董維鵬 王君實(shí) 張少華 燕炯

（山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，太原 030001）

1987年，日本微生物學(xué)家石野良純偶然間發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌中存在某種異常重復(fù)序列［1］，到2012年，Jinek 等［2］首次在體外用sgRNA（single guide RNA）引導(dǎo)Cas9（CRISPR-associated，Cas）蛋白對DNA進(jìn)行切割，證實(shí)采用規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的可行性，從此拉開了CRISPR/Cas9系統(tǒng)蓬勃發(fā)展的序幕。到今天為止，有關(guān)CRISPR/Cas9技術(shù)的研究越來越多，該系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、原理、功能已經(jīng)逐漸的清晰明了，其應(yīng)用也不僅局限在微生物，適用范圍已經(jīng)擴(kuò)展到植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)物基因組編輯等方面，而且在臨床上也已經(jīng)有了成功的案例。作為新一代的基因編輯工具，CRISPR/Cas9系統(tǒng)擁有其他編輯工具不可比擬的優(yōu)勢，其應(yīng)用范圍廣，經(jīng)濟(jì)可行，容易操作，有望成為未來主要的基因編輯工具。

1 CRISPR系統(tǒng)研究進(jìn)展

1.1 CRISPR系統(tǒng)的作用原理

CRISPR系統(tǒng)源自于細(xì)菌、古細(xì)菌，是原核生物中用來防御質(zhì)粒、病毒等核酸入侵而建立的自身免疫系統(tǒng)［3］。目前根據(jù)核酸剪切酶的功能和序列的不同將CRISPR系統(tǒng)分為不同亞型［4］，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的系統(tǒng)。在原核生物中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)由CRISPR基因座、Cas9蛋白和tracrRNA（Transactivating crRNA）構(gòu)成，其中CRISPR基因座由前導(dǎo)區(qū)序列（Leader）、串聯(lián)重復(fù)序列（Repeats）和間隔序列（Spacers）組成［5］。前導(dǎo)區(qū)序列長300-500 bp，位于基因座上游，該序列沒有開放閱讀框，且在同一物種間高度保守［6］；重復(fù)序列同樣高度保守，具有穩(wěn)定的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，長度一般在23-50 bp［7］；間隔序列是該系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的序列，它轉(zhuǎn)錄出一段crRNA（CRISPR-derived RNA），成熟的crRNA識(shí)別外源靶序列，引導(dǎo)具有切割活性的Cas9蛋白與外源靶序列結(jié)合發(fā)揮切割功能。tracrRNA是連接crRNA與Cas9蛋白的橋梁，使三者形成穩(wěn)定的復(fù)合體。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中Cas9蛋白是CRISPR系統(tǒng)中具有切割酶活性的蛋白［8］，它具有兩個(gè)核酸酶結(jié)合域，分別切割兩條DNA鏈，即HNH結(jié)構(gòu)域切割外源序列中crRNA的互補(bǔ)鏈，RuvC結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)鏈［9］，形成DNA雙鏈斷裂（Double strand break，DSB）［2］。當(dāng)外源核酸首次入侵時(shí)，細(xì)菌體識(shí)別外源核酸序列中一段特定的序列并整合為CRISPR基因座的間隔序列，當(dāng)質(zhì)?；虿《驹俅稳肭旨?xì)菌時(shí)，該間隔序列便會(huì)轉(zhuǎn)錄出一段crRNA，同時(shí)tracrRNA也被轉(zhuǎn)錄出來，與crRNA形成雙鏈RNA并連接到Cas9蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合體，通過crRNA識(shí)別外源核酸引導(dǎo)Cas9蛋白將外源基因敲除。

隨著CRISPR系統(tǒng)不斷的研究發(fā)展，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被廣泛應(yīng)用于真核生物中。在真核細(xì)胞應(yīng)用中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)由兩個(gè)關(guān)鍵元件組成，即識(shí)別靶基因的sgRNA與發(fā)揮切割酶活性的Cas9蛋白。sgRNA是由tracrRNA與gRNA結(jié)合成一條sgRNA，如圖1所示。在作用于基因時(shí)，首先sgRNA與靶基因互補(bǔ)配對引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶序列上，然后Cas9蛋白識(shí)別由NGG序列構(gòu)成的前間區(qū)序列鄰近基序（Protospacer adjacent motif，PAM），此時(shí)Cas9蛋白激活，將靶基因切斷。在真核細(xì)胞內(nèi)基因被Cas9蛋白破壞后會(huì)啟動(dòng)兩種修復(fù)途徑，即非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）與同源重組（Homologous-directed repair，HDR）修復(fù)，NHEJ修復(fù)途徑是直接將斷裂的雙鏈連接，這樣的修復(fù)方式會(huì)造成堿基的缺失，破壞基因開放閱讀框，使該基因發(fā)生移碼或無義突變，導(dǎo)致基因失活，實(shí)現(xiàn)基因敲除；HDR修復(fù)途徑則需要引入一條修復(fù)模板，該模板與DNA一條鏈連接，通過堿基互補(bǔ)配對便可以將模板整合到靶序列上，通過這種修復(fù)方式可以實(shí)現(xiàn)基因敲入［10］。目前CRISPR系統(tǒng)已經(jīng)在斑馬魚、小鼠、豬、擬南芥等多個(gè)物種間實(shí)現(xiàn)了基因編輯［11-13］。

1.2 單/多基因敲除與基因敲入

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對基因特異位點(diǎn)的切割，通過NHEJ修復(fù)途徑實(shí)現(xiàn)對位點(diǎn)基因的敲除，效率很高，是CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為基因修飾工具最廣泛的應(yīng)用。在實(shí)現(xiàn)基因敲除時(shí)只需要設(shè)計(jì)20 bp的sgRNA就可以實(shí)現(xiàn)對基因特異位點(diǎn)的切割，實(shí)現(xiàn)單基因敲除。此前利用單基因敲除已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對多個(gè)物種的基因編輯，包括哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠、豬等，甚至在靈長類動(dòng)物也有成功的報(bào)道［14］。

圖1 真核細(xì)胞中CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用原理

隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的迅速發(fā)展，學(xué)者發(fā)現(xiàn)該技術(shù)同樣可以用于多基因的敲除，只需要同時(shí)設(shè)計(jì)多條sgRNA，結(jié)合Cas9蛋白作用于細(xì)胞就可以實(shí)現(xiàn)多基因敲除。Manjunath等［15］指出在治療人類免疫缺陷病毒（HIV-1）感染時(shí)，利用CRISPR技術(shù)在體外將HIV-1的宿主細(xì)胞輔助受體CCR5或CXCR4基因敲除，再將CCR5或CXCR4基因敲除的造血干細(xì)胞回輸給該患者，這些輸送回體內(nèi)的骨髓干細(xì)胞便可以分化產(chǎn)生抵抗HIV-1感染的CD4+T細(xì)胞。另外，Khalili等［16］也實(shí)現(xiàn)了另一個(gè)治療方法：設(shè)計(jì)建靶向HIV-1的LTR 基因sgRNA，建立穩(wěn)定的sgRNA/Cas9細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系可以對抗新的HIV-1感染，并且能夠快速地阻止HIV-1基因整合到宿主基因組。這些CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用充分體現(xiàn)出它在基因敲除時(shí)發(fā)揮的重要作用以及為某些傳染病、遺傳病等疾病的治療提供更加便捷的技術(shù)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為“全能”的基因編輯技術(shù)，在定點(diǎn)基因敲入方面也展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。這種基因敲入的方式所利用的是同源重組（HDR）修復(fù)方式，同源重組在基因修復(fù)中的發(fā)生率很低，但通過CRISPR/Cas9技術(shù)誘發(fā)DNA雙鏈斷裂可以明顯提高同源重組反應(yīng)發(fā)生的概率，在Cas9蛋白切割的同時(shí)導(dǎo)入一段兩側(cè)與內(nèi)源基因相似或相同的外源基因，便能夠把該外源基因?qū)牖蚪M。2013年，Mali 等［17］利用改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功激活細(xì)胞HDR修復(fù)途徑，實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)插入。之后Ma等［18］在Mecp2基因中敲入了兩個(gè)loxp位點(diǎn)，成功構(gòu)建了條件敲除大鼠。目前利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞水平基因敲入，但動(dòng)物水平的成功報(bào)導(dǎo)并不多，特別是豬等大型動(dòng)物，對于基因敲入的轉(zhuǎn)入效率有待進(jìn)一步研究。

1.3 基于CRISPR系統(tǒng)的基因調(diào)控

CRISPR/Cas9系統(tǒng)近幾年備受關(guān)注，發(fā)展至今已形成諸多成熟的應(yīng)用技術(shù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因調(diào)控通過干預(yù)Cas9蛋白，使其兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域失去切割酶的活性，這樣的Cas9蛋白稱為dCas9（dead Cas9）蛋白。雖然該蛋白不能切割DNA鏈，但仍然能夠結(jié)合到靶位點(diǎn)，通過空間位阻效應(yīng)阻礙RNA聚合酶的結(jié)合與延伸。Qi等［19］研究表明，采用dCas9系統(tǒng)在處理細(xì)胞時(shí)，dCas9蛋白與靶基因結(jié)合，可以阻礙靶序列的轉(zhuǎn)錄達(dá)到基因沉默的效果。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，若設(shè)計(jì)的sgRNA特異性較弱容易發(fā)生錯(cuò)配，會(huì)使Cas9蛋白切割靶序列以外的基因，對基因組造成不可逆損傷。而dCas9蛋白并不發(fā)揮切割酶活性，不會(huì)影響基因組結(jié)構(gòu)，并且在研究中發(fā)現(xiàn)dCas9蛋白與作用靶點(diǎn)結(jié)合的過程是可逆的，當(dāng)移除dCas9蛋白后，靶序列的基因功能可以恢復(fù)［20］。

在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控需要多個(gè)調(diào)控因子共同作用，調(diào)節(jié)途徑比較復(fù)雜，學(xué)者以tracrRNA的莖環(huán)或者dCas9蛋白為媒介連接轉(zhuǎn)錄激活因子或者轉(zhuǎn)錄抑制的功能蛋白，建立了CRISPR激活（CRISPRa）與 CRISPR 抑制（CRISPRi）。KRAB（Krüppel-associated box）是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子［21］，Parsi等［22］將dCas9蛋白與轉(zhuǎn)錄抑制因子KRAB連接，形成dCas9-KRAB復(fù)合體，成功應(yīng)用在人體胚胎干細(xì)胞中抑制蛋白的表達(dá)。Maeder 等［23］將dCas9蛋白與轉(zhuǎn)錄激活因子VP16連接，應(yīng)用于人類細(xì)胞成功促進(jìn)人類細(xì)胞VEGFA and NTF3基因的轉(zhuǎn)錄。如果將sgRNA作為一個(gè)基因定位的工具，dCas9蛋白作為連接蛋白的橋梁，便可以連接與基因相關(guān)的功能蛋白作用于目標(biāo)序列，從而研究蛋白對基因調(diào)控的影響，有效地促進(jìn)基因與蛋白相互關(guān)系的研究進(jìn)展。

1.4 脫靶效應(yīng)改善措施

CRISPR/Cas9系統(tǒng)最大的不足便是脫靶效應(yīng)（Off-target effects），指Cas9蛋白除了切割靶序列以外，還作用于與靶序列相似的其他序列。sgRNA定位靶序列時(shí)允許最多3個(gè)堿基的錯(cuò)配，甚至當(dāng)序列長度不等于20 bp時(shí)也可能發(fā)生錯(cuò)配，其中PAM序列對堿基錯(cuò)配的影響最大，遠(yuǎn)PAM端的堿基突變比近PAM端的堿基突變更易發(fā)生堿基錯(cuò)配導(dǎo)致脫靶［24］。為了減少脫靶效應(yīng)研究人員采取了很多改善方法，如雙切酶（Double-nickase）措施策略。Trevino 等［25］從Cas9蛋白入手，保持sgRNA功能結(jié)構(gòu)不變，使Cas9蛋白的某一個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域失活。在切割DNA鏈時(shí)，Cas9蛋白只能在sgRNA互補(bǔ)的DNA鏈上產(chǎn)生缺口。在該系統(tǒng)中，需要在靶基因的兩條鏈上分別設(shè)計(jì)sgRNA，且兩個(gè)切割位點(diǎn)靠得越近，DNA雙鏈斷裂的機(jī)會(huì)越大。雙切口酶策略需要兩條sgRNA同時(shí)與靶序列堿基配對才能產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，這樣便極大的增加了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，減少脫靶效應(yīng)的發(fā)生。另一種減少脫靶效應(yīng)的策略是將dCas9蛋白與FokⅠ核酸酶結(jié)合，形成融合蛋白，利用FokⅠ核酸酶切割DNA鏈的特性，即只有當(dāng)兩個(gè)FokⅠ核酸酶靠近形成二聚體時(shí)，才會(huì)發(fā)揮切割酶的活性。在應(yīng)用時(shí)，同樣需要在靶序列附近設(shè)計(jì)一對sgRNA，sgRNA引導(dǎo)dCas9-FokⅠ融合蛋白在靶序列附近形成二聚體，切割雙鏈DNA，實(shí)現(xiàn)基因敲除。只有當(dāng)兩條sgRNA分別與靶序列結(jié)合時(shí)才能發(fā)揮剪切酶的活性，極大的降低脫靶效應(yīng)的發(fā)生，其效率可達(dá)90%以上［26-27］。

1.5 Cas9蛋白加工修飾

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由sgRNA與Cas9蛋白發(fā)揮作用，sgRNA作為精確的定位元件，保證該復(fù)合體準(zhǔn)確定位到靶序列，Cas9蛋白作用于靶序列發(fā)揮功能蛋白的作用。學(xué)者將目光聚焦在Cas9蛋白上，通過替換Cas9蛋白或者加工修飾，從而優(yōu)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)。Zetsche等［28］將Cas9蛋白替換成Cpf1蛋白，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)屬于II型CRISPR家族，Cpf1 行使核酸酶活性只需要1條gRNA，并不需要tracrRNA的輔助，而且Cpf1切割DNA后形成5'黏性末端，更適用于基因修飾，目前Cpf1已廣泛應(yīng)用于在哺乳動(dòng)物的基因修飾。CRISPR/saCas9系統(tǒng)則適用于腺相關(guān)（AAV）病毒，它與CRISPR/Cas9系統(tǒng)擁有不同的PAM序列，以腺病毒為載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)采用saCas9蛋白切割靶序列效果較好［29］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)采用sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白準(zhǔn)確定位到靶序列上，實(shí)現(xiàn)對基因的修飾，這種特性使得該技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用充滿了無限的可能性，也為蛋白與基因的研究提供了更多的思路。

1.6 基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的臨床應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為第三代基因編輯工具，簡潔的在線設(shè)計(jì)，簡便的實(shí)驗(yàn)操作，作用于靶基因切割作用強(qiáng)，目前多個(gè)實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)將其作為基因編輯工具應(yīng)用于臨床研究并取得成功。張鋒團(tuán)隊(duì)開發(fā) 出 SHERLOCK（Specific high sensitivity enzymatic reporter UnLOCKing），它由gRNA與Cas13a蛋白組成，且有一個(gè)特點(diǎn)即當(dāng)Cas13a蛋白切開特異RNA后，就開始瘋狂切開它能遇到的任何RNA，利用這一特性。研究人員將該系統(tǒng)用于核酸檢測，在不同的病毒上測試了它的特異性，靈敏度可達(dá)阿摩爾級。之后研究人員又把該系統(tǒng)應(yīng)用于檢測癌癥突變，該系統(tǒng)同樣以阿摩爾級的靈敏度識(shí)別出腫瘤的特有突變［30］。利用該系統(tǒng)的高靈敏度，鑒定人類基因組中多個(gè)單核苷酸多態(tài)性以及對于各種疾病病原體的檢測等都會(huì)有很高的應(yīng)用價(jià)值。該系統(tǒng)無論對于科學(xué)還是臨床醫(yī)學(xué)都是很強(qiáng)大的工具，其研究與應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，不僅對臨床多種疾病的診斷會(huì)有很大的幫助，而且會(huì)在藥物的開發(fā)中發(fā)揮重要作用。

2 CRISPR系統(tǒng)在小鼠中的應(yīng)用

2013年， 張 鋒 等（Wang）［13］利 用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)首次實(shí)現(xiàn)對小鼠基因的編輯，并且是多基因同時(shí)敲除。從此開啟了采用CRISPR/Cas9定點(diǎn)編輯基因技術(shù)作用于小鼠基因組的研究。之后沈彬通過在Cas9和核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）之間加一個(gè)32個(gè)氨基酸的Linker，解決了Cas9在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中入核難的問題，并在EGFP基因上設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，共注射Cas9和sgRNA后成功敲除了小鼠的EGFP基因［31］。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行單/多基因位點(diǎn)同時(shí)敲除獲得突變小鼠，為利用CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于小鼠的研究奠定了基礎(chǔ)。

2.1 建立動(dòng)物模型

目前小鼠已成為各個(gè)實(shí)驗(yàn)室哺乳動(dòng)物研究的首選物種，基因突變小鼠作為遺傳學(xué)研究的重要工具，在基因功能和遺傳病的研究中扮演重要角色。之前通過靶向基因插入的方法獲取轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型費(fèi)時(shí)費(fèi)力，很大程度上限制了遺傳學(xué)研究的發(fā)展。利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因突變小鼠模型操作簡便，耗時(shí)短，極大地加快了遺傳學(xué)研究的進(jìn)展［13］。癌癥是目前醫(yī)學(xué)面臨的重要難題，癌癥基因組項(xiàng)目已證實(shí)癌癥的發(fā)生伴隨著癌癥相關(guān)基因的突變。在CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)之前要獲得突變模型需要耗費(fèi)大量的時(shí)間，致使癌癥基因的研究緩慢。Xue 等和Lawrence利用CRISPR/Cas9技術(shù)針對肝臟的腫瘤抑制基因p10和p53，構(gòu)建該目的基因的CRISPR/Cas9的表達(dá)質(zhì)粒，利用立體動(dòng)力注入法將質(zhì)粒傳遞到肝臟組織，成功抑制了抑癌基因的表達(dá)，為肝癌研究奠定了基礎(chǔ)［32-33］。另外染色體重排也是引起癌癥的又一個(gè)主要原因［34］，Maddalo等［35］采用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計(jì)克隆的亞基因組靶向EML4和ALK位點(diǎn)sgRNA/Cas9，用腺病毒作為載體，高效感染成年小鼠肺上皮細(xì)胞，生成EML4-ALK 肺癌小鼠模型，為人類癌癥基因工程小鼠癌癥模型的構(gòu)建提供了新的技術(shù)，為剖析相關(guān)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，研究藥物的敏感性和耐藥性提供了強(qiáng)大的基礎(chǔ)平臺(tái)。此外，汪啟翰等［36］也利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建血友病小鼠模型，在小鼠FⅨ基因設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)sgRNA，并與體外轉(zhuǎn)錄Cas9mRNA同時(shí)顯微注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵，獲得突變小鼠，突變率高達(dá)85%，且突變具有可遺傳性，并證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠高效地進(jìn)行基因編輯。

2.2 疾病治療

為了研究這項(xiàng)技術(shù)在疾病治療中是否可以發(fā)揮作用，Wu等［37］選擇小鼠白內(nèi)障遺傳疾病模型的突變基因，設(shè)計(jì)了該基因的sgRNA，與Cas9共注射到突變小鼠的受精卵中，在F1代小鼠的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)l/3的小鼠的白內(nèi)障癥狀得到治愈，并且可以穩(wěn)定傳遞給下一代，說明CRISPR/Cas9技術(shù)對小鼠白內(nèi)障的治療有效。該技術(shù)還被應(yīng)用于病毒感染性疾病的治療：全球超過兩億多的乙肝病毒感染者，由于缺乏治療嚴(yán)重影響了這些人的生活。目前臨床上采用清除感染者肝細(xì)胞內(nèi)的HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）作為治愈慢性乙型肝炎的關(guān)鍵。Kennedy等［38］采用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計(jì)靶向Cas9/sgRNA復(fù)合體作用HBV感染的細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該復(fù)合體有效地抑制HBVcccDNA的形成、降低乙肝表面抗原分泌、使乙型肝炎病毒突變失活以及減少抗原的分泌和病毒的復(fù)制和感染，導(dǎo)致cccDNA HepaRG細(xì)胞退化。

3 展望

CRISPR系統(tǒng)作為第三代基因編輯工具，從DNA識(shí)別到實(shí)現(xiàn)靶序列敲除與敲入，從作用原理到應(yīng)用，從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到敲除效率均要優(yōu)于鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技術(shù)，有望成為未來的主要基因編輯工具，正如該技術(shù)開發(fā)人員所說：“CRISPR技術(shù)的應(yīng)用僅僅受我們想象力的約束。”

該技術(shù)最大的缺點(diǎn)就是脫靶效應(yīng)，對于不同的物種，脫靶率也不一樣，需要找出導(dǎo)致脫靶的原因，如何讓Cas9蛋白準(zhǔn)確的切割靶序列，減少脫靶效率是該技術(shù)應(yīng)用面臨的主要難題。CRISPR系統(tǒng)作為一種基因編輯的工具，對于其機(jī)制的研究正在不斷的深入，應(yīng)用范圍也在不斷的擴(kuò)展，包括CRISPR/C2c2、SGN等工具都是適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)條件發(fā)展而來的基因編輯技術(shù)。利用CRISPR系統(tǒng)基因編輯的強(qiáng)大技術(shù)，可以為基因的功能、調(diào)控方式，以及對于蛋白質(zhì)作用機(jī)制的研究提供更加便捷的手段。目前，對于CRISPR系統(tǒng)的機(jī)制研究目前仍處于基礎(chǔ)階段，應(yīng)用范圍也有待不斷深入。例如，TypeⅠ CRISPR系統(tǒng)與TypeⅢ CRISPR系統(tǒng)的作用機(jī)制理論報(bào)導(dǎo)并不多，另外利用CRISPR系統(tǒng)基因編輯的功能應(yīng)用于基因改造的研究也處于起步階段，如何更好的發(fā)揮CRISPR系統(tǒng)的作用還有待進(jìn)一步的研究，以及對于目前臨床難以治愈的遺傳性疾病、病毒性疾病等方面探索新的治療方法，實(shí)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)從實(shí)驗(yàn)室到臨床應(yīng)用，目前的報(bào)導(dǎo)并不多，這也有待于學(xué)者進(jìn)一步的改進(jìn)CRISPR系統(tǒng)的安全性與實(shí)用性?？傊?，CRISPR系統(tǒng)目前已經(jīng)在分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮了巨大的作用，但是CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用還需不斷地深入探索，其潛力仍需進(jìn)一步的開發(fā)。

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