茍楊，劉丹彥，劉金鳳，孫鴻然

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，重慶 400042

脊髓損傷發(fā)病率日益增高，且為致殘的主要原因。患者主要臨床表現(xiàn)為截癱、運動障礙和尿失禁[1-2]。目前治療方法有激素治療[3]、粒細胞集落刺激因子注射[4]、促紅細胞生成素注射[5]、針灸[6]和放置生物材料支架[7]，但缺乏有效且易行的治療方法。現(xiàn)大都是基于對神經(jīng)元的保護[8-9]，罕有研究關于脫髓鞘病變的保護作用。間充質干細胞具有高度的可塑性、較低的免疫抗原性，且在特定條件下可經(jīng)誘導后向神經(jīng)細胞分化，以上優(yōu)勢使它可以在不同個體間移植。近年來骨髓間充質干細胞研究成為熱點，研究發(fā)現(xiàn)其具有如下優(yōu)點：可自體骨髓取材，避免倫理道德問題；低免疫抗原性，在誘導移植耐受中具有優(yōu)勢[10]；易與中樞系統(tǒng)組織整合[11]；Liu等研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞具有高度分化潛能和強大的增殖能力[12]；能增加損傷脊髓中神經(jīng)生長因子含量[13]，促進神經(jīng)軸突再生[14]。這些優(yōu)點使骨髓間充質干細胞成為探索治療脊髓損傷的新方向。

BMSCs促進脊髓損傷后運動功能的恢復機制可能與其在損傷部位的抗炎[15]、抗瘢痕增殖[16]、免疫抑制作用[17]和抗凋亡[18]有關。脫髓鞘是脊髓損傷的重要病理變化，且少突膠質細胞凋亡在脊髓損傷后脫髓鞘病變中起至關重要的作用[19-22]。在本研究中，我們通過行為學和形態(tài)學，以確定BMSCs是否能夠抑制脊髓損傷后脫髓鞘病變；通過行為學和蛋白質組學確定最佳移植時機；并通過CNPase與TUNEL及CNPase與caspase 3共表達，探討 BMSCs移植能否抑制少突膠質細胞凋亡并闡明其潛在保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12干細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；油紅O干粉、茜素紅染料購自廣州賽業(yè)公司；1%鋨酸、甲醇、焦油紫、中性樹膠、NaCl、NaH2PO4·2H2O購自重慶東方試劑廠；Luxol fast blue粉劑購自美國Sigma公司；冰醋酸、多聚甲醛、丙酮、Na2HPO4·12H2O購自重慶川東化工有限公司；β-actin、caspase 3、驢抗兔熒光二抗、驢抗小鼠熒光二抗購自美國Proteintech公司；BDNF、CNPase、MBP、MAP2 購自美國 Abcam公司；羊抗鼠二抗、驢抗兔二抗購自武漢Abclonal公司；BCA蛋白分析試劑盒、ECL試劑盒、一步法TUNEL細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天公司；雙苯酰亞胺 (Hochst33258) 購自美國ThermoFisher公司；NeuN購自美國Millipore公司。

1.2 實驗方案

健康雄性 SD幼鼠 56只，4周齡，體重為100–120 g，SPF級，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。將幼鼠脫頸處死后，在無菌條件下取雙側股骨和脛骨并暴露骨髓腔，將收集的骨髓接種到培養(yǎng)基瓶內(nèi)。24 h后首次換液，3 d后傳代，傳到第3代，用含10%胎牛血清的DMEM/F12溶液配制成第3代BMSCs總個數(shù)約為2.5×106個的待移植細胞懸液[23-25]。

1.2.1 脊髓損傷后骨髓間充質干細胞移植效果評估實驗

健康雄性SD大鼠48只，體重為180–220 g，SPF級，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，隨機將動物分為3個組：假手術組 (Sham group，16只)、模型組 (Vehicle group，16只) 和治療組(Treated group，16只)。模型組應用 Rivlin &Tator’s硬脊膜外鉗夾方法制作急性脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI) 模型，用3.5%的水合氯醛 (按每100 g體重1 mL) 經(jīng)腹腔注射麻醉后，逐層切開皮膚肌肉，切除T10錐板，暴露脊髓，運用0.88 kg·m/s2力的Yasargil動脈瘤夾夾閉脊髓45 s，若在夾閉脊髓的過程中有明顯擺尾動作，傷后立即出現(xiàn)癱瘓，視為模型成功；且于術后7 d暴露受傷脊髓并在脊髓損傷處上下1 cm區(qū)注射10 μL PBS。治療組建模成功7 d后注射10 μL第3代骨髓間充質干細胞懸液。假手術組僅做脊髓顯露，不予損傷，術后7 d暴露手術部位并在同一脊髓節(jié)段 (T10–T11)上下1 cm區(qū)注射等體積PBS。所有外科手術過程均在無菌恒溫條件下進行，術后每天對大鼠膀胱3次壓迫排尿。在細胞移植后1、3、7 d進行BBB運動評分；并在細胞移植7 d后進行鋨酸染色、透射電鏡觀察神經(jīng)纖維、LFB染色、TUNEL染色、細胞分化情況、BDNF蛋白表達水平及CNPase與caspase 3免疫熒光共表達檢測。

1.2.2 不同時間點骨髓間充質干細胞移植實驗

將建模成功大鼠 (18只) 隨機分為3組：1 d組、7 d組和14 d組。其分別在脊髓損傷后1、7、14 d移植BMSCs。SD大鼠脊髓鉗夾損傷1、7和14 d后，如上所述將動物再次麻醉，暴露椎板切除部位后于各組受損脊髓處移植BMSCs。并進行BBB運動評分和MBP、CNPase、caspase 3蛋白表達水平的檢測。

1.3 方法

1.3.1 第三代骨髓間充質干細胞培養(yǎng)

脫頸處死4周齡雄性SD幼鼠，在無菌環(huán)境下，取股骨和脛骨，剪掉骨骺端，暴露骨髓腔后用10%胎牛血清反復沖洗骨髓腔至其發(fā)白，將細胞懸液收集至15 mL離心管內(nèi)，常溫1 500 r/min離心5 min。棄上清，將細胞密度調整為1.0×106/mL，接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃、5% CO2恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后首次換液。本實驗采用全骨髓貼壁法，通過更換培養(yǎng)基除去未貼壁細胞，每3天更換一次培養(yǎng)基直至細胞達到70%–80%融合后進行傳代，傳至第3代，觀察細胞生長狀態(tài)。

1.3.2 大鼠BMSCs的成脂分化觀察

取第 3代生長融合至 70%–80%的 BMSCs，以細胞密度為2.0×104個/mL接種于6孔板。使其均勻分布，在37 ℃、5% CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞融合至100%時繼續(xù)培養(yǎng)2–3 d。加入成脂誘導A液，誘導3 d后，更換成脂誘導B液，誘導1 d；如此反復誘導4次后，用成脂誘導B液誘導7 d。進行油紅O染色，各孔加入4%多聚甲醛37 ℃固定30 min后再加入油紅O工作液1 mL，染色15 min；觀察并記錄染色情況。

1.3.3 大鼠BMSCs的成骨分化觀察

BMSCs生長至100%后，加入成骨誘導液，14 d后進行茜素紅染色。各孔加入 4%多聚甲醛37 ℃固定30 min后再加入茜素紅染液1 mL，染色10 min，觀察并記錄染色情況。

1.3.4 BBB評分

BBB評分是一種神經(jīng)功能評定法，是目前評估脊髓損傷大鼠功能恢復程度的常用方法之一。將動物放入一開口盆，輕敲盆壁，使其爬行，觀察動物的臀、膝、踝、軀干運動及其協(xié)調情況。BBB評分是將大鼠后肢運動分為22個等級。后肢全癱為0分，完全正常為21分。在骨髓間充質干細胞移植效果評估實驗中和不同時間點骨髓間充質干細胞移植實驗中，均在移植后第1、3、7天由兩個技術人員采用雙盲法對大鼠進行BBB評分。

1.3.5 鋨酸染色

將細胞移植7 d后SD大鼠 (9只) 用水合氯醛深麻醉，敞開腹腔和胸腔，分別暴露肝臟、腸系膜和心臟。將針頭通過由心尖偏下插入心臟至主動脈內(nèi)并固定，剪開右心耳，將生理鹽水經(jīng)微量泵由主動脈泵入大鼠體循環(huán)，直至肝臟和腸系膜變白，右心耳流出清亮的液體后繼續(xù)泵入 4%多聚甲醛溶液固定脊髓。固定完全后，取脊髓損傷部位為中心上下各 1 cm的脊髓組織浸泡在配好的浸泡液 (1%鋨酸1 mL、1%氯酸鉀3 mL、濃甲醛溶液0.6 mL、冰醋酸0.05 mL 溶液混合) 中避光浸泡3 d后取出，流水沖洗1 d，30%的蔗糖溶液脫水，用冰凍切片機切片。在光學顯微鏡下觀察有髓神經(jīng)纖維的結構變化。

1.3.6 透射電鏡觀察神經(jīng)纖維

細胞移植7 d后SD大鼠 (9只) 用上述方法灌注。先用生理鹽水灌注體循環(huán)待右心耳流出的液體變清亮后，再灌注1%戊二醛固定液 (總量1 000 mL：25%戊二醛40 mL、0.2 mol/L PBS 460 mL、ddH2O 500 mL) 和4%多聚甲醛的混合液。灌注后取材，將取出的脊髓切為1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，浸泡于裝有4%戊二醛的西林瓶內(nèi)并送到重慶醫(yī)科大學電鏡室，再將脊髓移進1%四氧化鋨中固定 1–2 h (4 ℃)，用丙醇梯度 (50%、70%、80%、90%、100%) 脫水10 min，將脊髓標本放到烤箱內(nèi)，37 ℃ 24 h，60 ℃ 48 h；在超薄切片機下制作超薄切片，再進行醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙重染色后于透射電鏡下觀察脊髓中神經(jīng)纖維髓鞘的超微結構。

1.3.7 LFB染色

將細胞移植7 d后SD大鼠 (9只) 經(jīng)上述方法灌注，取脊髓損傷中心上下各1 cm的脊髓組織放進4%的多聚甲醛浸泡1 d，30%蔗糖溶液脫水，–80 ℃冰箱速凍5 min。將標本取出后用冰凍切片機切片，將切好的組織切片進行快藍染色檢測：1) 60 ℃ LFB浸泡2 h；2) 95%乙醇浸泡1 min，0.05%碳酸鋰浸泡 10 s；3) ddH2O浸泡1 min；4) 0.1%焦油紫浸泡10 min，37 ℃；5) 95%乙醇浸泡15 min；6) 50%甘油封片，光學顯微鏡下觀察。再將每張切片隨機選取 5個視野，所得圖像用Image J圖像軟件分析并計數(shù)神經(jīng)纖維髓鞘數(shù)。

1.3.8 TUNEL染色

1) 用上述方法對大鼠進行灌注取材后制作冰凍切片于–20 ℃保存；2) 冰凍切片室溫復溫15 min；3) PBS沖洗 3次，10 min/次；4) 0.3% Triton破膜30 min；5) PBS沖洗3次，10 min/次；6) 山羊血清 37 ℃封閉 1 h；7) 滴加小鼠來源的一抗CNPase (1∶100，Abcam公司)，置于4 ℃冰箱孵育過夜；8) 37 ℃復溫2 h；9) PBS沖洗3次，10 min/次；10) 避光滴加驢抗小鼠 (Proteintech公司)的熒光二抗 (1∶200)，37 ℃恒溫孵育2 h，PBS沖洗3次，10 min/次；11) DAPI 37 ℃孵育15 min后PBS沖洗2次，10 min/次；12) 在樣品上加50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育1 h；13) PBS洗滌3次，10 min/次；14) 抗免疫熒光淬滅劑封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.3.9 免疫印跡

細胞移植7 d后從脊髓損傷處上下1 cm內(nèi)收集組織樣品。每組取3只大鼠，生理鹽水快速灌注后在冰上快速取下脊髓組織，放入裝有細胞裂解液的勻漿器中提取蛋白。BCA (Bicinchoninic acid) 法測定蛋白濃度并調節(jié)蛋白濃度一致。取10 μL蛋白樣品并進行SDS-PAGE (蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳)，電泳結束后將凝膠中的蛋白采用250 mA電流轉到PVDF膜上。將PVDF膜放入10%脫脂奶粉溶液封閉2 h，小鼠來源BDNF (1∶1 000，Abcam公司)、小鼠來源β-actin (1∶2 000，Proteintech公司)、小鼠來源CNPase (1∶1 000，Abcam公司)、小鼠來源MBP (1∶1 000，Abcam公司) 和兔來源caspase 3(1∶1 500，Proteintech公司) 4 ℃孵育過夜，山羊抗鼠lgG二抗 (1∶3 000，Abclonal公司) 和驢抗兔lgG二抗 (1∶3 000，Abclonal公司) 37 ℃孵育90 min，ECL顯色。

1.3.10 免疫熒光

免疫熒光檢測BMSCs在受損脊髓的分化情況。步驟如下：1) 第三代BMSCs用1 mL雙苯酰亞胺(Hochst33258，ThermoFisher公司) 孵育 24 h，使熒光素標記到細胞核；2) 將標記的細胞移植到受損脊髓7 d后，用上述方法對大鼠進行灌注取材后制作冰凍切片于–20 ℃保存；3) 冰凍切片室溫復溫15 min；4) PBS 沖洗 3次，10 min/次；5) 0.3% Triton破膜30 min；6) PBS沖洗3次，10 min/次；7) 山羊血清37 ℃封閉1 h；8) 分別滴加小鼠來源的一抗 NeuN (1∶20，Millipore公司)、MAP2 (1∶20，Abcam 公司)、MBP (1∶50，Abcam 公司)和CNPase (1∶100，Abcam公司)，置于4 ℃冰箱孵育過夜；9) 37 ℃復溫2 h；10) PBS沖洗3次，10 min/次；11) 避光，驢抗小鼠 (Proteintech公司)的熒光二抗 (1∶200)，37 ℃恒溫孵育2 h，PBS沖洗3次，10 min/次；12) 50%甘油封片后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察 BMSCs在受損脊髓的分化情況。

免疫熒光檢測少突膠質細胞凋亡步驟如下：1) 用上述方法對大鼠進行灌注取材后制作冰凍切片于–20 ℃保存；2) 冰凍切片室溫復溫15 min；3) PBS沖洗3次，10 min/次；4) 0.3% Triton破膜30 min；5) PBS沖洗3次，10 min/次；6) 山羊血清 37 ℃封閉 1 h；7) 分別滴加兔來源的一抗caspase 3 (1∶20，Proteintech公司)和小鼠來源CNPase (1∶100，Abcam公司)，置于4 ℃冰箱孵育過夜；8) 37 ℃復溫2 h；9) PBS沖洗3次，10 min/次；10) 避光，滴加驢抗兔 (proteintech公司)、驢抗小鼠 (Proteintech公司)的熒光二抗 (1∶200)，37 ℃恒溫孵育2 h，PBS沖洗3次，10 min/次；11) DAPI 37 ℃孵育15 min后PBS沖洗2次，10 min/次；12) 50%甘油封片后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察caspase 3和CNPase二者共表達的情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)用(±s) 表示，采用 Graphpad Prism7.0進行單因素方差分析，P<0.05認為有顯著性差異。

2 結果

2.1 第三代骨髓間充質干細胞

原代提取的BMSCs在24 h后開始貼壁，呈現(xiàn)梭形或橢圓形；48 h后有細胞集落形成；1周后細胞集落不斷擴大，70%–80%細胞融合時進行傳代；傳代后的BMSCs不斷純化，第3代BMSCs梭形細胞數(shù)量占據(jù)絕對優(yōu)勢。

2.2 大鼠BMSCs的成脂與成骨分化

大鼠BMSCs成脂誘導21 d后，細胞形態(tài)由長梭形變成圓形，胞質內(nèi)出現(xiàn)脂滴，脂滴飽滿，串珠狀排列，油紅 O染色呈鮮紅色 (圖2A)。大鼠BMSCs成骨誘導14 d后，細胞間質內(nèi)形成大量可被茜素紅染成紅色的鈣化樣結節(jié) (圖2B)。

2.3 骨髓間充質干細胞移植治療對運動功能的恢復

為了評估 BMSCs移植后實驗對象的運動功能，我們使用了BBB評定量表評估行為學變化。本實驗選取的實驗動物健康，行動敏捷，造模前BBB評分均為21分，模型組和治療組各有1只造模失敗被排除，脊髓損傷后所有動物呈雙下肢癱瘓。本實驗BBB評分結果如圖3所示：在細胞移植后1、3、7 d均顯示模型組與假手術組相比，BBB評分明顯降低 (#P<0.05)；細胞移植1 d后治療組與模型組相比，大鼠的運動功能評分無明顯差異 ($P>0.05)，在細胞移植后3、7 d顯示治療組比模型組大鼠后肢運動有明顯改善，BBB評分明顯升高 (*P<0.05)。

圖1 光學顯微鏡下觀察第三代骨髓間充質干細胞(Scale bar=100 μm)Fig. 1 Observed the third generation BMSCs under optical microscope. Scale bar=100 μm.

圖2 大鼠BMSCs成脂與成骨分化 (Scale bar=100 μm)Fig. 2 Adipogenic induction and osteogenic induction of BMSCs. Scale bar=100 μm.

圖3 各組BBB評分比較Fig. 3 BBB assessment in each group. #P<0.05 vs sham group *P<0.05, $P>0.05 vs vehicle group.

2.4 移植后的BMSCs分化

雙苯甲亞胺標記的BMSCs移植7 d后在受損脊髓免疫熒光表達情況如圖4所示。部分雙苯甲亞胺標記的陽性細胞表達少突膠質細胞標記物 CNPase和MBP、神經(jīng)元標記物NeuN和MAP2。BMSCs移植后檢測了BDNF、caspase 3蛋白表達水平的變化，結果如圖 5所示。與假手術組比較，模型組 BDNF、caspase 3表達均增加 (#P<0.05)。骨髓間充質干細胞移植后，治療組 BDNF表達水平與模型組相比進一步增加 (*P<0.05)，caspase 3表達則降低 (*P<0.05)。

圖4 雙苯酰亞胺標記的骨髓間充質干細胞移植到受損脊髓7 d后的分化情況 (Scale bar=50 μm)Fig. 4 Differentiation of the bis-benzimide-labeled BMSCs 7 days after transplantation into damaged spinal cord. The transplanted cells have bis-benzimide fluorescence (blue) in their nuclei (A, D, G, J). Immunostaining with antibodies(red) against CNPase (B), MBP (E), MAP2 (H) and NeuN (K). The bis-benzimide-labeled BMSCs express the specific markers of the oligodendrocyte (C, F) and neuron (I, L).

圖5 骨髓間充質干細胞移植后對脊髓損傷大鼠BDNF、caspase 3蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of transplantation of BMSCs on the expressions of BDNF and caspase 3 in rats with spinal cord injury. *P<0.05 vs vehicle group, #P<0.05 vs sham group.

2.5 BMSCs移植通過對脫髓鞘病變有保護作用

本實驗通過鋨酸染色、LFB、TUNEL和透射電鏡研究軸索髓鞘纖維的病理變化，以確定BMSCs移植是否對脫髓鞘病變有保護作用。

2.5.1 鋨酸染色結果

假手術組白質形態(tài)正常，有髓神經(jīng)纖維分布均勻，髓鞘規(guī)則致密 (圖 6A)。模型組顯示白質呈疏松狀，髓鞘變性、潰變、崩解、有髓神經(jīng)纖維缺失 (圖6B)。經(jīng)BMSCs移植后治療組較模型組白質形態(tài)有所改善，有髓神經(jīng)纖維增多，髓鞘潰變、崩解情況趨于好轉 (圖6C)，通過對神經(jīng)殘存數(shù)量進行計數(shù)：經(jīng)骨髓間充質干細胞移植后，神經(jīng)殘損數(shù)量較模型組明顯升高 (*P<0.05)，見圖7。

2.5.2 LFB染色

另外，進行 LFB髓磷脂染色以評估 BMSCs的神經(jīng)保護作用。LFB染色顯示模型組白質排列較紊亂，呈疏網(wǎng)狀，髓鞘水腫，應用骨髓間充質干細胞移植后，上述情況得到明顯改善 (圖 8)。髓鞘纖維計數(shù)顯示：模型組神經(jīng)纖維計數(shù)較假手術組減少，有顯著性差異 (#P<0.05)；治療組較模型組增多，有顯著性差異 (*P<0.05) (圖9)。

圖6 各組大鼠脊髓神經(jīng)纖維的形態(tài)觀察 (鋨酸染色，Scale bar=50 μm)Fig. 6 Observed the morphology of spinal cord nerve fibers in rats of different groups. (A) Shan group. (B) Vehicle group.(C) Treated group. Osmium staining, scale bar=50 μm.

圖7 各組神經(jīng)纖維殘存數(shù)量的比較Fig. 7 The number of nerve fibers remaining in each group.

2.5.3 透射電鏡觀察

我們通過透射電鏡觀察了白質有髓軸突的超微結構特征。假手術組髓鞘結構致密、厚薄均勻，板層結構清晰 (圖 10A)；模型組髓鞘結構松散，板層疏松脫失，形態(tài)不規(guī)則，髓鞘與軸突分離，明暗板層不清 (圖 10B)；治療組上述情況得到明顯改善 (圖 10C)。

圖8 LFB染色觀察各組別有髓神經(jīng)纖維的變化 (Scale bar=100 μm)Fig. 8 Observed the variation of myelinated nerve fiber in LFB staining. Scale bar=100 μm. (A–C) Anterior funiculus.(D–F) Posterior funiculus. (G–I) Posterior funiculus. (A, D, G) Sham group. (B, E, H) Vehicle group. (C, F, I) Treated group.

圖9 各組別有髓神經(jīng)纖維數(shù)量比較Fig. 9 The number of myelinated nerve fibers in each group. *P<0.05 vs vehicle group, #P<0.05 vs sham group.

2.5.4 TUNEL染色觀察

細胞移植7 d后，通過脊髓損傷處上下1 cm區(qū)的脊髓切片 TUNEL染色觀察到出現(xiàn)較多的TUNEL+細胞 (陽性細胞呈紅色圓形)，還觀察到大量TUNEL+的少突膠質細胞 (圖11)；與假手術組相比，模型組的CNPase-TUNEL+細胞明顯增多 (*P<0.05)；與模型組相比，治療組的CNPase-TUNEL+細胞減少(#P<0.05)，見圖12。

2.6 免疫熒光雙標檢測CNPase-caspase 3細胞

本實驗通過免疫熒光雙標檢測不同組別病變部位的少突膠質細胞凋亡情況。假手術組CNPasecaspase 3+細胞數(shù)目較少；模型組CNPase-caspase 3+細胞廣泛分布在白質中；而治療組的 CNPasecaspase 3+細胞散在分布，較模型組明顯減少 (圖13)。

圖10 TEM對不同組別髓鞘超微結構觀察Fig. 10 TEM observation in each group (×50 000). (A) Sham group. (B) Vehicle group. (C) Treated group.

圖11 不同組別白質有髓神經(jīng)纖維TUNEL染色情況Fig. 11 TUNEL staining of myelinated nerve fiber in each group. (A) Sham group, few CNPase-TUNEL+ cells. (B) Vehicle group, CNPase-TUNEL+ cells wildly distributes in the white matter. (C) Treated group, fewer CNPase-TUNEL+ cells than treated group. Arrows represent CNPase-TUNEL+ positive cells.

2.7 各時間點移植效果的檢測

2.7.1 各時間點BBB評分

在時間點實驗中，7 d組的BBB評分與1 d組相比顯著增加 (@P<0.05)，與14 d組相比略有增加 ($P<0.05) (圖14)。以上結果提示損傷7 d后BMSCs移植能顯著提升大鼠運動功能。

2.7.2 各時間點蛋白水平的表達

CNPase和MBP在髓鞘形成起關鍵作用，并且其表達減少表明脫髓鞘的發(fā)生。為了檢測不同時間點移植細胞后脫髓鞘病變，本研究應用 Western blotting檢測1 d組、7 d組和14 d組的MBP和CNPase表達。7 d組MBP和CNPase表達水平明顯升高，與1 d組、14 d組差異顯著 (%P<0.05,&P<0.05vs 7 d group)。同時也檢測了凋亡指標caspase 3在各個時間點組間的表達。與1 d組、14 d組相比，7 d組caspase 3表達水平最低 (圖15)。

圖12 CNPase-TUNEL+細胞數(shù)量計數(shù)Fig. 12 The numbers of CNPase-TUNEL+ cells.#P<0.05 vs vehicle group, *P<0.05 vs sham group.

圖13 免疫熒光雙標結果 (Scale bar=50 μm)Fig. 13 Immunofluorescence of CNPase-caspase 3+. (A) Sham group, few CNPase-caspase 3+ cells. (B) Vehicle group,CNPase-caspase 3+ cells wildly distributes in the white matter. (C) Treated group, fewer caspase 3+-CNPase cells than treated group.

圖14 各時間點組間BBB評分比較Fig. 14 BBB scores were compared between different time point groups. @P<0.05, $P<0.05 vs 7 d group.

圖15 不同時間點移植對脊髓損傷大鼠 CNPase、MBP、caspase 3蛋白表達的影響Fig. 15 Effects of transplantation at different time points on the expressions of CNPase, MBP and caspase 3 in rats with spinal cord injury. %P<0.05, &P<0.05 vs 7 d group.

3 討論

人體神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘由少突膠質細胞和施旺細胞組成，中樞神經(jīng)系統(tǒng)以少突膠質細胞為主要組成部分。髓鞘的功能是形成郎飛結，使神經(jīng)沖動以跳躍方式傳導，從而提高其傳導速度。在脊髓損傷早期出現(xiàn)少突膠質細胞凋亡引起軸突脫髓鞘改變[26]；而髓鞘的缺失將會抑制神經(jīng)沖動的傳導，最終影響神經(jīng)功能正常發(fā)揮[27-28]。因此，對髓鞘的保護在脊髓損傷早期顯得尤為重要。目前，治療脫髓鞘病變的方法有很多，如免疫調節(jié) (激素治療)[29]、降低炎癥反應[30]，但是效果不盡人意。骨髓間充質干細胞是由中胚層發(fā)育的早期細胞，具有多向分化潛能[31]，不但能分化成軟骨[32]、脂肪[33]等中胚層起源細胞，而且能分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞[34]等外胚層細胞。本實驗采用全骨髓差異貼壁法獲得細胞，操作簡單，對細胞活性影響小，獲得的 BMSCs純度較高；并在移植前對其進行多向分化功能鑒定發(fā)現(xiàn)：“油紅O染色”和“茜素紅染色”胞質出現(xiàn)鮮紅的脂滴和細胞間質內(nèi)形成大量紅色的鈣化樣結節(jié)，提示 BMSCs 具有成脂和成骨分化潛能。同時亦證實移植細胞為骨髓間充質干細胞。

本研究采用Rivlin & Tator’s急性硬膜外脊髓鉗夾損傷模型，在脊髓損傷7 d后給予骨髓間充質干細胞移植，對其進行神經(jīng)功能評分，結果顯示，與模型組相比，治療組BBB評分明顯升高，其后肢運動功能有顯著改善；鋨酸染色和LFB染色觀察亦發(fā)現(xiàn)，模型組白質疏松，大量有髓神經(jīng)纖維丟失，而經(jīng)骨髓間充質干細胞移植后白質疏松形態(tài)好轉，髓鞘崩解、水腫情況亦有所改善；同時，透射電鏡結果顯示，假手術組髓鞘厚薄均勻、結構完整，而模型組髓鞘水腫明顯，板層分離嚴重；經(jīng)骨髓間充質干細胞移植后，雖有個別髓鞘板層存在崩解現(xiàn)象，但大多數(shù)髓鞘水腫明顯減輕。以上結果提示，骨髓間充質干細胞移植可明顯減輕急性脊髓損傷脫髓鞘病變，改善急性脊髓損傷后運動功能且對髓鞘具有保護作用。

本實驗中我們檢測了3個時間點 (傷后1 d、7 d和14 d) 研究移植最佳時間。與1 d組相比，7 d組MBP、CNPase蛋白表達增加，caspase 3表達則降低。盡管目前對脊髓損傷的急性和亞急性期沒有明確區(qū)分[35]，但有研究者認為脊髓損傷后24 h為急性期，損傷后7 d為亞急性期[36]。骨髓間充質干細胞在急性期主要作用為抗炎。然而主流觀點認為骨髓間充質干細胞移植主要發(fā)揮替代和橋接作用[37]。同時，亞急性期損傷脊髓的微環(huán)境更適合細胞生長和分化[38-40]。但過長時間的延遲移植并不會產(chǎn)生更佳的治療效果。與14 d組相比，7 d組MBP、CNPase蛋白表達增加，caspase 3表達則降低。通過上述結果可大膽推測，SCI后7 d可能是 BMSCs移植治療的最佳窗口期。瘢痕形成是脊髓損傷的重要病理變化，傷后2周可能導致瘢痕明顯形成，抑制細胞整合和軸突再生[41]。有研究表明，脊髓損傷14 d后，病變部位的蛋白多糖沉積不利于細胞存活[42-43]。同時，亦有研究者認為傷后7 d是移植的最佳時間[44]。因此，我們認為傷后7 d是SCI治療的最佳時間。進一步關于BMSCs在傷后7 d移植的生理和解剖相關研究將提供其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復更有價值的證據(jù)。

BMSCs具有多向分化潛能，大多數(shù)體內(nèi)外實驗證實移植 BMSCs治療脊髓損傷是因其可分化為神經(jīng)元樣細胞包括神經(jīng)元、少突膠質細胞、星形膠質細胞和施萬細胞[45]。然而微環(huán)境對BMSCs的分化起重要作用[46]。有研究者證明 BMSCs移植至腦主要分化為神經(jīng)元[47]，移植至脊髓主要分化為膠質細胞[48]。那么我們推測在急性脊髓損傷微環(huán)境的影響下，BMSCs移植可分化為脊髓神經(jīng)細胞。本實驗通過免疫熒光顯示：標記的BMSCs移植至受損脊髓后可部分分化為帶神經(jīng)元標記物NeuN、MAP2的神經(jīng)元和帶少突膠質細胞標記物CNPase、MBP的少突膠質細胞，這3種細胞均分布在受損脊髓處，表明其對急性脊髓損傷的保護作用可能與 BMSCs的分化有關。但分化是一動態(tài)過程[49]，分化程度與數(shù)量需要進一步研究。此外 BMSCs對受損脊髓的保護亦可能與其分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子有關。Li等證明BMSCs可分泌BDNF且在受損脊髓處長時間表達[50]。Al-Gharaibeh等通過神經(jīng)干細胞移植治療亨廷頓病發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞移植后可分化為神經(jīng)元，且分化的神經(jīng)元可分泌BDNF[51]。而少突膠質細胞移植治療短暫性腦缺血研究亦發(fā)現(xiàn)少突膠質細胞可促進內(nèi)源性 BDNF的分泌[52]。那么我們大膽推測，BMSCs移植至受損脊髓后，在脊髓受損處 BMSCs和分化形成的神經(jīng)元、少突膠質細胞均可通過分泌BDNF而發(fā)揮保護作用。本實驗通過Western blotting結果可印證BDNF的表達在治療組較模型組升高。但有趣的是模型組 BNDF的表達亦比假手術組高，這可能與機體的自身修復有關，即當脊髓損傷后會出現(xiàn)一定程度和時間的內(nèi)源性 BDNF分泌增多[53]。有研究者提出 BDNF在脊髓損傷微環(huán)境中可能是通過抗凋亡對脫髓鞘病變發(fā)揮保護作用[54-55]。本研究通過 TUNEL染色發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞移植可抑制少突膠質細胞凋亡。由此可推測骨髓間充質干細胞移植可能是通過分化為神經(jīng)元和少突膠質細胞并分泌BDNF發(fā)揮抗凋亡而對受損脊髓產(chǎn)生保護作用。亦有研究者證實在慢性脊髓損傷模型中BDNF可通過caspase 3信號通路抗少突膠質細胞凋亡[56]，由此可推測在急性脊髓損傷模型中BDNF也可發(fā)揮同樣作用。本實驗通過免疫熒光CNPase和caspase 3共表達提示：與模型組相比，治療組中CNPase和caspase 3共表達細胞減少；且免疫印跡顯示治療組caspase 3蛋白表達水平比模型組低，這說明骨髓間充質干細胞移植抗少突膠質細胞凋亡可能通過抑制caspase 3發(fā)揮作用。

綜上所述，骨髓間充質干細胞移植對急性脊髓損傷脫髓鞘病變有保護作用。且保護作用是多機制共同參與，本實驗推測其中之一的機制是通過分泌BDNF發(fā)揮抗少突膠質細胞凋亡從而對損傷脊髓有保護作用。然而目前對骨髓間充質干細胞治療急性脊髓損傷為初步研究，諸如微環(huán)境、宿主和移植物相互作用的變化等需要進一步探索。此外，移植后效應也需更長時間的觀察，長期的運動功能和生化檢測將進一步了解骨髓間充質干細胞對脊髓損傷的治療效果。

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