張婧波 吳劍榮 蔣蕓 楊迪 詹曉北

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122）

隨著城市化提高和對空氣質(zhì)量的要求，許多城市對家庭和餐飲店油煙機(jī)尾氣排放提高要求。我國食用油在2016年消耗約3 000萬t，按照15%的排放量，則產(chǎn)生約450萬t地溝油，其中約30萬t來自清洗抽油煙機(jī)時倒入下水道產(chǎn)生的［1］。大量的抽油煙機(jī)廢油直接排入下水道，沒有適當(dāng)?shù)奶幚恚@對市政的生物廢水處理過程有較大負(fù)面影響。因此，抽油煙機(jī)廢油的回收和有效處置已經(jīng)成為迫切解決的問題。抽油煙機(jī)廢油的主要成分為順式、反式游離脂肪酸、脂肪甘油酯和鹽，能被銅綠假單胞桿菌利用生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂［2］。

生物表面活性劑（Biosurfactant）是一種天然的具有親水、親脂性質(zhì)的物質(zhì)，主要通過微生物發(fā)酵獲得，常見有鼠李糖脂、槐糖脂、脂肽、中性類脂衍生物或多糖脂等［3］，其中研究最早和最多的是銅綠假單胞菌所產(chǎn)生的鼠李糖脂［4］。鼠李糖脂是一種陰離子生物表面活性劑，其結(jié)構(gòu)由1-2個鼠李糖（親水基）鏈接1-2個飽和或不飽和的脂肪酸（疏水基）構(gòu)成［5］，主要通過假單胞菌、伯克氏菌、不動桿菌和腸動桿菌屬代謝產(chǎn)生，但是不同的菌株代謝活性差異較大，鼠李糖脂的產(chǎn)量、表面活性及同系物的組成也會有所不同［6-8］。鼠李糖脂在石油工業(yè)、日用化工、食品領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景，但鼠李糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)受限于較高的原料成本、泡沫控制成本和高昂的提取純化費(fèi)用。目前鼠李糖脂的發(fā)酵一般以油料為底物，如豆油［9］、棕櫚油［10］、玉米油［11］和葵花籽油［12］，其中以豆油為碳源生產(chǎn)的鼠李糖脂的產(chǎn)量可達(dá)70.6 g/L。但是以油料為底物存在發(fā)酵成本過高、產(chǎn)品提取純化工藝復(fù)雜的問題。近幾年來，尋找鼠李糖脂發(fā)酵的廉價替代碳源已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，如地溝油、植物油煉油廢棄物、工業(yè)廢棄脂肪酸［13］和廚房油炸剩下廢食用油［14-16］。此外，制造生物柴油的副產(chǎn)物甘油也可以應(yīng)用鼠李糖脂發(fā)酵，只是發(fā)酵周期比較長且泡沫難以控制［17］?？傮w來看，發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的原料占據(jù)較高成本，阻礙其大規(guī)模應(yīng)用。

目前很少有文獻(xiàn)和專利報道抽油煙機(jī)廢油再利用技術(shù)，相對簡單的利用有做肥皂［18］和固體酒精［19］，或作為增塑劑合成的原料［20］。本研究主要探討利用從中式抽油煙機(jī)收集的廢油脂為底物發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的可能性，旨在降低生產(chǎn)鼠李糖脂的成本，解決因抽煙機(jī)廢油直接倒入下水道所造成的環(huán)境污染問題。當(dāng)然，從分散的家庭中收集油煙機(jī)廢油所需成本較大，因此，在未來可以考慮特制簡易微好氧發(fā)酵系統(tǒng)用于家庭獨(dú)立發(fā)酵處理油煙機(jī)廢油，本研究前期測試表明這種微好氧系統(tǒng)可以正常利用油煙機(jī)廢油進(jìn)行鼠李糖脂發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 材料

以銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）WB505為出發(fā)菌體，保藏于江南大學(xué)生物工程學(xué)院生化工程研究室。

斜面培養(yǎng)基（g/L）：氯化鈉 5，酵母粉 5，胰蛋白胨 5，瓊脂 20，pH 7.0（滅菌前）。

種子培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基，g/L）：氯化鈉 5，酵母粉 5，胰蛋白胨 5，pH 7.0（滅菌前）。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：抽油煙機(jī)廢油 40，NaNO36，Na2HPO4·12H2O 1，KH2PO41，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.1，pH7.0（滅菌前）。

1.2 方法

1.2.1 鼠李糖脂的提取方法 發(fā)酵液于12 000 r/min離心，15 min后，取上清液調(diào)節(jié)pH為2.0，加入3倍體積的乙酸乙酯試劑萃取3次。收集有機(jī)相，于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙酸乙酯，即得到鼠李糖脂粗提液。

1.2.2 生物量的測定 取5.0 mL發(fā)酵液，于8 000 r/min離心15 min，去除上清液，并用去離子水清洗3次并放置在真空干燥箱，烘干至恒重，通過分析天平稱重并計算其生物量。

1.2.3 鼠李糖脂含量的測定 鼠李糖脂含量的測定采用蒽酮-硫酸法［21］。將粗提取的鼠李糖脂加蒸餾水復(fù)溶到合適的濃度，取1 mL復(fù)溶樣品加入5 mL蒽酮硫酸試劑，沸水浴15 min后，冷卻至室溫，測定OD620值，得到的鼠李糖含量乘以系數(shù)3即可得到鼠李糖脂含量。

1.2.4 臨界膠束濃度（CMC）的測定 用鉑金環(huán)法測定一系列不同濃度鼠李糖脂溶液的表面張力，以其濃度為橫坐標(biāo)，表面張力為縱坐標(biāo)繪制曲線，曲線的拐點(diǎn)處即為此體系中表面活性劑的CMC值［22］。

1.2.5 乳化能力（E24）的測定 在平底試管中加入2 mL的烷烴和鼠李糖脂溶液（1 g/L），混合液37℃預(yù)熱后高速漩渦震蕩2 min，乳化液37℃放置24 h后測定乳化相體積，并以乳化相體積與總體積比值（%）表示乳化能力［23］。

1.2.6 鼠李糖脂組成結(jié)構(gòu)的測定 本實(shí)驗(yàn)使用MALDI-TOF MS 分析發(fā)酵所得鼠李糖脂組成［24］。使用氮?dú)饧す獠ㄩL（337 nm），基質(zhì)為2，5-二羥基苯甲酸，控制軟件為flexControl，分析軟件為flexAnalysis versison 3.3，試驗(yàn)方法為RP200-1500（反射模式：正離子）。

2 結(jié)果

2.1 抽油煙機(jī)廢油濃度對發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的影響

在搖瓶中測試不同濃度抽油煙機(jī)廢油對P.aeruginosaWB505發(fā)酵鼠李糖脂的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)抽油煙機(jī)廢油為40 g/L時，鼠李糖脂的產(chǎn)量最大，可達(dá)到7.9±0.29 g/L。當(dāng)碳源繼續(xù)增加鼠李糖脂的產(chǎn)量下降，可能是碳源過量，形成油包水體系抑制菌體的代謝。

圖 1 抽油煙機(jī)廢油濃度對鼠李糖脂發(fā)酵的影響

2.2 NaNO3濃度對發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的影響

以40 g/L的抽油煙機(jī)廢油為碳源，研究不同NaNO3濃度對發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂的影響。從圖2可以看出，不同的NaNO3濃度對產(chǎn)鼠李糖脂有一定的影響，當(dāng)NaNO3濃度為6 g/L時，鼠李糖脂的產(chǎn)量最高，可達(dá)到8.5±0.24 g/L。隨后隨著NaNO3濃度的增大鼠李糖脂的產(chǎn)量在逐漸的降低。

圖 2 NaNO3濃度對鼠李糖脂發(fā)酵的影響

2.3 鼠李糖脂發(fā)酵的過程曲線

將培養(yǎng)好的種子按10%的接種量接入7 L的發(fā)酵罐中，過程曲線如圖3所示。菌體經(jīng)過短暫的停滯期，培養(yǎng)12 h后開始進(jìn)入對數(shù)生長期；隨著菌體的生長，發(fā)酵液的pH值開始降低并在生物量達(dá)到最大時降至最低，隨后又逐步增加并趨于穩(wěn)定，這可能與生長的過程有機(jī)酸產(chǎn)生有關(guān)。鼠李糖脂的生成與菌體的生長并不平行，鼠李糖脂的生成滯后于菌體生長，當(dāng)菌體進(jìn)入對數(shù)期時鼠李糖脂的增長速度較穩(wěn)定期和衰亡期緩慢，說明鼠李糖脂作為銅綠假單胞桿菌的次級代謝產(chǎn)物在穩(wěn)定期后生成速率最大，并在80 h達(dá)到最高12.3±0.52 g/L。發(fā)酵48 h之后，發(fā)酵液的上清液的表面張力由60.5±0.81 mN/m降至26.2±0.79 mN/m，之后表面張力有稍微的上升趨勢，但是基本趨于穩(wěn)定，說明此時上清液的濃度已達(dá)到其臨界膠束濃度。

圖 3 銅綠假單胞菌WB505發(fā)酵鼠李糖脂的過程曲線

2.4 鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)分析

微生物發(fā)酵生產(chǎn)所得到的鼠李糖脂通常以混合物形式存在。本實(shí)驗(yàn)中利用MALDI-TOF MS 確定鼠李糖脂混合物的組成并利用不同結(jié)構(gòu)鼠李糖脂的相對豐度估算其含量。從圖4中可以發(fā)現(xiàn)，鼠李糖脂在m/z為673.3有最高峰，代表雙鼠李糖脂Rha2-C10-C10的［M+Na］+加合離子。而單鼠李糖脂含量較高的峰出現(xiàn)在m/z 527.2處，對應(yīng)產(chǎn)物為Rha-C10-C10，最終得到的單鼠李糖脂和雙鼠李糖脂的主要成分、組成及相對豐度如圖4和表1所示。

圖4 銅綠假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂質(zhì)譜圖

表1 銅綠假單胞菌WB505利用油煙機(jī)廢油產(chǎn)鼠李糖脂的主要同系物分析

2.5 鼠李糖脂的臨界膠束濃度

隨著鼠李糖脂濃度的上升，溶液表面張力逐漸下降，當(dāng)表面張力下降到一定值后繼續(xù)增加鼠李糖脂濃度溶液表面張力也不再下降，說明此時已達(dá)到臨界膠束濃度。從圖5可以看出，以抽油煙機(jī)廢油為底物所產(chǎn)鼠李糖脂CMC為45.0 mg/L，能將其表面張力降低至25.3±0.68 mN/m。

圖5 銅綠假單胞菌所產(chǎn)生物表面活性劑CMC測定曲線

2.6 鼠李糖脂乳化性能

鼠李糖脂與實(shí)驗(yàn)中的幾種烴類物質(zhì)充分混合后形成乳白色的乳化液，剛開始乳化相體積并不穩(wěn)定，隨著時間的延長，乳化體積趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定時間大約是24 h。從圖6可以看出，鼠李糖脂對幾種常見的烴類物質(zhì)的乳化系數(shù)均超過了60%，其中對苯的乳化系數(shù)最高達(dá)到了80.3±0.85%，具有優(yōu)越的工業(yè)應(yīng)用價值。

圖6 銅綠假單胞菌發(fā)酵所產(chǎn)得鼠李糖脂對烴類物質(zhì)的乳化能力

3 討論

本研究從環(huán)保和低成本兩個角度考慮，首次以抽油煙機(jī)廢油為碳源生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂。抽油煙機(jī)廢油是油煙冷凝而成的，成分十分復(fù)雜，含有大量的固體物質(zhì)和雜質(zhì)。本研究采用過濾、離心等方法進(jìn)行處理，過濾后，于8 000 r/min離心15 min后取上清液即可去除固體物質(zhì)。廢油中主要含有一些醛類，烴類等致癌物質(zhì)，有害物質(zhì)對鼠李糖脂的發(fā)酵會產(chǎn)生很大的影響，通過研究發(fā)現(xiàn)可使用活性炭吸附去除部分有害物質(zhì)，有利于銅綠假單胞菌生長和鼠李糖脂發(fā)酵。Lotfabad等［25］研究不同碳氮源的濃度對鼠李糖脂的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C/N在1/10-1/30之間時，鼠李糖脂維持在較高的水平，而本實(shí)驗(yàn)分別以抽油煙機(jī)廢油和NaNO3為碳氮源且比例為3/20時鼠李糖脂的產(chǎn)量最高，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果也反映了銅綠假單胞菌產(chǎn)鼠李糖脂性能受菌株差異和培養(yǎng)條件的影響［26］。在7 L罐進(jìn)行小試，發(fā)酵80 h時鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)到最高，且pH上升，這可能是發(fā)酵后期培養(yǎng)基中氮源耗盡，細(xì)胞死亡釋放堿性物質(zhì)致使發(fā)酵液pH升高。

臨界膠束濃度（CMC）是表面活性劑分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度，是評價表面活性劑性能的一個重要指標(biāo)。臨界膠束濃度越低，說明該表面活性劑達(dá)到界面飽和吸附所需的濃度越低，因此較低濃度的該表面活性劑即能發(fā)揮其乳化、起泡、增溶、潤濕等表面活性作用。鼠李糖脂的臨界膠束濃度一般5 mg/L-200 mg/L［27］，發(fā)酵所產(chǎn)鼠李糖脂CMC為45.0 mg/L，能將其表面張力降低至25.3±0.68 mN/m，低的界面張力可以增加乳狀液的穩(wěn)定性［28］，從而間接的表明了所產(chǎn)鼠李糖脂的乳化能力增加。鼠李糖脂的臨界膠束濃度很大程度上取決于鼠李糖脂的組成，微生物發(fā)酵生產(chǎn)所得到的鼠李糖脂通常以混合物形式存在。鼠李糖脂混合物的組成對其性質(zhì)有很大的影響，組成上微小的變化也可能改變其理化性質(zhì)。如雙鼠李糖脂抑菌效果更好，而單鼠李糖脂的臨界膠束濃度更低［29］。并且鼠李糖脂的脂肪酸鏈越長其CMC越低，本實(shí)驗(yàn)獲得產(chǎn)物中單雙鼠李糖脂的比例接近1∶1，使其疏水性更強(qiáng)［30］，對于實(shí)際應(yīng)用更有意義。

4 結(jié)論

本研究驗(yàn)證了銅綠假單胞菌可以利用中式抽油煙機(jī)廢油合成生物表面活性劑鼠李糖脂，在培養(yǎng)基中加入40 g/L抽油煙機(jī)廢油和6 g/L NaNO3可以獲得較高鼠李糖脂產(chǎn)量，結(jié)構(gòu)分析表明其主要組成為含Rha-C10-C10和Rha2-C10-C10，鼠李糖脂同系物的結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報道相似，且具有良好的表面活性和乳化性。

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