除去菌液。依照細(xì)菌基因組提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA kit DP302）說明方法提取菌體全基因組DNA。選擇保守區(qū)M13序列，引物序列如下所示：27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC A-3'；1492R：5'-G GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3'。PCR擴(kuò)增16S rDNA，72℃延伸，退火溫度58℃，1%瓊脂糖電泳檢測，回收擴(kuò)增產(chǎn)物測序。測序結(jié)果利用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件ClustalX及MEGA5.1構(gòu)建分類系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 多菌靈降解菌的Biolog微孔板鑒定 將獲得的純培養(yǎng)菌種劃線至平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h，待其形成直徑1-3 mm的單克隆。使用Biolog鑒定系統(tǒng)，MicroPlates微孔板：Biolog GEN III MicroPlates（Biolog Catalog No.1030）， 接 種 液：IF-A（Biolog Catalog No.72401），試驗(yàn)方法參照說明書，對菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

1.2.7 小麥蒼白桿菌WNP-3對多菌靈的降解率測定 稱取多菌靈純品0.005 g，加入50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中（終濃度為100 mg/L），接入對數(shù)生長期的菌液 50 μL，28℃、180 r/min 培養(yǎng) 24、72、120 h，設(shè)置3個重復(fù)及無菌發(fā)酵液作為對照。將帶菌體的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入250 mL三角瓶，用50 mL二氯甲烷震蕩萃取1.5 h，轉(zhuǎn)入分液漏斗，取下層有機(jī)相，上層水相轉(zhuǎn)入三角瓶，萃取3次。將有機(jī)相合并，加入無水硫酸鈉，再轉(zhuǎn)入250 mL燒瓶，56℃旋轉(zhuǎn)負(fù)壓蒸發(fā)至干，加入1 mL稀鹽酸（1+11）溶解，分三次加入流動相洗滌，定容至10 mL［14］。配制0.02 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH6.8）：1.38 g磷酸二氫鈉和1.41 g磷酸氫二鈉溶于900 mL水中，用磷酸調(diào)pH至6.8，定容至1L。HPLC檢測：色譜柱依利特C18柱，粒徑5 μm，流動相：磷酸鈉緩沖液+乙腈（80∶20），流速：1 mL/min，檢測波長：286 nm，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：25℃。

2 結(jié)果

2.1 多菌靈降解菌的分離

經(jīng)選擇性梯度稀釋平板培養(yǎng)，分離獲得60株可耐受200 mg/L多菌靈的細(xì)菌菌株。平板篩選出的菌株為耐受農(nóng)藥的自養(yǎng)型菌株或以農(nóng)藥作為唯一碳源生長的化能異養(yǎng)型菌株，其農(nóng)藥的利用率也有差異，需要對菌株降解能力進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2 多菌靈降解菌的篩選

經(jīng)初步篩選獲得12株可利用多菌靈作為唯一碳源生長的細(xì)菌菌株。其中WNP-3的降解效果穩(wěn)定、表現(xiàn)最佳。48、72及120 h后測定的多菌靈殘留濃度如表1所示，與空白對照相比，其中WNP-3有比較明顯的降解農(nóng)藥的能力，120 h時降解率達(dá)到42.1%，與空白對照的自然降解率21.5%及21.8%有顯著差異（圖1，P＜0.01），因此WNP-3可有效降解多菌靈。

表1 發(fā)酵48、72及120 h后多菌靈的殘留濃度

圖1 發(fā)酵48、72及120 h后多菌靈的降解率

使用△A=［A281nm-（A278nm+A290nm）/2］進(jìn)行校正得到△A，以△A為橫軸，以濃度C為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系進(jìn)行最小二乘法線性回歸，得到方程Y=0.311 8X+0.000 2，其相關(guān)系數(shù)R2=0.996 4，說明本實(shí)驗(yàn)線性范圍在0.008 3-0.05 mg/L之間，線性關(guān)系良好，靈敏度較高。使用這一公式需要所有發(fā)酵液均需約2 000倍稀釋才能在檢測有效范圍內(nèi)，雖然增加了稀釋可能帶來的誤差，但可快速簡便的篩選出對多菌靈有高效降解功能的菌株。

2.3 多菌靈降解菌的形態(tài)及生化鑒定

多菌靈降解菌WNP-3菌落乳白色，濕潤，在營養(yǎng)瓊脂上的菌落無色。為革蘭氏陰性菌，具平行邊和圓端的桿菌。菌株WNP-3的生理生化檢測結(jié)果如表2所示，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對，顯示該菌為小麥蒼白桿菌（Ochrobactrum tritici）。

表2 菌株WNP-3的生理生化檢測

2.4 多菌靈降解菌的生長特性

該菌以1%接種量接種，28℃，180 r/min培養(yǎng)，于16 h進(jìn)入對數(shù)生長期，大約在28 h進(jìn)入平臺期，平臺期可一直維持至48 h（圖2）。該菌在pH 4-9，培養(yǎng)溫度25-32℃，NaCl濃度 1%-3%內(nèi)均可正常生長，可以分別在濃度為0.2%的百菌清、氯氰菊酯、啶蟲脒、腐霉利、吡蟲啉及氧化樂果6種農(nóng)藥平板上生長，對農(nóng)藥具有一定耐受性，較為適于棚室連作土壤酸化、鹽漬化及棚室內(nèi)溫差環(huán)境。

圖2 WNP-3菌株生長特性

2.5 多菌靈降解菌的16S rDNA序列鑒定

經(jīng)16S rDNA基因擴(kuò)增，測序后經(jīng)GenBank比對，用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件ClustalX及MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），系統(tǒng)發(fā)育樹顯示該菌可能為蒼白桿菌屬菌株（Ochrobactrumsp.）。將該序列提交基因GenBank，登錄號為：MG457705。

2.6 多菌靈降解菌的Biolog微孔板鑒定

使用Biolog GENⅢ微孔板對部分純化菌株進(jìn)行種屬鑒定。讀板顯示PROB為0.535，Sim為0.535，Dist為6.934，經(jīng)Biolog板鑒定獲得WNP-3菌種為小麥蒼白桿菌（Ochrobactrum tritici）。

2.7 小麥蒼白桿菌WNP-3對多菌靈的降解率測定

圖3 WNP-3與模式菌株建樹

HPLC法測定的多菌靈殘留濃度如圖4所示，72 h蒼白桿菌對多菌靈降解率38%，與無菌對照具顯著差異（P＜0.01）。120 h空白對照的降解率為28%，蒼白桿菌發(fā)酵液對多菌靈的降解率為61%，具有顯著差異（P＜0.01）。因此可以斷定，WNP-3是能夠以多菌靈作為唯一碳源并進(jìn)行有效降解的細(xì)菌菌株。

圖4 HPLC法測定多菌靈降解率

3 討論

農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用為提高作物產(chǎn)量、降低作物病蟲害及雜草的產(chǎn)生作出了巨大的貢獻(xiàn)。但是農(nóng)藥污染帶來的生態(tài)環(huán)境破壞及對人類健康的影響問題也日益突出。施入農(nóng)田的農(nóng)藥部分可以轉(zhuǎn)化或降解，其他則經(jīng)歷許多不同的途徑進(jìn)入環(huán)境，或進(jìn)入土壤、或被植物吸收、或揮發(fā)進(jìn)入大氣或進(jìn)入地表、地下水［15］。許多研究結(jié)果都表明，農(nóng)藥對土壤微生物的間接和直接作用會進(jìn)而影響植物生長和土壤肥力。農(nóng)藥對土壤生物學(xué)有許多有害的影響，包括土壤中微生物數(shù)量和遺傳性狀的變化［16］、土壤酶活性的變化［17］土壤氮平衡的改變［18］。據(jù)文獻(xiàn)報道，多菌靈在土壤中，連續(xù)7次，間隔9 d重復(fù)施用多菌靈后，產(chǎn)生了顯著積累（P＜0.05），并能導(dǎo)致土壤產(chǎn)生遺傳毒性［19］。土壤細(xì)菌、硝化菌及放線菌發(fā)生先抑制后恢復(fù)的變化；而土壤真菌則始終受到抑制［20］。多菌靈對土壤蔗糖酶、過氧化氫酶、磷酸酶活性表現(xiàn)出抑制作用，土壤纖維素酶、脲酶活性則隨多菌靈濃度的增加有顯著的激活作用［21］。盡管非生物降解在許多情況下起著部分作用，但微生物對農(nóng)藥的降解通常是最重要和最主要的過程［22］。采用微生物法降解土壤中殘留的化學(xué)農(nóng)藥對于降低農(nóng)藥對生態(tài)產(chǎn)生的負(fù)面影響、恢復(fù)土壤微生物種群及土壤活力等具有重要意義［23-24］。據(jù)報道多菌靈在土壤中的消解動態(tài)均符合一級動力學(xué)方程，原始沉積量與施藥量、施藥次數(shù)密切相關(guān)［25］。

目前發(fā)現(xiàn)的對多菌靈具有降解能力的微生物包括腸桿菌（Enterobactersp.）［26］、球菌屬（Paracoccussp.）［27］、分支桿菌（Mycobacteriumsp.）［28］、木霉（Trichoderma）［29］、短芽孢桿菌（Brevibacillus borstelensis）、白淺灰鏈霉菌（Streptomyces albogriseolus）［30］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［31］、假單胞菌（Pseudomonassp.）［32］、紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）［33］、類諾卡氏屬（Nocardioidessp.）［34］、羅爾斯通氏菌（Ral stoniasp.）［35］及短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）［36］等，涵蓋了細(xì)菌、真菌及放線菌，其中以變形菌綱微生物居多。部分菌株屬于條件性致病菌株，如肺炎克雷伯氏（Klebsiellasp.）［37］，不適合開展應(yīng)用型研究。林秀報道其課題組分離獲得一株紅平紅球菌XJ_D，將其接種在600 mg/L 多菌靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，11 d時多菌靈的降解率達(dá)99.0%［38］，但該菌降解82%的土壤多菌靈（200 mg/L）需要條件為23-28℃，土壤含水量60%-80%，15 d。此外，龔芬芬等［39］從分支桿菌中獲得多菌靈水解酶基因（mheI），該基因片段大小729 bp，表達(dá)大小為24.3 kD的蛋白，該蛋白可將多菌靈水解成為，因此單獨(dú)將該基因進(jìn)行克隆表達(dá)無法解決多菌靈開環(huán)降解的目的。王一奇等［40］報道多菌靈經(jīng)假單胞菌屬作用生成2-氨基苯并咪唑，快速羥基化生成2-羥基苯并咪唑，繼續(xù)開環(huán)裂解生成鄰苯二胺，然后加氧脫氮生成鄰苯二酚，直至最后分解成二氧化碳和水。該菌株對多菌靈的降解屬于礦化作用，是較為理想的污染降解方式。但該菌株最佳降解能力為50 mg/L 多菌靈。受棚室環(huán)境條件及生產(chǎn)作業(yè)的影響，在棚室土壤環(huán)境中，存在其他各種類型的農(nóng)藥殘留，其土壤pH、溫度及土壤鹽分也發(fā)生著周期性變化。然而目前在多菌靈降解菌研究中，對于活菌耐受其他類型農(nóng)藥的研究尚不多見，部分研究報道的菌株發(fā)揮生物學(xué)作用的條件也較為苛刻，因此需要篩選可滿足粗放條件的降解菌株。

4 結(jié)論

本研究采用唯一碳源法，從長期連作棚室中篩選獲得12株可利用多菌靈作為唯一碳源生長的多菌靈降解菌。其中WNP-3表現(xiàn)出最佳的降解特性。該菌為革蘭氏陰性菌，具平行邊和圓端的桿菌。通過生理生化、Biolog微孔板鑒定法確定菌株WNP-3為小麥蒼白桿菌，結(jié)果與16S rDNA得到的結(jié)果相一致。經(jīng)HPLC測定，WNP-3在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)120 h的條件下，對100 mg/L多菌靈的降解率達(dá)到61%。該菌在pH 4-9，NaCl濃度 1%-3%內(nèi)均可正常生長，對6種常用農(nóng)藥具有一定耐受性，較為適于棚室連作土壤酸化、鹽漬化及棚室內(nèi)溫差環(huán)境。

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