李 品,馮兆忠,*,尚 博,袁相洋,代碌碌,徐彥森

1 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心 城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室,北京 100085 2 中國科學院大學資源環(huán)境學院,北京 101408

地表臭氧(O3)主要由氮氧化物(NOx)和揮發(fā)性有機化合物(VOCs)等前體物經光化學反應生成,是一種具有極強氧化毒性作用的二次污染物和重要的溫室氣體[1]。隨著我國工業(yè)化與城市化進程的加快,NOx和VOCs等前體物顯著增加[2],地表O3濃度也不斷升高。根據環(huán)保部網站監(jiān)測數據顯示,O3正在成為我國主要城市夏季的首要空氣污染物,其中夏季小時平均O3濃度高達300nmol/mol以上,年均最大O3濃度達到60nmol/mol[3- 4],遠超過敏感樹種的受害臨界負荷[5],對樹木生長和森林生態(tài)系統(tǒng)服務功能產生嚴重威脅[6]。

城市樹木在維持城市生態(tài)平衡,改善和緩解城市生態(tài)環(huán)境問題等方面起著無可替代的重要作用。但隨著O3濃度的升高,研究發(fā)現(xiàn)暴露在O3下的樹木出現(xiàn)一系列的傷害表征,如葉片出現(xiàn)缺綠斑、變黃、早衰、脫落等可見傷害癥狀[7- 9],光合速率降低[10- 12],氣孔反應滯后甚至失靈[13- 14],水分消耗量增加[14- 15],樹木生物量降低[16],改變生物量分配格局[11]和樹木對病蟲害以及環(huán)境脅迫的抵御能力[17],從而降低城市樹木作為“碳匯”和“清潔工”改善生態(tài)環(huán)境問題的潛力[18- 19]。

植物氣孔是進行光合作用和蒸騰作用等氣體交換的重要調控器官,其氣孔特征(數量、密度、開度、大小等)的變化體現(xiàn)了對環(huán)境變化及逆境脅迫響應與適應的結果。O3作為逆境脅迫因子,通過氣孔進入植物體內,氣孔特征決定了O3的進入量[20],也是評價O3對植物傷害的關鍵因素[21]。目前,高濃度O3對城市綠化樹種的葉片氣孔數量特征影響的研究有一些報道[22- 25],得出有差異的結論：高濃度O3處理顯著降低葉片氣孔開度和大小,但對氣孔密度沒有顯著影響[22, 24]或者增加了氣孔密度[23, 25]。以上研究都是基于單個樹種單一O3升高濃度的熏蒸結果,由于基于不同的樹種、O3濃度和實驗持續(xù)期,很難評價O3對植物氣孔特征的影響以及對植物產生的定量傷害。目前,根據不同濃度梯度的O3與植物生理指標、生物量、產量、可見傷害癥狀等建立劑量響應關系[16, 26],從而定量評價O3對植物的傷害,是有效可行的方法。考慮到樹木生產緩慢,若干年后收獲生物量來評估在實際過程中很難實現(xiàn)。而根據生理指標,特別是敏感性的指標——氣孔特征,進行相應的O3劑量關系研究,尚未見報道。本實驗選取的6種樹種,作為城市行道木、風景園林綠化、防護林體系構成在北方地區(qū)廣泛栽種。通過研究不同O3濃度脅迫對這6種城市綠化樹種葉片氣孔的影響效應,并根據O3濃度梯度下氣孔特征指標的響應,建立O3濃度與氣孔指標的劑量關系,以期為地表O3污染下篩選抗污染的樹種及保護城市綠化樹木少受O3傷害提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

實驗區(qū)位于北京市延慶區(qū)延慶鎮(zhèn)唐家堡村(40°45′N, 115°97′E),在北京市區(qū)的東北方向,屬大陸性季風氣候,是溫帶與中溫帶、半干旱與半濕潤帶的過渡連帶。氣候冬冷夏涼,年平均氣溫10.2℃,夏季平均氣溫22—25℃,年降水量567mm,年平均日照2800h。

1.2 實驗設計

實驗選用6種城市綠化樹種的一年生幼苗：2種不同基因型的楊樹‘546’(Populusdeltoidescv. ‘55/56’ ×P.deltoidescv. ‘Imperial’)和‘107’(P.euramericanacv. ‘74/76’)、白蠟(Fraxinuschinensis)、法桐(Platanusorientalis)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、國槐(Sophorajaponica)。2016年4月10日將長勢較為一致的幼苗統(tǒng)一移入20L的圓形花盆中,用當地土壤與購買的草炭土按體積比3∶1混勻后裝盆作為栽培基質。待移植兩周后,選擇樹高和基徑相差不大的幼苗,移入開頂式氣室(OTCs)中,每間隔1—2d澆水,以適應氣室內環(huán)境。10d后進行O3熏蒸處理。

本實驗在15個OTC中進行O3熏氣,OTC為高3.0m,邊長1.0m的正八面柱體。實驗共設5個處理：CF(過濾大氣,charcoal filtered ambient air,[O3]<40nmol/mol),NF(環(huán)境大氣[O3])、NF20(NF+20nmol/mol[O3])、NF40(NF+40nmol/mol[O3])、NF60(NF+60nmol/mol [O3])。每個處理有3個OTC重復,每個OTC內每種樹5—6盆,并隨機分布。實驗期間各個罩子的O3濃度由美國熱電公司49i臭氧分析儀監(jiān)測(Model 49i; Thermo Scientific, Franklin, MA, USA),熏氣時間從2016年6月26日到9月30日,持續(xù)96d,每天熏氣時間為10h(08:00—18:00),陰雨天停止熏氣。每個OTC外面和內部的溫度和濕度由CR1000數據記錄器監(jiān)測(Campbell Scientific, North Logan, Utah, USA),每5min記錄一次。在整個熏氣期間,OTC內部的溫度比外面環(huán)境平均高1.7℃,濕度平均低4.5%。分別于8月中上旬(生長旺期)和9月中下旬(生長末期),分兩次進行取樣測定指標。所有樹種在取樣時的實驗期間小時O3濃度超過40nmol/mol的累計值(AOT40,the accumulated hourly mean O3concentration over a threshold of 40nmol/mol)詳見表1。

表1 6種樹種2次取樣時的AOT40值

1.3 指標測定

在8月中上旬(生長旺期)和9月中下旬(生長末期)兩個時間段,分別在每個OTC中選擇每種樹苗3盆,于9:00—11:00間采集中上部(從頂端數第5—8片)陽生葉片,用指甲油印跡法進行取樣：輕拭葉片表面灰塵,選擇葉片遠軸面中部靠近葉脈部位,均勻涂上無色指甲油,將其自然晾干,用鑷子撕下已干的指甲油薄膜層,制作裝片進行顯微鏡觀察和測量[27- 28]。

用Dino-Lite AM7013MZT4(R4)顯微鏡照相儀拍照,用DinoCapture 2.0軟件計算每幅圖片上選定的1mm2視野面積中的氣孔個數(單位面積植物葉片包含的氣孔數目),即為氣孔密度(氣孔數/mm2)。隨機選取每幅圖片上完整清晰的10個氣孔,用測微尺測量氣孔長度、寬度,氣孔長度為平行于氣孔器的最長值,氣孔寬度為垂直于氣孔器的最寬值。計算氣孔開度(氣孔開度=πab,其中a表示1/2氣孔長度,b表示1/2氣孔寬度)和氣孔大小(氣孔大小=氣孔長度×氣孔寬度),然后取10個氣孔的平均值作為這幅圖片上氣孔特征的值。

1.4 數據分析

實驗數據按OTC為重復單元(n=3)。運用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析,選擇Tukey′s Honestly Significant Difference (HSD) 檢驗法分析被測指標在不同O3濃度之間的差異,并選擇一般線性模型(General Linear Model)將O3處理、采樣時間與樹種進行多因素方差分析。文中數據為平均值±標準差(Mean±SD)。運用Sigmaplot 10.0繪制氣孔特征指標與AOT40的線性關系圖(普通最小二乘法),并用Spearman′s相關關系檢驗線性關系的顯著性。圖中實線代表線性擬合關系顯著(P<0.05),虛線代表不顯著(P>0.05)。

2 結果與分析

2.1 O3濃度升高對氣孔密度的影響

三因素方差分析結果表明(表2),O3處理、樹種之間以及O3和樹種的交互作用對氣孔密度的影響均有顯著性差異；采樣時期對氣孔密度的影響不顯著(P=0.1498),但采樣時期與樹種的交互作用對氣孔密度的影響是顯著的。具體來講,隨著O3濃度的升高,6種樹種的氣孔密度在兩個時期均呈顯著的線性下降趨勢(P<0.05),且8月份的下降斜率均大于9月份(表3和圖1)。與CF相比,O3濃度升高至NF20已引起6種樹的氣孔密度普遍降低(圖2)；NF60處理下楊樹546、楊樹107、白蠟、法桐、洋槐和國槐的氣孔密度與CF相比在生長旺期(8月份)分別降低26%、41%、39%、55%、43%和22%,在生長末期(9月份)分別降低14%、31%、35%、50%、40%和14%(圖2)。其中,楊樹546和法桐的氣孔密度在兩個采樣時期呈現(xiàn)顯著差異(P<0.001),在未受O3熏蒸的CF中,楊樹546和法桐的氣孔密度隨著生長進入末期分別下降17%和14%(圖2)；并且楊樹546出現(xiàn)O3與采樣時期的交互作用。

表2O3處理、采樣時間與樹種的交互作用對氣孔密度、氣孔開度和氣孔大小的影響的方差分析

Table2ANOVAresults(Pvalues)formaineffectsandinteractionsofO3treatment(CF, NF, NF20, NF40, and NF60),samplingtime(August and September)andsixtreespeciesonstomataldensity,stomatalapertureandstomatalsize

變量 Parameters氣孔密度Stomatal density氣孔開度Stomatal aperture氣孔大小Stomatal sizeO3 Ozone<0.0001<0.0001<0.0001采樣時期 Sampling time0.1498<0.0001<0.0001樹種Tree species<0.0001<0.0001<0.0001O3×采樣時期Ozone×sampling time0.20390.06600.0070O3×樹種Ozone×tree species<0.0001<0.0001<0.0001采樣時期×樹種Sampling time×tree species<0.0001<0.0001<0.0001O3×采樣時期×樹種Ozone×sampling time×tree species0.40660.0519<0.0001

2.2 O3濃度升高對氣孔開度的影響

方差分析結果表明,O3處理、樹種之間、采樣時期均顯著影響了氣孔開度,其中O3處理與樹種之間、采樣時期與樹種之間表現(xiàn)出顯著的交互作用(表2)。隨著O3濃度的升高,6種樹種的氣孔開度在兩個時期均呈現(xiàn)顯著的線性下降趨勢(P<0.05),且8月份的下降斜率大于9月份的(表3和圖3)。具體來看(圖4),O3處理顯著影響了每種樹種的氣孔開度,但采樣時期僅對楊樹546和白蠟呈顯著影響；并且在白蠟、法桐和國槐中出現(xiàn)O3與采樣時期的交互作用。與CF相比,O3濃度為環(huán)境濃度(即NF,AOT40在8.3—11.4μmol/mol之間,表1)時,白蠟、法桐、洋槐和國槐的氣孔開度已顯著降低(圖2)。

2.3 O3濃度升高對氣孔大小的影響

三因素方差分析結果表明(表2),O3處理、樹種之間、采樣時期以及兩兩交互作用、三個因素交互作用對6種樹種的氣孔大小均有極顯著的影響(P<0.01,表2)。從圖5中可知,隨著O3濃度升高,所有6種樹種在2個時期的氣孔大小均呈現(xiàn)顯著線性下降(除了楊樹兩個基因型品種546和107在9月份的趨勢不顯著外),同樣8月份的下降斜率均大于9月份(表3和圖5)。O3處理、采樣時期以及二者的交互作用對楊樹546、白蠟、法桐和國槐的氣孔大小有顯著影響,但楊樹107和洋槐的氣孔大小僅受O3處理的影響(圖6)。

表3 不同O3處理下6種樹種2個時期的氣孔密度、氣孔開度、氣孔大小與AOT40的線性關系

圖1 不同O3處理下6種樹種在2個采樣時期的氣孔密度的變化Fig.1 Ozone exposure-response relationships with stomatal density for six tree species at two sampling times (August and September)

圖2 不同O3處理下6種樹種2個采樣時期的氣孔密度差異比較Fig.2 The six tree species comparison of stomatal density (mean±S.D., n=3) across different O3 treatments at two sampling times (August and September)不同小寫字母間表示差異顯著

圖3 不同O3處理下6種樹種在2個采樣時期的氣孔開度的變化Fig.3 Ozone exposure-response relationships with stomatal aperture for six tree species at two sampling times (August and September)

圖4 不同O3處理下6種樹種2個采樣時期的氣孔開度差異比較Fig.4 The six tree species comparison of stomatal aperture (mean±S.D., n=3) across different O3 treatments at two sampling times (August and September). Different lowercase letters denote significant difference among the bars in each panel

圖5 不同O3處理下6種樹種在2個采樣時期氣孔大小的變化Fig.5 Ozone exposure-response relationships with stomatal size for six tree species at two sampling times (August and September)

圖6 不同O3處理下6種樹種2個采樣時期氣孔大小的差異比較Fig.6 The six tree species comparison of stomatal size (mean±S.D., n=3) across different O3 treatments at two sampling times (August and September). Different lowercase letters denote significant difference among the bars in each panel

3 討論

植物葉片上的氣孔數量、大小和功能等屬性對環(huán)境變化十分敏感[29- 30]。O3對植物的影響是一個累積的過程,隨著時間的延長,O3脅迫對葉片氣孔屬性的損害會不斷加深[31- 32]。本研究發(fā)現(xiàn),隨著O3濃度的不斷增加和熏蒸時間的持續(xù),6種樹種葉片氣孔密度、開度和大小都不同程度的顯著減小。這些都表明O3脅迫對這些樹種葉片氣孔影響具有累積效應。當O3累積吸收量超過自身解毒和修復能力時,氣孔結構受損,發(fā)育受到影響[25],導致氣孔密度、開度和大小呈現(xiàn)顯著變化。氣孔數變少、氣孔變小,開張度變小,很可能是植物為了適應不斷升高的O3環(huán)境而迅速做出的反應(馴化作用)。雖然這些變化不利于植物吸收CO2進行光合作用固定生物量,但這可能是植物在脅迫環(huán)境下把更多資源分配給維持性存活而不是生長性存活的一種權衡(trade-off)策略,也即在高濃度O3脅迫下抑制了氣孔的生長發(fā)育。

本研究中O3脅迫減少氣孔密度,與前人的研究結果不一致。徐文鐸等[22]對4年生銀杏葉片研究發(fā)現(xiàn),高濃度O3使氣孔密度下降,但未達到顯著水平(P>0.05)；李梅等[24]發(fā)現(xiàn)高濃度O3熏蒸下1年生水蠟葉片的氣孔密度變化不顯著；文志等[23]發(fā)現(xiàn)O3脅迫62天和110天,1年生元寶楓葉片的氣孔密度都顯著增加。付偉等[25]發(fā)現(xiàn)高濃度O3熏蒸顯著增加了4年生黃檗葉片的氣孔密度。相關研究結果存在較大差異,可能與受O3熏蒸的時間和濃度影響、樹種、以及葉發(fā)育階段有關。在葉片形態(tài)學上,氣孔產生和形成是在葉片發(fā)育早期[33- 34],O3濃度變化對處于發(fā)育早起葉片的氣孔數量影響較大,成年葉片氣孔數目除受環(huán)境因素影響外,還受遺傳基因的控制。目前以上研究都是基于人工控制OTC中的短期觀測O3增加對氣孔參數的影響,這不一定反應植物在長期進化過程中對環(huán)境脅迫的適應。對于4年生的銀杏成年葉片來說,即使成年葉片氣孔數量基本形成,O3脅迫仍在一定程度上使氣孔數量和密度有所下降[22],這可能是由于高濃度O3傷害了氣孔器細胞,也破壞表皮細胞的發(fā)生,因此氣孔數量和密度有所降低[22]。因此,開展長期的實驗有助于研究葉片生長發(fā)育階段下氣孔參數對O3濃度增加的響應這一較復雜的問題。

氣孔大小、氣孔開度決定了進入植物體內O3的量。氣孔越大,開度越大,O3進入量越多。本研究中O3脅迫減少了氣孔開度和氣孔大小,與前人的研究結果一致[11, 22- 25, 35]。但也有結果發(fā)現(xiàn),由于O3導致氣孔反應滯后(sluggishness)甚至失靈[21, 35- 36],使氣孔面對脅迫時無法快速做出應激性的關閉反應來減少O3攝入量,從而降低O3對自身的傷害。這與不同樹種對O3敏感性差異有關,相對敏感的樹種很可能在相同的O3濃度下自身的解毒防御系統(tǒng)已經崩潰,保衛(wèi)細胞作用失效從而使氣孔無法關閉,增大了氣孔開度。本研究的6種樹種在持續(xù)的不同O3濃度熏蒸下氣孔開度都減小,并隨著O3劑量的增加,減小增加,這可能是氣孔對環(huán)境做出的一種適應調節(jié)反應。

本研究發(fā)現(xiàn)O3處理與樹種之間、采樣時期與樹種之間在氣孔密度、開度和大小屬性間都存在顯著交互效應(表2)。由于每種樹種固有的氣孔屬性本身有很大差別(見圖2、4、6中CF的對照數值)；并且隨著生長期的持續(xù),固有氣孔屬性會隨著環(huán)境變化和內在物候期而發(fā)生變化[29- 30],因此表現(xiàn)出樹種與采樣時期之間存在顯著交互效應。另外,樹種對O3的敏感性具有種屬特異性[7, 9, 26],越敏感的樹種會越早做出生理生態(tài)(光合生理、水分生理等)的響應變化[26]；本研究設置了5種O3濃度梯度,從每種樹種的AOT40值來看(表1),這6種樹種的敏感性排序從高到低為：楊樹546>楊樹107>法桐>白蠟>洋槐>國槐,這與其他研究中的敏感性結果一致[9, 12, 16]。因此,隨著O3濃度的升高,不同敏感性樹種的氣孔屬性做出響應的時間和O3劑量不同,表現(xiàn)出樹種與O3處理(不同濃度)之間存在顯著交互效應。

本研究僅對氣孔特征指標與O3劑量之間的線性關系進行了分析, 進一步對其他生理指標(如光合作用特征和抗氧化系統(tǒng)等)進行定量化分析將是今后研究的重點[26]。植物既可以短期調節(jié)氣孔開閉又可以長期控制氣孔發(fā)育來適應環(huán)境的變化。O3對植物的累積性以及植物對O3脅迫的適應性,使得評價O3脅迫對不同敏感性植物以及植物不同發(fā)育階段的氣孔運動,從而最終評價O3對不同植物的影響和危害變得具有挑戰(zhàn)性,也將是今后開展多年長期實驗研究的必要性所在。

4 結論

(1)6種城市綠化樹木的氣孔特征指標對O3濃度升高極為敏感,隨著O3濃度的升高,6種樹種的氣孔密度、開度和大小出現(xiàn)不同程度的顯著降低。

(2)樹種與O3處理之間,以及樹種與采樣時間之間產生顯著性的交互影響,可能與不同樹種之間的氣孔特征存在顯著差異,以及生長旺期與末期葉片不同的氣孔發(fā)育階段有關。

(3)本研究為深入研究環(huán)境變化背景下城市植物的葉組織結構和功能在適應地表O3污染方面提供理論證據。

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