朱薇 馬亞龍

（1. 湖南工業(yè)大學(xué)，株洲 412000；2. 中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083）

單質(zhì)硫（S0）的微生物氧化是硫的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中最重要的反應(yīng)之一，這些微生物一方面通過對S0的氧化為其自身生長提供能量［1］；另一方面通過溶解自然界中的含硫礦物，釋放一些金屬離子。因此，人們利用微生物對S0的氧化作用掀起了一門新興技術(shù)——生物濕法冶金技術(shù)（Biohydrometallurgy），即利用微生物法提取復(fù)雜低品位原生硫化礦（包括含銅、鈾、金、鈷和鉛等硫化礦）中的有價(jià)金屬及對金礦表面的硫化礦進(jìn)行氧化預(yù)處理［2-3］。

硫化礦生物浸出的微生物根據(jù)其最適生長溫度可劃分為常溫微生物（30-40℃）、中度嗜熱微生物（40-60℃）和極端嗜熱微生物（60-80℃）［4］。與常見的中溫菌相比，極端嗜酸熱古菌由于具有耐高溫、提取速率快和浸出率高等特點(diǎn)，在生物冶金工業(yè)應(yīng)用上有著很大的潛力，正逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。其中硫氧化機(jī)制及其代謝途徑是所有研究的核心，但是目前對于極端嗜酸熱古菌的硫氧化相關(guān)酶基因的注解非常缺乏，人們對嗜酸熱古菌硫氧化過程缺乏清晰的認(rèn)識和了解［5-6］。萬座嗜酸兩面菌Acidianus manzaensis是嗜酸菌屬的一個(gè)新種，是一株最適生長溫度在70℃左右的極端嗜酸熱古菌，屬于兼性厭氧和兼性化能自養(yǎng)微生物，能夠在S0和亞鐵（Fe2+）中進(jìn)行生長，在生物浸出過程中顯示出了很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值［7-9］。

A.manzaensisYN-25菌全基因組測序的完成為深入了解極端嗜酸熱古菌硫氧化機(jī)理和代謝途徑提供了大量信息［10］。本研究基于典型的極端嗜酸熱古菌A. manzaensisYN-25已公布的全基因組序列信息，通過生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄技術(shù)驗(yàn)證了與硫氧化相關(guān)功能基因，并通過對前述結(jié)果的分析，擬構(gòu)建極端嗜酸熱古菌A. manzaensis菌的硫氧化模型，旨在了解嗜酸熱古菌在硫氧化機(jī)制方面與硫氧化細(xì)菌的區(qū)別和聯(lián)系，并為以后闡明嗜酸熱古菌硫氧化機(jī)制的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

MgSO4·7H2O，K2HPO4，（NH4）2SO4，KCl，Ca（NO3）2均購自上海生工；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和總RNA提取試劑盒均購自于天根生化科技有限公司；引物由湖南擎科生物技術(shù)有限公司（TSINGKE Biological Technology）合成；ReverTra Ace-α-第一鏈cDNA合成試劑盒，HUNDERBIRDTM SYBR? qPCR Mix均購自于日本東洋紡公司（Toyobo co.，LTD.，Osaka，Japan）；RT-qPCR 在 iCycler iQTM Real-time PCR 儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，USA）上完成。

1.2 方法

1.2.1 菌株及培養(yǎng)基 本實(shí)驗(yàn)所用菌株Acidianus manzaensisYN-25由中南大學(xué)生物冶金重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，培養(yǎng)基配方：0.5 g/L MgSO4·7H2O；0.5 g/L K2HPO4；3.0 g/L（NH4）2SO4；0.1 g/L KCl；0.01 g/L Ca（NO3）2，添加 0.02%（W/V）酵母提取物作為生長因子，并分別加入10 g/L的S0、20 g/L的FeSO4·7H2O作為能源底物，培養(yǎng)基初始pH用濃硫酸分別調(diào)到 2.0（S0能源底物）和 1.5（Fe2+為能源底物）。在 500 mL的三角瓶中培養(yǎng)A. manzaensis，接種前將裝有200 mL培養(yǎng)基的三角瓶在滅菌鍋中 121℃滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻后進(jìn)行接種，初始接種菌濃均為 107個(gè)/mL，在 65℃、170 r/min的空氣浴搖床中培養(yǎng)。

1.2.2 S0和Fe2+能源底物中的A. manzaensis菌生長特性A. manzaensis在不同能源底物S0和Fe2+的培養(yǎng)過程中，每隔12 h取液體樣品分別測定細(xì)胞密度、pH值、SO42-和Fe3+。其中細(xì)胞密度采用光學(xué)顯微鏡直接鏡檢計(jì)數(shù)法，pH值使用pH計(jì)測定（雷磁PHS-3C），SO42-用改良的硫酸鋇比濁法測定［11］（在 50 mL比色管中分別加入 6.0 mL BaCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液、6.0 mL無水乙醇、2.0 mL 0.1 g/L Tween-80和 5 mL Na2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后用pH 1.0鹽酸溶液定容至 50 mL，定容之后靜置 5 min在波長為 420 nm可見光范圍內(nèi)測量吸光值）。Fe3+采用磺基水楊酸法測定［12］（在50 mL比色管中分別加入 3 mL待測樣品溶液、20%磺基水楊酸 10 mL，定容至 50 mL，靜置 5 min后在波長為 420 nm可見光范圍內(nèi)測量吸光值）。

1.2.3 NCBI數(shù)據(jù)庫檢索硫氧化基因及引物設(shè)計(jì)A.manzaensisYN-25的全基因組序列和完整的注釋通過檢索NCBI（登錄號為CP020447）數(shù)據(jù)庫獲得，根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索得到的相關(guān)基因信息采用Primer3（v.0.4.0）在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）設(shè)計(jì)對應(yīng)引物（表 1），相應(yīng)蛋白質(zhì)序列通過檢索NCBI Nonredundant Database數(shù)據(jù)庫獲得［13］，蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位通過開放閱讀課框中可能的跨膜區(qū)域由TMHMM 2.0 服務(wù)器（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）和THUMBUP服務(wù)器（http://sparks.informatics.iupui.edu/Softwares-Services_files/thumbup.htm）在線分析［14-15］。

1.2.4 RT-qPCR驗(yàn)證篩選S0氧化相關(guān)基因 為了驗(yàn)證篩選的20個(gè)基因與S0氧化相關(guān)性，采用RT-qPCR對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測。用于RT-qPCR的細(xì)胞收集于對數(shù)中期，總RNA的提取和總基因組DNA的提取分別采用細(xì)菌總RNA提取試劑盒和細(xì)菌總基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。對提取的總RNA用微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific NanoDrop? ND-1000 spectrophotometer） 測定其濃度，同時(shí)采用A260/A280和A260/A230的比值對所提RNA的純度和質(zhì)量進(jìn)行評估。以提取的總RNA用作模板，采用ReverTra Ace-α-第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成相應(yīng)的cDNA。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)以cDNA為模板，使用高效率SYBR熒光定 量 PCR mix QPK-201（Toyobo co.，LTD.，Osaka，Japan）配制反應(yīng)體系后在iCycler iQTM Real-time PCR 儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，USA）上進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)設(shè) 3 個(gè)重復(fù)。

表1 用于RT-qPCR引物序列信息

RT-qPCR分以下幾個(gè)程序：（1）98℃預(yù)變性 2 min ；（2）98℃解鏈 10 s，56℃復(fù)性 30 s，68℃延伸30 s，共設(shè) 40 個(gè)循環(huán)，并在每個(gè)循環(huán)的退火階段檢測熒光信號；（3）循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)溫度從 55℃開始梯度升高到 98℃作產(chǎn)物的熔解曲線，升溫時(shí)每次增加 0.5℃。對RT-qPCR采集的數(shù)據(jù)，用16S rDNA基因作為內(nèi)部參照校正，用（1+E）-ΔΔCq法進(jìn)行計(jì)算（其中E為擴(kuò)增效率，Cq值為熒光信號達(dá)到域值時(shí)的循環(huán)數(shù)），分析各個(gè)基因在不同能源底物培養(yǎng)時(shí)的相對表達(dá)量［16］。結(jié)果用log2［S0/Fe2+］±SD表示，并采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，即log2［S0/Fe2+］≥0.7（P≤ 0.05）表示為在S0能源底物下表達(dá)上調(diào)，如果log2［S0/Fe2+］≤ - 0.7（P≥0.05）則表示在S0能源底物下表達(dá)下調(diào)，即在Fe2+能源底物下表達(dá)上調(diào)。

2 結(jié)果

2.1 A. manzaensis菌在S0和Fe2+中的生長特性

首先比較研究了A. manzaensis菌在S0和Fe2+兩種不同能源底物下的生長特性，從圖1可知，在S0為能源底物時(shí)細(xì)胞的延滯期比以Fe2+為能源底物時(shí)長，以可溶性的能源底物FeSO4·7H2O培養(yǎng)的細(xì)胞更容易獲得能量進(jìn)行生長，而作為固體形式的能源底物S0，由于細(xì)胞需要將S0轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)一步被氧化利用，但是在S0中生長的細(xì)胞的對數(shù)期的細(xì)胞濃度比在Fe2+中高。

從圖1-A可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)行，溶液中的SO42-逐漸增大，同時(shí)溶液中的pH值也逐漸下降，說明A. manzaensis菌逐漸將S0氧化成SO42-，并且生成H+，從而導(dǎo)致溶液pH的下降。

從圖1-B可以看出，在以Fe2+為能源底物培養(yǎng)過程中溶液中的Fe3+先增大后減小，而且在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)A. manzaensis菌在Fe2+中生長時(shí)會有黃鉀鐵礬（MFe3（SO4）2（OH）6，M 為金屬離子）生成（公式1），伴隨著MFe3（SO4）2（OH）6的生成還有H+的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致溶液體系pH值的下降，而且形成黃鉀鐵礬過程中會消耗大量的Fe3+，導(dǎo)致溶液中的Fe3+逐漸降低。

圖1 A. manzaensis菌在S0（A）和Fe2+（B）中的生長特性

2.2 A. manzaensis S0氧化相關(guān)基因的篩選及RT-qPCR的驗(yàn)證

通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫中A. manzaensisYN-25的全基因組序列信息，并通過與其他已經(jīng)公布基因組的嗜熱古菌的基因進(jìn)行BLAST比對，共找到20個(gè)可能與S0氧化基因（表 2），其中包括編碼古菌對S0氧化的初始反應(yīng)步驟所需的硫氧化還原酶（Sulfur oxygenase-reductase）的sor基因，以及編碼其他的含硫代謝中間產(chǎn)物氧化酶的基因，例如編碼硫代硫酸鹽-醌氧還酶（Thiosulfate-quinone oxidoreductase）的tqo基因，編碼連四硫酸鹽水解酶（Tetrathionate hydrolase）的tetH基因等；同時(shí)還包括編碼電子傳遞體（Cytochrome B6）和末端氧化酶（aa3-type terminal oxidase、NADH ：ubiquinone oxidoreductase）的基因；值得注意的是在A. manzaensisYN-25的全基因組注釋信息中包含多個(gè)編碼硫還原蛋白家族（Sulfur reduction protein）的dsrE基因。對檢索的S0氧化基因的分類信息見圖 2。在NCBI數(shù)據(jù)庫中A. manzaensisYN-25的注釋信息中沒有編碼硫化物：醌氧化還原酶（Sulfide：quinone oxidoreductase（SQR））的基因sqr的注釋信息，進(jìn)一步通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)在A. manzaensis全基因組中登錄號為B6F84_03775（注釋信息為pyridine nucleotidedisulfide oxidoreductase）的基因與已有文獻(xiàn)報(bào)道的與A. manzaensis同一個(gè)Acidianus屬的不同種的A.hospitalisW1中的sqr同源性非常高，因此推測該基因在A. manzaensis菌中起到編碼SQR的功能。

為了驗(yàn)證篩選的20個(gè)基因與S0氧化相關(guān)性，采用RT-qPCR對A. manzaensis菌在S0和Fe2+兩種不同能源底物下的基因表達(dá)差異進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測。RT-qPCR結(jié)果（表 3）表明，通過數(shù)據(jù)庫篩選得到的20個(gè)A. manzaensis基因中有15個(gè)基因在S0能源底物下均表達(dá)上調(diào)，這些上調(diào)的基因中包括編碼對S0和含硫化合物進(jìn)行氧化的各種酶、電子傳遞體、末端氧化酶、硫還原蛋白家族和硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶的基因，說明這些基因與S0的氧化密切相關(guān)。有4個(gè)基因在兩種能源底物下表達(dá)差異并不明顯，值得注意的是soxl基因在S0能源底物下表達(dá)下調(diào)（即在Fe2+為能源底物時(shí)表達(dá)上調(diào)），推測該基因可能與Fe2+氧化相關(guān)。

表2 根據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索得到的A. manzaensis S0氧化相關(guān)基因信息

2.3 A. manzaensis的硫氧化模型構(gòu)建

根據(jù)對A. manzaensis菌全基因組注釋信息的分析和RT-qPCR對所篩選的基因驗(yàn)證結(jié)果，構(gòu)建了極端嗜酸熱古菌A. manzaensis的硫氧化模型（圖 3），即胞外的S0跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)（未知硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，經(jīng)SOR氧化還原生成S2O32-，SO32-和 H2S，該步反應(yīng)是胞內(nèi)對S0進(jìn)行氧化的重要步驟，但是該反應(yīng)不能與電子傳遞進(jìn)行偶聯(lián)產(chǎn)生能量，極端嗜酸熱古菌A. manzaensis主要通過對SOR反應(yīng)形成的中間產(chǎn)物S2O32-，SO32-和H2S的進(jìn)一步氧化產(chǎn)能，對這些中間產(chǎn)物氧化得到的電子會被傳遞給細(xì)胞膜上的氧化性醌（Q2+），使其形成還原性的醌（QH2），QH2最終被末端氧化酶氧化形成NADH和ATP，從而為細(xì)胞生長提供能量。而S0氧化后形成的終產(chǎn)物SO42-則通過硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶（Sulfate ABC transporter permease）排到胞外。

圖2 A. manzaensis菌S0氧化基因功能分類及所占比例

表3 基因RT-qPCR結(jié)果

3 討論

極端嗜酸熱古菌的硫氧化在硫的生物地球化學(xué)循環(huán)和硫化礦的生物浸出中起著重要的作用，但是關(guān)于極端嗜酸熱古菌的硫氧化機(jī)理研究較少，主要是因?yàn)槠渥钸m生長條件大都是在極端的生理生化條件下（高溫、低pH），這給研究其相關(guān)的生化反應(yīng)帶來了很大的困難。目前，隨著越來越多的極端嗜酸熱古菌的全基因組測序的完成，使得利用基因組信息分析相關(guān)代謝機(jī)理的模型成為可能。本文利用已公布的極端嗜酸熱古菌A. manzaensisYN-25的全基因組信息，通過數(shù)據(jù)庫比對初步篩選了20個(gè)可能與硫氧化相關(guān)的基因，并進(jìn)一步通過RT-qPCR對篩選得到的基因從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了驗(yàn)證，共鑒定出了15個(gè)與硫氧化相關(guān)的基因，其中包含一系列編碼氧化S0及含硫中間產(chǎn)物的酶［19-20，23-24］，它們對應(yīng)的編碼基因及蛋白酶在細(xì)胞中的定位及所涉及的反應(yīng)等酶的相關(guān)特性見表4。

圖 3 極端嗜酸熱古菌A. manzaensis的硫氧化模型

SOR在古菌的硫氧化過程中起著重要的作用，但是該酶只存在細(xì)胞質(zhì)中，因此胞外的S0需要先經(jīng)過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中才能被SOR進(jìn)行氧化還原反應(yīng)生成能被進(jìn)一步氧化的中間產(chǎn)物，但是對于古菌而言，該跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白至今未被找到。Rohwerder和Sand［21］根據(jù)對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的Acidithiobacillus ferrooxidans的研究提出S0可能被外膜富含巰基（P-SH）的外膜蛋白鍵和形成類似的Pr-SnH（n≥2）結(jié)構(gòu)化合物進(jìn)而被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞周質(zhì)空間被氧化（公式 2），其進(jìn)一步基于同步輻射的原位顯微表征（synchrotron radiation based STXM、μ-XRF））發(fā)現(xiàn)，極端嗜酸熱古菌A. manzaensis在以S0為能源底物培養(yǎng)下的細(xì)胞表面的巰基（-SH）是在以Fe2+為能源底物培養(yǎng)下的2.14倍［22］，這表明對于極端嗜酸熱古菌而言，胞外的S0可能同樣被膜上富含-SH的蛋白鍵和形成Pr-SnH（n≥2）結(jié)構(gòu)的復(fù)化合物進(jìn)入細(xì)胞中，該復(fù)合物在胞內(nèi)重新生成S0從而被SOR進(jìn)行氧化還原反應(yīng)生（圖 3）。值得注意的是，在A.manzaensis菌中含有多個(gè)編碼硫還原蛋白家族DsrE的基因，而且其在S0底物下的轉(zhuǎn)錄水平均高于在Fe2+為能源底物下，這說明該硫還原蛋白家族DsrE也參與了A. manzaensis的S0氧化過程。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道，DsrE蛋白在A. ferrooxidans菌中能夠氧化硫烷硫（Sulfane sulfur，GSSH）（表 4）［23］，因此推測該蛋白家族在古菌中也起到相同的功能。此外，對A. manzaensis菌的全基因組的分析發(fā)現(xiàn)沒有編碼腺苷核苷還原酶（Adenosine phosphosulphate reductase，APS）和腺苷酰硫酸磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（adenylylsulphate phosphate adenyltransferase，APAT）的基因，說明對于A. manzaensis而言，其硫氧化代謝途徑與已報(bào)道的其他嗜酸熱古菌Sulfolobus acidocaldarius和S.solfataricus等相比存在一定的差異［20，24-25］。

4 結(jié)論

本研究比較了極端嗜酸熱古菌A.manzaensis在S0和Fe2+兩種不同能源底物培養(yǎng)下的生長特性，結(jié)果表明細(xì)胞在不同的能源底物下可能通過不同的硫代謝途徑。通過實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）比較了以單質(zhì)硫（S0）和亞鐵（Fe2+）兩種不同能源底物培養(yǎng)下的基因表達(dá)差異，共鑒定出了15個(gè)與硫氧化相關(guān)的基因，包括一系列編碼能氧化單質(zhì)硫（S0）及含硫中間產(chǎn)物酶、電子傳遞體、末端氧化酶、硫還原蛋白家族和硫酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶的基因；同時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR還發(fā)現(xiàn)，A. manzaensis菌中含有多個(gè)dsre基因，這些dsre基因與硫的氧化密切相關(guān)?；谏鲜龇治觯狙芯繕?gòu)建了極端嗜酸熱古菌A.manzaensis的硫氧化模型，該模型與已報(bào)道的其他嗜酸熱古菌如Sulfolobus acidocaldarius和S. solfataricus等相比存在一定的差異。

表 4 極端嗜酸熱古菌A. manzaensis中S0及含硫化合物氧化相關(guān)酶的特性

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