于志艷 黃新梅 管軍華 張 瑞 楊 敏 吳躍躍 查兵兵 劉 軍△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科, 2婦產(chǎn)科 上海 200240)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是指在妊娠前糖耐量正常、妊娠期間首次發(fā)現(xiàn)血糖異常的糖尿病,是糖尿病的一種特殊類型[1]。GDM的發(fā)病率為1%～14%,且亞洲人口GDM發(fā)病率較高[2]。GDM患者的血糖如果沒(méi)有得到及時(shí)有效的控制,對(duì)孕婦和胎兒都會(huì)有不良影響,會(huì)增加分娩后2型糖尿病發(fā)病率[3]。此外,GDM的產(chǎn)兒在兒童時(shí)期和成年后肥胖和糖尿病的發(fā)病率高于正常糖耐量孕婦的產(chǎn)兒[3-4]。隨著醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)糖尿病患者體內(nèi)存在慢性炎癥,很多炎癥因子(如IL-1、IL-6、CRP、TNF等)的表達(dá)與胰島素抵抗程度成正比,且IL-1β和TNF-α也是導(dǎo)致β細(xì)胞損傷和胰島素抵抗重要的炎癥介質(zhì)[5-6]。IL-32是一種新近發(fā)現(xiàn)的炎癥因子,主要由自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分泌[7]。病毒及細(xì)菌等感染后,可誘導(dǎo)IL-32的產(chǎn)生,進(jìn)而參與多種疾病的發(fā)展,如乙型肝炎、炎癥性腸病等[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-32與1型糖尿病相關(guān)[10],但I(xiàn)L-32是否參與GDM的發(fā)病,目前并沒(méi)有相關(guān)研究,本文旨在研究IL-32是否參與GDM的發(fā)病。

資 料 和 方 法

研究對(duì)象隨機(jī)選取2015年11月—2016年6月在復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科分娩的孕婦80例,其中GDM孕婦42例(剖宮產(chǎn)28例,順產(chǎn)14例;15例采用胰島素治療,27例采用飲食和運(yùn)動(dòng)治療),正常對(duì)照組38例(剖宮產(chǎn)20例,順產(chǎn)18例)。納入標(biāo)準(zhǔn)為:年齡>18歲,在本院建卡并進(jìn)行規(guī)律產(chǎn)檢、分娩,有完善的臨床資料,單胎妊娠,懷孕前均無(wú)糖尿病、高血壓,足月分娩。排除標(biāo)準(zhǔn):妊娠24～28周內(nèi)缺乏口服75 g無(wú)水葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)資料,通過(guò)人工授精或者促排卵后妊娠,合并有其他妊娠并發(fā)癥,有心、腎、肝臟等功能不全,有自身免疫性疾病史等。

臨床資料回顧性收集患者24～28周的OGTT試驗(yàn)數(shù)據(jù),作為分組依據(jù)。同時(shí)回顧性收集孕婦妊娠前的身高、體重?cái)?shù)據(jù),計(jì)算孕前BMI,BMI (kg/m2)=體重(kg)/身高(m)2,并記錄孕婦入院期間的血壓、血脂、血常規(guī)、肝功能等臨床資料。

診斷標(biāo)準(zhǔn)GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)選用2017年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11],在妊娠的24～28周進(jìn)行OGTT試驗(yàn)。OGTT前72 h正常飲食,在禁食8～14 h采集空腹血,之后將75 g無(wú)水葡萄糖溶于250 mL水中,5 min內(nèi)喝完,從喝第一口糖水開(kāi)始,抽取1、2 h靜脈血送檢。當(dāng)空腹血糖≥5.1 mmol/L,1h血糖≥10.0 mmol/L,2 h血糖大于8.5 mmol/L,3項(xiàng)當(dāng)中有1項(xiàng)及以上異常時(shí)即診斷為GDM,歸為GDM組,3項(xiàng)均正常歸為正常對(duì)照組。

血標(biāo)本采集孕婦分娩當(dāng)日清晨,無(wú)菌靜脈取血3 mL,室溫下靜置30 min后進(jìn)行離心(587×g,10 min),取上清,分裝后迅速置于-80 ℃冰箱保存,以待進(jìn)行IL-32 ELISA 檢測(cè)。

胎盤、皮下脂肪和大網(wǎng)膜標(biāo)本采集80例產(chǎn)婦順產(chǎn)和剖宮產(chǎn)后,立即取胎盤母體面的絨毛組織(避開(kāi)鈣化梗死灶),大小約1 cm×1 cm×1 cm、臍帶1 cm長(zhǎng);28例GDM組產(chǎn)婦及20例正常對(duì)照組產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)術(shù)中取下腹部皮下脂肪和大網(wǎng)膜脂肪,一部分用PBS緩沖液沖洗所選取的組織去除血污,用濾紙吸干后,置于凍存管中迅速放入液氮中保存,以待進(jìn)行IL-32總RNA的提取;另一部分用甲醛固定后石蠟包埋,進(jìn)一步行IL-32的免疫組織化學(xué)染色。本研究的標(biāo)本采集均獲得患者的知情同意。

空腹血糖、胰島素測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹血糖(FBG),電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)空腹胰島素(FINS),試劑盒購(gòu)于羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司,均為同批測(cè)定,批內(nèi)變異<5%。GDM組FINS計(jì)算時(shí),去除采用胰島素治療的15例患者,以減少外來(lái)胰島素對(duì)結(jié)果的影響,并以此均值代替該15人的FINS,計(jì)算胰島素抵抗指數(shù),計(jì)算公式為:HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS(pmol)/22.5。

實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定IL-32mRNA相對(duì)表達(dá)量采用日本Takara公司的Trizol(批號(hào)9109)提取組織內(nèi)的總RNA后,加入焦炭酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水,進(jìn)行260/280吸光度測(cè)量(控制在1.8～2.0內(nèi))并進(jìn)行核酸定量。采用日本Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào):RR036A),嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)的操作步驟,以RNA為模板,合成cDNA。再以cDNA為模板,采用Takara公司qPCR檢測(cè)試劑盒(批號(hào)RR420A)進(jìn)行qPCR,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟操作,每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次,使用Biosystems 7500熒光定量分析機(jī)器進(jìn)行結(jié)果分析。以目標(biāo)基因(IL-32)與內(nèi)參照物β肌動(dòng)蛋白(β-Actin)的吸光度比值作為目標(biāo)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列:IL-32正向引物:5’-GGTGAAGGAGAAGGTGGT-3’,反向引物:5’-CGTAGGACTGGAAAGAGGA-3’;β-Actin正向引物:5’-CTACCTCATGAAGATCCT-CACCGA-3’,反向引物:5’-TTCTCCTTAATG-TCACGCACGATT-3’。

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胎盤及臍帶內(nèi)IL-32蛋白表達(dá)量胎盤及臍帶組織石蠟包埋后,切片(厚度為5 mm),后經(jīng)二甲苯脫臘、梯度乙醇水化后,加入Dako PH6的抗原修復(fù)液(1∶10稀釋),高壓鍋煮沸20 min,然后用Dako封閉液封閉30 min,用免疫組化筆在組織周圍畫圈后,加入Abcam IL-32一抗(型號(hào):ab7158,1∶300稀釋),37 ℃,2 h,洗掉一抗后,加入Dako公司抗兔二抗,室溫孵化30 min后,加入DAB顯色,Harrs’s 蘇木精復(fù)染。每個(gè)步驟用1×TBST洗3次,每次5 min。染色后的組織經(jīng)梯度乙醇脫水后,放入Histoline溶液,去除免疫組化筆的印記,用中性樹(shù)脂封片。顯微鏡下拍照后,Image Plus 9.0軟件進(jìn)行分析。

ELISA測(cè)定血清IL-32水平采用ELISA檢測(cè)血IL-32的表達(dá)。試劑盒購(gòu)自美國(guó)LifeSpan公司(型號(hào)為L(zhǎng)S-F22937),實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,并且每個(gè)樣本設(shè)置2個(gè)重復(fù)孔,以減少操作誤差。測(cè)定450 mm的吸光度(D)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算每個(gè)樣本的IL-32含量。

結(jié) 果

一般臨床資料GDM組的空腹血糖、1 h血糖、2 h血糖、HOMA-IR明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05);此外,與妊娠期間血糖正常的孕婦相比,GDM患者的血淋巴細(xì)胞百分比明顯增加[(18.73%±4.34%)vs.(15.48%±3.46%),P=0.017],血三酰甘油明顯增加[(2.91±1.17)vs.(2.18±0.85) mmol/L,P=0.009],血-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(-GT)明顯增加[(19.67±11.23)vs.(11.17±5.77) U/L,P=0.003],其余肝功能相關(guān)指標(biāo)略增高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組孕婦的妊娠年齡、孕前身高、孕前體重、孕前BMI、分娩孕周及胎兒出生體重、血壓等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。

胎盤、皮下脂肪和大網(wǎng)膜脂肪組織的IL-32mRNA表達(dá)GDM組胎盤組織IL-32mRNA的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組[(3.06±0.49)vs.(1.32±0.23),t=3.29,P<0.01],大網(wǎng)膜脂肪組織內(nèi)IL-32mRNA的表達(dá)水平也明顯高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(5.21±0.91)vs.(1.96±0.29),t=4.23,P<0.01],但皮下脂肪組織內(nèi)IL-32mRNA的表達(dá)水平兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(3.78±0.53)vs.(3.61±0.35),t=0.28,P>0.05,圖1]。

Height:Height before pregnancy;Weight:Weight before pregnancy;BMI:BMI before pregnancy;FINS:Fasting insulin;SBP:systolic blood pressure;DBP:Diastolic blood pressure;TC:Total cholesterol;TG:Triglyceride;ALT:Alanine aminotransferase;AST:Aspartate aminotransferase;-GT:-glutamyltransferase.

A:Relative expression of IL-32 in subcutaneous adipose tissue;B:In greater omentum;C:In placental tissue.

圖1胎盤及脂肪組織內(nèi)IL-32mRNA實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果
Fig1RealtimePCRanalysisofIL-32mRNAexpressionintheplacentaandfattissue

胎盤及臍帶內(nèi)IL-32蛋白的表達(dá)量IL-32在GDM組和非GDM組的胎盤絨毛膜及臍帶動(dòng)脈、臍帶靜脈、臍帶間質(zhì)內(nèi)都可以檢測(cè)到,臍動(dòng)脈和臍靜脈內(nèi)的表達(dá)量均較高,在臍帶間質(zhì)內(nèi)含量相對(duì)較低。臍動(dòng)脈內(nèi)IL-32主要表達(dá)于內(nèi)膜,GDM組的IL-32在臍動(dòng)脈的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組組,增加了29.9%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011,圖2A-C)。在對(duì)照組的臍帶靜脈內(nèi)膜內(nèi)可以檢測(cè)到IL-32蛋白的表達(dá),但表達(dá)量比GDM組低31.5%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.034,圖2D-F)。GDM組和對(duì)照組的臍帶間質(zhì)內(nèi)都可以檢測(cè)到IL-32,但是兩者之間并沒(méi)有明顯差異(P=0.207,圖2 G-I)。GDM組胎盤內(nèi)的IL-32蛋白表達(dá)量明顯增高,比對(duì)照組增加了27.3%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019,圖2 J-L)。

IL-32 production in the umbilical artery was significantly higher from GDM than that from non-GDM patients(A).The micrographs demonstrate the representative pictures of IL-32 staining in umbilical artery from control (B) and GDM (C) group.Significantly higher IL-32 was detected in GDM umbilical veins than that of control group (D),with representative micrographs (E and F).IL-32 production can detected in the umbilical interstitial tissues from both GDM (I) and control group (H) without significant difference (G).IL-32 was also highly produced in the GDM compared with that from non-GDM placenta (J).The representative micrographs of control group (K) and GDM group (L).Arrows in figures show the expression of IL-32 protein.(1)P<0.05;ns:P>0.05.

圖2IL-32在臍動(dòng)脈、臍靜脈、臍帶間質(zhì)和胎盤內(nèi)的表達(dá)
Fig2IL-32productioninumbilicalartery,umbilicalvein,umbilicalinterstitiumandplacenta

血清IL-32水平GDM組孕婦血清內(nèi)IL-32的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組孕婦[(129.3±5.78)vs.(105.6±8.61) pg/mL,t=2.227,P<0.05],差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

血清IL-32水平與空腹血糖及HOMA-IR相關(guān)性分析血清IL-32水平與FBG和HOMA-IR均具有正相關(guān)的關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.56 (P<0.001)和0.43 (P=0.005)。

討 論

GDM是妊娠期常見(jiàn)的一種合并癥,近年來(lái)其發(fā)病率有逐漸升高的趨勢(shì)。雖然GDM的病程較短,但仍可對(duì)孕婦及產(chǎn)兒產(chǎn)生一系列不良的影響。目前對(duì)于GDM的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,炎癥可能是其發(fā)病原因之一。有報(bào)道顯示,GDM患者血清內(nèi)的TNF-α增加,與IR有明顯的相關(guān)性[12]。陳立春等的研究顯示,脂肪因子瘦素、視黃醇結(jié)合蛋白4 (RBP4)、IL-6、TNF-α明顯升高,而RBP4脂聯(lián)素明顯降低,脂肪因子、炎癥因子的過(guò)度分泌導(dǎo)致的炎性激活,也驗(yàn)證了炎癥因子參與了GDM的發(fā)病[13]。

我們的研究結(jié)果中TC、LDL、HDL和的新生兒體重未見(jiàn)明顯差異,與先前的研究[14]結(jié)果不完全一致,可能是樣本量差異所致。GDM組孕婦的三酰甘油和-GT水平明顯高于Non-GDM組,原因可能是,GDM患者體內(nèi)的高血糖,妨礙了血脂的代謝,而脂代謝與糖代謝相輔相成,高血脂可能會(huì)進(jìn)一步升高血糖。分娩前,GDM組孕婦靜脈血內(nèi),淋巴細(xì)胞百分比增加,提示GDM患者體內(nèi)存在有炎癥反應(yīng)。

IL-32作為一種新近發(fā)現(xiàn)的炎癥因子,參與了多種炎癥、非炎癥性疾病的發(fā)病,可以促進(jìn)炎癥,抑制病毒的增殖。最初IL-32被認(rèn)為是IL-2或IFN刺激后表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物,但隨后的研究結(jié)果顯示,IL-32具有通過(guò)NF-кB和p38促分裂原活化蛋白激酶和NOD1、2信號(hào)通路的活化,而誘導(dǎo)其他促炎細(xì)胞因子和趨化因子(如TNF-α,IL-1β,IL-6)產(chǎn)生的作用[15,16]。在肥胖人群體內(nèi),IL-32的表達(dá)量增加,減重手術(shù)后,IL-32表達(dá)量可以降低,而通過(guò)控制飲食減重的人群體內(nèi),IL-32表達(dá)量未見(jiàn)明顯減少,提示胃腸道激素可能影響IL-32的合成和分泌[17]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IL-32基因沉默后,能量產(chǎn)生的相關(guān)基因(肌酸激酶,PPARGC1A等)上調(diào),ATP水平增加,在胰島素刺激后,AKT的磷酸化增加,提示胰島素敏感性增加,肌肉活檢后檢測(cè)的IL-32水平,與HOMA-IR具有相關(guān)性[18],IL-32轉(zhuǎn)基因的小鼠,經(jīng)過(guò)高脂飼養(yǎng)后,骨骼肌重量明顯降低、對(duì)胰島素的反應(yīng)性降低,此外小鼠體內(nèi)丙酮酸循環(huán)和檸檬酸循環(huán)通路的相關(guān)基因下調(diào)[18]。IL-32分子共有7種不同的亞型,IL-32(α、β、γ、δ、ε、ζ)[15,19]及一個(gè)新的亞型[20],目前各亞型功能尚未完全清楚,且各個(gè)亞型功能并不完全一致甚至相反:IL-32γ可以增加STZ對(duì)胰腺細(xì)胞的損害和炎癥,進(jìn)而加速T1DM的造模速度;而IL-32β過(guò)表達(dá)的小鼠,高脂飼養(yǎng)后,與對(duì)照組相比,可以明顯改善肝內(nèi)脂肪變性和炎癥[21]。

我們的結(jié)果顯示,與Non-GDM組相比,GDM患者胎盤、臍帶血管、大網(wǎng)膜脂肪內(nèi)IL-32的蛋白及mRNA的表達(dá)量均增加,并且循環(huán)中IL-32的水平明顯增加,與空腹血糖及HOMA-IR具有正相關(guān)關(guān)系,以往的研究結(jié)果顯示,肥胖的人群體內(nèi)IL-32表達(dá)水平增加[17]。我們的兩組孕婦孕前的BMI無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明GDM組IL-32水平的增加,不是因GDM組孕婦肥胖所致,IL-32的升高與GDM發(fā)病具有相關(guān)性。本研究結(jié)果可為未來(lái)GDM的治療和病因?qū)W研究提供理論基礎(chǔ)。

本文的不足之處在于,未具體檢測(cè)IL-32的不同亞基的表達(dá)量及IL-32作用的上、下游的信號(hào)通路,未來(lái)需進(jìn)一步研究,來(lái)探討IL-32不同的分子片段與GDM的相關(guān)性,及其作用的具體分子通路。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Diagnostic criteria and classification of hyperglycaemia first detected in pregnancy:a World Health Organization Guideline[J].DiabetesResClinPract,2014,103(3):341-363.

[2] Gestational diabetes mellitus[J].DiabetesCare,2004,27(Suppl 1):S88-S90.

[3] DAMM P.Future risk of diabetes in mother and child after gestational diabetes mellitus[J].IntJGynaecolObstet,2009,104(Suppl 1):S25-S26.

[4] DABELEA D.The predisposition to obesity and diabetes in offspring of diabetic mothers[J].DiabetesCare,2007,30(Suppl 2):S169-S174.

[5] KILB H,MANDRUP-POULSEN T.An immune origin of type 2 diabetes?[J].Diabetologia,2005,48(6):1038-1050.

[6] KNUDSEN SH,PEDERSEN BK.Targeting inflammation through a physical active lifestyle and pharmaceuticals for the treatment of type 2 diabetes[J].CurrDiabRep,2015,15(10):82.

[7] KHAWAR MB,ABBASI MH,SHEIKH N.IL-32:A novel pluripotent inflammatory interleukin,towards gastric inflammation,gastric cancer,and Chronic Rhino Sinusitis[J].MediatorsInflamm,2016,2016:8413768.

[8] SHIOYA M,NISHIDA A,YAGI Y,etal.Epithelial overexpression of interleukin-32alpha in inflammatory bowel disease[J].ClinExpImmunol,2007,149(3):480-486.

[9] XU Q,PAN X,SHU X,etal. Increased interleukin-32 expression in chronic hepatitis B virus-infected liver[J].JInfect,2012,65(4):336-342.

[10] JHUN H,CHOI J,HONG J,etal.IL-32γ overexpression accelerates streptozotocin (STZ)-induced type 1 diabetes[J].Cytokine,2014,69(1):1-5.

[11] AMERICAN DIABETES ASSOCIATION.Management of diabetes in pregnancy[J].DiabetesCare,2017,40(Suppl 1):S114-114S119.

[12] WINKLER G,CSEH K,BARANYI E,etal.Tumor necrosis factor system in insulin resistance in gestational diabetes[J].DiabetesResClinPract,2002,56(2):93-99.

[13] 陳利春,陳冠軍,葉俊良,等.妊娠期糖尿病患者脂肪細(xì)胞因子與炎癥的相關(guān)性分析[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(7):842-845.

[14] 孔令英,楊慧霞,孟文穎,等.妊娠期血脂與妊娠期糖尿病、巨大兒的關(guān)系研究[J].中華糖尿病雜志,2016,8(12):735-740.

[15] KIM SH,HAN SY,AZAM T,etal.Interleukin-32:a cytokine and inducer of TNFalpha[J].Immunity,2005,22(1):131-142.

[16] NETEA MG,AZAM T,FERWERDA G,etal.IL-32 synergizes with nucleotide oligomerization domain (NOD) 1 and NOD2 ligands for IL-1beta and IL-6 production through a caspase 1-dependent mechanism[J].ProcNatlAcadSciUSA,2005,102(45):16309-16314.

[18] DAVEG?RDH C,BROHOLM C,PERFILYEV A,etal.Abnormal epigenetic changes during differentiation of human skeletal muscle stem cells from obese subjects[J].BMCMed,2017,15(1):39.

[19] GODA C,KANAJI T,KANAJI S,etal.Involvement of IL-32 in activation-induced cell death in T cells[J].IntImmunol,2006,18(2):233-240.

[20] IMAEDA H,ANDOH A,AOMATSU T,etal.A new isoform of interleukin-32 suppresses IL-8 mRNA expression in the intestinal epithelial cell line HT-29[J].MolMedRep,2011,4(3):483-487.

[21] LEE DH,HONG JE,YUN HM,etal.Interleukin-32β ameliorates metabolic disorder and liver damage in mice fed high-fat diet[J].Obesity(SilverSpring),2015,23(3):615-622.