秦澤華，張汝兵，郁建平

1 貴州大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550000

2 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所 中國(guó)科學(xué)院生物基材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101

紫蘇醇是一種性質(zhì)穩(wěn)定、不易揮發(fā)、耐熱耐酸的單體香料，在工業(yè)生產(chǎn)、食品生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具備廣泛的用途[1]。此外，紫蘇醇在醫(yī)療中也有獨(dú)到的治療效果，可用于降低器官移植中的排斥反應(yīng)，并在胰腺癌[2]、乳腺癌[3]和食道癌[4]等多種癌癥治療[5-6]中具有廣譜、高效、低毒的抗癌作用，目前國(guó)外已進(jìn)入了臨床階段。

在自然界中，紫蘇醇是植物甲醛戊酸代謝途徑中產(chǎn)生的單萜化合物，通常以游離或酯的形式存在于多種植物中[7]。理論上，紫蘇醇可采用有機(jī)溶劑[8-9]或超臨界 CO2萃取[10-11]等方法從天然植物精油中提取。但因植物精油中紫蘇醇含量太低、不易分離，導(dǎo)致成本過(guò)高而不能大量生產(chǎn)。李謙和等[12]則采用以天然存在的單萜烯為起始原料，用化學(xué)合成的方法合成紫蘇醇，但因反應(yīng)溫度高、氧化劑劇毒、產(chǎn)物復(fù)雜且產(chǎn)率低等原因，同樣也不能在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用[13]?，F(xiàn)今，合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為改造目標(biāo)分子的天然生產(chǎn)物種或設(shè)計(jì)異源合成途徑提供了可能。同時(shí)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)具有操作簡(jiǎn)單、條件溫和、無(wú)毒、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，且轉(zhuǎn)化所得到的產(chǎn)物通常具有區(qū)域選擇性和立體選擇性，所以生物轉(zhuǎn)化法用于合成紫蘇醇具有較好的應(yīng)用前景[14]。

1966年，科學(xué)家Dhavalikar等[15]首次報(bào)道了假單胞菌Pseudomonad轉(zhuǎn)化檸檬烯的方法，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌可以將 D-檸檬烯作為唯一碳源和能源轉(zhuǎn)化合成紫蘇醇。通過(guò)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)Pseudomonad轉(zhuǎn)化反應(yīng)是在檸檬烯的第7位碳原子上進(jìn)行羥基化，從而得到紫蘇醇。然而紫蘇醇會(huì)被該菌進(jìn)一步氧化成紫蘇醛、紫蘇酸，接著進(jìn)行β-氧化，最終發(fā)生降解。此后諸多研究證實(shí)了Pseudomonas和芽孢桿菌Bacillus能夠利用檸檬烯作為唯一碳源和能源轉(zhuǎn)化得到紫蘇醇。1998年，van der Werf等[16]報(bào)道了紅平紅球菌Rhodococcus erythropolisDCL14能以檸檬烯作為唯一的碳源和能源合成紫蘇醇，但不同于Bacillus和Pseudomonad，該菌不會(huì)對(duì)紫蘇醇發(fā)生進(jìn)一步氧化反應(yīng)[15]。此外采用生物轉(zhuǎn)化的方法，也可將檸檬烯轉(zhuǎn)化合成光學(xué)活性的紫蘇醇，轉(zhuǎn)化作用是通過(guò)分枝桿菌Mycobacteriumsp.的細(xì)胞色素P450烷烴羥化酶 (Cytochrome P450 alkane hydroxylase，P450) 在L-檸檬烯的7位羥化生成L-紫蘇醇。

大腸桿菌作為典型的模式生物，其遺傳背景清楚，是生物合成領(lǐng)域常用的宿主菌[17]。以大腸桿菌作為合成萜類物質(zhì)的宿主菌也日益得到研究人員的重視[18]。劉敏[19]利用大腸桿菌成功地構(gòu)建了MEP途徑合成異戊二烯。Alonso-Gutierrez等[20]以大腸桿菌為表達(dá)宿主，利用來(lái)源于葡萄球菌Staphylococcus aur eus的外源甲羥戊酸 (MVA)途徑，初步實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌通過(guò) MVA代謝途徑合成紫蘇醇的可行性，但產(chǎn)物濃度和產(chǎn)率還處于較低的水平。本研究選擇來(lái)源于糞腸球菌的外源MVA代謝合成基因，因本實(shí)驗(yàn)室已驗(yàn)證了此途徑可高效合成MVA，可為后續(xù)反應(yīng)提供充足的前體物。該合成途徑再結(jié)合來(lái)源于留蘭香Mentha spicata的香葉基焦磷酸合成酶 (GPPS)、巨冷杉Abies grandis的檸檬烯合酶 (LS)及分支桿菌Mycobacteriumsp.的P450，成功構(gòu)建了以葡萄糖為原料合成紫蘇醇的工程大腸桿菌 (圖1)。此外，為了提高紫蘇醇的產(chǎn)量，本研究進(jìn)一步優(yōu)化了工程菌株發(fā)酵條件中的碳源、IPTG濃度、誘導(dǎo)OD值、VB2濃度、發(fā)酵起始pH值等參數(shù)。

圖1 紫蘇醇MVA代謝途示意圖Fig. 1 The mevalonate (MVA) pathway in Escherichia c oli for the production of perillyl alcohol. Acety-CoA acelytransferase (mvaE), HMG-CoA synthase (mvaS), HMG-CoA reductase (mvaE) form Enterococcus faeca lis;Mevalonate kinase (MK), phosphomevalonate kinase (PMK) and diphosphomevalonate decarboxylase (PMD) form Saccharomyces ce revisiae; Geranyl pyrophosphate synthase (GPPS) form Mentha sp icata; Limonene synthase (LS)form Abies grandis; Cytochrome P450 alkane hydroxylase (P450) form Mycobacterium sp..

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia c oliDH5α和 BL21(DE3) 由本實(shí)驗(yàn)室保存。E. coliDH5α為基因克隆菌株，E. coliBL21 (DE3) 為發(fā)酵培養(yǎng)菌株。pCOLADuet-1購(gòu)自Novagen公司，pTrcHis2B購(gòu)自Invitrogen公司。pTrc-low、pACYCDuet-mvaE-mvaS為本實(shí)驗(yàn)已構(gòu)建好質(zhì)粒，其中 pTrc-low是以pTrcHis2B為載體，攜帶了來(lái)源于釀酒酵母Saccharomyces cer evisiae的 PMD、MK、PMK和IPI四種酶的基因[21]；pACYCDuet-mvaE-mvaS是以pACYCDuet-1為載體，攜帶糞腸球菌Enterococcus faecalis的mvaS和mvaE兩種酶的基因[21]?；騡pps、ls和p450經(jīng)過(guò)大腸桿菌表達(dá)宿主序列優(yōu)化后，由金唯智公司合成，并連接到載體pUC57上。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10.0 g/L蛋白胨、5.0 g/L酵母粉、10.0 g/L NaCl，pH 7.0，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。紫蘇醇的發(fā)酵培養(yǎng)基是在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為2 mmol/L的MgSO4。根據(jù)質(zhì)粒抗性需要添加相應(yīng)抗生素，培養(yǎng)基中抗生素終濃度為：Kan 50 μg/mL，Amp 100 μg/mL，抗生素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 試劑及儀器

基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠純化回收試劑盒和 DNA純化試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；PrimeSTAR Max DNA Polymerase購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo scientific公司；DNA Marker等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物合成和基因測(cè)序是由青島擎科生物技術(shù)公司負(fù)責(zé)完成。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的主要儀器包括：Bio-Rad PCR儀、Bio-Rad凝膠成像儀、Bio-Rad電泳儀、Varian GC450氣相色譜、Varian Cary50分光光度計(jì)。

1.2 基因克隆和質(zhì)粒構(gòu)建

質(zhì)粒 DNA提取、PCR擴(kuò)增、限制性酶切、連接等均按說(shuō)明書和常規(guī)方法進(jìn)行。本研究質(zhì)粒構(gòu)建相關(guān)引物見表 1。培養(yǎng)攜帶 pUC57-p450和pUC57-ls的載體菌株，提取質(zhì)粒。再分別以質(zhì)粒pACYCDuet-mvaE-mvaS和pUC57-gpps為模板，采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase擴(kuò)增基因mvaE-mvaS、gpps。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳分析后，回收PCR目的片段，將回收產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用 DNA純化試劑盒回收，再連接到經(jīng)同樣酶切并回收的質(zhì)粒載體 pCOLADuet-1上，獲得重組質(zhì)粒。感受態(tài)細(xì)胞采用Competent Cell Preparation Kit試劑盒 (TaKaRa公司) 進(jìn)行制備。

1.3 重組菌的發(fā)酵及發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

誘導(dǎo)OD值對(duì)合成紫蘇醇的影響：重組質(zhì)粒pCOLA-gpps-mva-ls-p450和pTrc-low轉(zhuǎn)化到E. coliBL21 (DE3) 中獲得合成紫蘇醇的重組大腸桿菌。挑取平板上的單菌落，接種于4 mL (加入適量的Amp和Kan) 的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。將500 μL上述種子液接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基 (含 Amp 和 Kan) 中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。分別在菌液OD600達(dá)到0.3、0.6、0.8、1.0和1.5時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。發(fā)酵36 h后，檢測(cè)紫蘇醇的含量。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

誘導(dǎo)劑 IPTG濃度對(duì)合成紫蘇醇的影響：按上述發(fā)酵培養(yǎng)條件，當(dāng)OD600為0.6–0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度分別為0.1、0.3、0.5、1.0、1.5 mmol/L。發(fā)酵36 h后，檢測(cè)紫蘇醇的含量。

碳源對(duì)合成紫蘇醇的影響：按上述發(fā)酵培養(yǎng)條件，分別采用發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基加終濃度20 g/L葡萄糖、發(fā)酵培養(yǎng)基加終濃度20 g/L甘油作為紫蘇醇的合成培養(yǎng)基，當(dāng)OD600為0.6–0.8時(shí)，加入終濃度1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑。發(fā)酵36 h后，檢測(cè)紫蘇醇的含量。

pH對(duì)合成紫蘇醇的影響：按上述發(fā)酵培養(yǎng)條件，采用發(fā)酵培養(yǎng)基加終濃度20 g/L的葡萄糖為紫蘇醇發(fā)酵合成培養(yǎng)基。用HCl和氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中起始 pH，分別調(diào)節(jié)成 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，比較不同 pH下紫蘇醇產(chǎn)量，在OD600為0.6–0.8時(shí)，加入終濃度1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑。發(fā)酵36 h后，檢測(cè)紫蘇醇的含量。

VB2對(duì)合成紫蘇醇的影響：按上述發(fā)酵培養(yǎng)條件，采用起始pH為7.0的發(fā)酵合成培養(yǎng)基，分別加入終濃度為 0、10、30、50、100 μmol/L 的 VB2，在OD600為0.6–0.8時(shí)，加入終濃度1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑。發(fā)酵36 h后，檢測(cè)紫蘇醇的含量。

1.3.2 最優(yōu)條件下紫蘇醇的發(fā)酵培養(yǎng)

根據(jù)上述優(yōu)化得到的發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果，進(jìn)行紫蘇醇的最終發(fā)酵。條件為：采用起始pH為7.0的發(fā)酵合成培養(yǎng)基，當(dāng)OD600達(dá)到0.6–0.8，加入終濃度為30 μmol/L的VB2和1.0 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。在該條件下考察紫蘇醇的合成過(guò)程，發(fā)酵過(guò)程中定期取樣檢測(cè)紫蘇醇的合成。

1.4 紫蘇醇的測(cè)定

紫蘇醇采用氣相色譜檢測(cè)，方法如下：取3 mL的發(fā)酵液，加入等體積的乙酸乙酯，用渦旋振蕩器充分混勻，然后3 000×g離心5 min，上層的乙酸乙酯轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入Na2SO4將乙酸乙酯相中的水分充分抽離，3 000×g離心3 min。然后對(duì)上層的乙酸乙酯采用氣相色譜分析檢測(cè)。色譜條件：色譜柱為 DB-5 (30 m×0.320 mm×0.25 μm)；檢測(cè)器為氫火焰離子檢測(cè)器；分析條件如下：柱溫80 ℃保持2 min，然后以20 ℃/min從80 ℃升溫到250 ℃，保持2 min，汽化溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度260 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇醇合成質(zhì)粒的構(gòu)建

將基因gpps、mva、ls和p450克隆到表達(dá)載體pCOLADuet-1中，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒 pCOLA-gpps-mva-ls-p450。將重組質(zhì)粒pCOLA-gpps-mva-ls-p450和pTrc-low共同轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E. coliBL21 (DE3) 中，獲得合成紫蘇醇的工程大腸桿菌。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化分析

2.2.1 誘導(dǎo)OD值對(duì)紫蘇醇合成的影響

誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇對(duì)菌體外源蛋白的表達(dá)及產(chǎn)物合成影響極為顯著，采用不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)考察對(duì)紫蘇醇的合成影響結(jié)果如圖 2所示。菌液OD600低于0.6時(shí)，菌體生長(zhǎng)還處于初期，IPTG的誘導(dǎo)使菌體代謝負(fù)擔(dān)加重，產(chǎn)物合成能力偏低。當(dāng)OD600為0.8時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)，紫蘇醇含量達(dá)到最大值。隨著OD600的增加，誘導(dǎo)時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的后期，導(dǎo)致目的蛋白的合成量減少，從而影響產(chǎn)物生成。

圖2 不同誘導(dǎo)OD600值對(duì)紫蘇醇合成的影響Fig. 2 Effect of different OD600 on perillyl alcohol production.

2.2.2 誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)菌體產(chǎn)紫蘇醇的影響

IPTG濃度對(duì)菌體外源蛋白的表達(dá)及產(chǎn)物的合成影響極為顯著，合適的 IPTG濃度可以誘導(dǎo)目的蛋白高效表達(dá)，采用不同濃度的 IPTG考察對(duì)紫蘇醇的合成影響結(jié)果如圖3所示。紫蘇醇產(chǎn)量隨著誘導(dǎo)劑濃度的升高而不斷升高；誘導(dǎo)劑濃度為1.0 mmol/L時(shí)，紫蘇醇濃度達(dá)到最大值；隨著誘導(dǎo)劑濃度的再次增加，紫蘇醇產(chǎn)量出現(xiàn)降低的趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)初步分析得出，可能是由于高濃度的誘導(dǎo)劑會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定毒性，抑制菌體的生長(zhǎng)，從而影響菌體代謝及產(chǎn)物表達(dá)水平。

圖3 IPTG濃度對(duì)工程菌合成紫蘇醇的影響Fig. 3 Effect of IPTG concentration on perillyl alcohol production.

2.2.3 培養(yǎng)基對(duì)工程菌株產(chǎn)紫蘇醇的影響

微生物對(duì)不同碳源的代謝能力不同，主要表現(xiàn)在代謝過(guò)程中所需的酶系活性及轉(zhuǎn)運(yùn)能力上的差異。因此，不同的碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成都有很大的影響，所以選擇合適的碳源對(duì)微生物發(fā)酵合成目標(biāo)代謝產(chǎn)物是十分重要的。本實(shí)驗(yàn)采用發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基＋葡萄糖、發(fā)酵培養(yǎng)基＋甘油為紫蘇醇的合成培養(yǎng)基，考察培養(yǎng)基對(duì)紫蘇醇合成的影響。結(jié)果可見，采用發(fā)酵培養(yǎng)基＋葡萄糖時(shí)紫蘇醇的合成效果最好，發(fā)酵培養(yǎng)基+甘油次之，不添加額外碳源的產(chǎn)量最低 (圖4)。經(jīng)過(guò)初步分析得出，在合成紫蘇醇的發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，碳源逐漸消耗，導(dǎo)致重組大腸桿菌生長(zhǎng)及代謝受到了一定的影響；而大腸桿菌在營(yíng)養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基條件下，甘油經(jīng)甘油脫氫酶和二羥丙酮激酶催化生成磷酸二羥丙酮的速率過(guò)快，導(dǎo)致胞內(nèi)積累的磷酸二羥丙酮進(jìn)入丙酮酸代謝途徑時(shí)生成可抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的乳醛，進(jìn)而影響菌體代謝及產(chǎn)物合成；而分解葡萄糖的酶屬于組成酶，此類酶的合成受遺傳物質(zhì)控制，可以有效地進(jìn)入糖酵解途徑生成乙酰輔酶A。

2.2.4 pH對(duì)工程菌株產(chǎn)紫蘇醇的影響

pH是菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的重要參數(shù)，是影響發(fā)酵過(guò)程中酶的活性、糖的轉(zhuǎn)化率、細(xì)胞滲透壓的重要因素之一[22]。同時(shí)還影響發(fā)酵液中某些營(yíng)養(yǎng)物和中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響重組大腸桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用[23]。因此，發(fā)酵液中pH值過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響目的產(chǎn)物的生成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)pH范圍在6.0–7.0時(shí)，紫蘇醇產(chǎn)量隨隨著pH的升高而增加；pH值為7時(shí)，紫蘇醇產(chǎn)量最高；pH范圍在7.0–8.0時(shí)，紫蘇醇產(chǎn)量下降(圖5)。

圖4 培養(yǎng)基對(duì)工程菌合成紫蘇醇的影響Fig. 4 Effect of carbon source concerntration on perillyl alcohol production.

圖5 pH對(duì)工程菌合成紫蘇醇的影響Fig. 5 Effect of pH on perillyl alcohol production.

圖6 VB2對(duì)合成紫蘇醇的影響Fig. 6 Effect of VB2 concerntration on perillyl alcohol production.

2.2.5 VB2對(duì)工程菌株產(chǎn)紫蘇醇的影響

核黃素 (VB2) 是蛋白質(zhì)、糖、脂肪酸代謝和能量利用與組成所必需的物質(zhì)[24]。在菌體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，VB2作為黃素蛋白的輔酶參與到機(jī)體組織代謝中，主要是在呼吸鏈中負(fù)責(zé)傳遞電子以及一些氧化還原反應(yīng)，在呼吸和生物氧化中起著重要的作用。Alonso-Gutierrez等[20]報(bào)道了利用大腸桿菌生產(chǎn)紫蘇醇的過(guò)程中，在培養(yǎng)液中添加一定量的VB2有利于檸檬烯轉(zhuǎn)化為紫蘇醇。本研究考察采用不同濃度的VB2對(duì)紫蘇醇合成的影響，結(jié)果如圖 6所示。研究表明當(dāng) VB2較低時(shí)，紫蘇醇含量隨著 VB2濃度的升高而不斷升高；當(dāng)濃度達(dá)到 30 μmol/L，紫蘇醇濃度達(dá)到最高。但隨著VB2濃度的繼續(xù)增加，紫蘇醇含量又逐漸下降(圖 6)。

2.2.6 初步優(yōu)化條件下的紫蘇醇發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基不僅是工程菌繁殖所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基本條件，也是合成代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)。它既要滿足大腸桿菌快速生長(zhǎng)繁殖至一定的菌體濃度，又要使菌體迅速合成代謝產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)液的組分和培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成是至關(guān)重要的[25]。以初步優(yōu)化條件進(jìn)行工程菌的發(fā)酵，每隔12 h定時(shí)取樣，檢測(cè)紫蘇醇的產(chǎn)量，結(jié)果如圖7所示。紫蘇醇產(chǎn)量在誘導(dǎo)后的36 h前增加較快，在36 h左右時(shí)，紫蘇醇的濃度達(dá)到最高值。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，紫蘇醇的含量基本趨于穩(wěn)定。

3 討論

本研究通過(guò)在大腸桿菌體內(nèi)引入基于 MVA代謝途徑的外源基因，構(gòu)建了合成紫蘇醇的工程菌株，并在后期開展了菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化，提高了紫蘇醇的發(fā)酵濃度至50.12 mg/L。

圖7 紫蘇醇的發(fā)酵過(guò)程Fig. 7 The fermentation process of perillyl alcohol.

紫蘇醇生物合成的代謝途徑和調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，它需要將外源代謝途徑中整個(gè)編碼酶的基因?qū)氲酱竽c桿菌中并實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)[26]。由于所需的編碼酶基因較多，只有一個(gè)載體的表達(dá)系統(tǒng)很難將整個(gè)代謝通路完全構(gòu)建成功，需要使用多個(gè)重組質(zhì)粒搭建一套完整的代謝途徑，這其中就涉及到多個(gè)表達(dá)模塊在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控[26]。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)采用的工程菌株含有 pCOLA-gpps-mva-ls-p450和 pTrc-low兩個(gè)質(zhì)粒，其中本實(shí)驗(yàn)室已驗(yàn)證來(lái)源于糞腸球菌的外源 MVA代謝途徑比來(lái)源于葡萄球菌[19]的外源 MVA代謝途徑可更高效地合成MVA，可為后續(xù)反應(yīng)提供充足的前體物。研究表明，本研究初步實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌通過(guò)甲羥戊酸途徑合成紫蘇醇，并優(yōu)化了工程菌株發(fā)酵條件中的培養(yǎng)基、IPTG濃度、誘導(dǎo)OD值、VB2濃度、發(fā)酵起始pH值等參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)工程菌在初始pH為7.0的發(fā)酵合成培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600達(dá)到0.6–0.8，加入終濃度為30 μmol/L的VB2和1.0 mmol/L的IPTG，在30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)紫蘇醇含量最高，達(dá)到50.12 mg/L。

本研究通過(guò)采用高效表達(dá)的 T7啟動(dòng)子過(guò)量表達(dá)紫蘇醇合成過(guò)程中的多種酶，實(shí)現(xiàn)了紫蘇醇的生物合成，但由于每步酶的活性存在一定差異，必然會(huì)導(dǎo)致代謝過(guò)程中存在一定的不平衡，從而制約了紫蘇醇的進(jìn)一步合成。以往的研究也表明，從調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的角度來(lái)提高產(chǎn)量并不是簡(jiǎn)單的“越多越好”，而是要平衡在多步代謝合成途徑中的酶活性[27-28]，因此后續(xù)研究還需對(duì)代謝通量進(jìn)行分析，平衡代謝路徑來(lái)進(jìn)一步提高紫蘇醇的合成能力。此外由于大多數(shù)單萜烯對(duì)細(xì)胞的毒性，使大腸桿菌生產(chǎn)單萜微生物的產(chǎn)量受到了一定的限制[29]。研究降低單萜烯對(duì)工程菌的毒性或提高菌株的耐受性有望進(jìn)一步大幅度提高紫蘇醇的發(fā)酵產(chǎn)量。同時(shí)進(jìn)一步研究工程菌的代謝途徑，并優(yōu)化產(chǎn)品回收過(guò)程，將使微生物生產(chǎn)紫蘇醇更加經(jīng)濟(jì)可行。

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