周小利, 楊詩(shī)怡, 陳志蕓, 廖菊夠, 顧 菁, 呂立堂, 陳穗云

(1.云南大學(xué) 云南省高校植物病蟲害生物防控工程研究中心, 昆明 650091; 2.貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025; 3.貴州大學(xué) 茶學(xué)院, 貴陽 550025)

花粉是高等開花植物的重要雄性生殖結(jié)構(gòu)[1]，花粉的正常萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)是保證精子細(xì)胞順利到達(dá)胚囊，并實(shí)現(xiàn)受精作用的前提，在植物生殖繁育過程中有極其重要的作用[2]?；ǚ酃艿目焖偕L(zhǎng)使其穿入雌蕊組織輸送精子完成受精作用[3]。花粉管生長(zhǎng)具有極性，在其進(jìn)行極性生長(zhǎng)時(shí)，不僅需要花粉粒中儲(chǔ)存的物質(zhì)，還需從外界吸收糖分、硼酸和離子等物質(zhì)，以提供花粉管正常生長(zhǎng)和合成新的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。

糖類對(duì)植物花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)非常重要，蔗糖能為花粉的萌發(fā)提供能源物質(zhì)，并且能夠維持花粉與培養(yǎng)液之間滲透平衡，防止花粉和花粉管的損壞和破裂[4]。大多數(shù)植物花粉離體萌發(fā)的蔗糖濃度在10%～20%之間[5]，如培養(yǎng)基中蔗糖濃度過低，提供花粉萌發(fā)的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)不夠，花粉萌發(fā)就會(huì)受到抑制；但培養(yǎng)基中蔗糖濃度過高，則會(huì)造成花粉細(xì)胞原生質(zhì)體脫水，抑制花粉萌發(fā)[6]。高質(zhì)量分?jǐn)?shù)蔗糖會(huì)抑制花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)，而蔗糖是光合作用主要產(chǎn)物，廣泛分布于植物體內(nèi)，它是植物儲(chǔ)藏、積累和運(yùn)輸糖分主要形式，用蔗糖來培養(yǎng)花粉比其他多糖效果更明顯，所以是最適合作為花粉萌發(fā)與花粉管生長(zhǎng)的培養(yǎng)基[7]。硼酸在花粉管生長(zhǎng)過程中也發(fā)揮了重要作用，據(jù)報(bào)道，細(xì)胞中98%的硼位于細(xì)胞壁，硼酸與果膠類物質(zhì)RG2Ⅱ(鼠李半乳糖醛酸2Ⅱ)結(jié)合，使酸性果膠酯化[5]?；ǚ酃苌L(zhǎng)過程中，酯化果膠和酸性果膠集中在花粉管的不同部位，其中酸性果膠在整個(gè)花粉管中積累，而酯化果膠主要集中在花粉管頂端，兩者共同作用增強(qiáng)細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度[8-9]，調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，同時(shí)也阻止酚類物質(zhì)的積累，更好地促進(jìn)花粉管的生長(zhǎng)[10]；另外，硼酸能夠使花粉對(duì)糖的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝增加，進(jìn)而形成糖硼復(fù)合體，增加氧的吸收[11]。一般情況下，花粉中貯存的硼含量不足，當(dāng)花粉在柱頭上萌發(fā)時(shí)，柱頭會(huì)滲出硼離子補(bǔ)償花粉，滿足花粉萌發(fā)的最適硼離子濃度[12-13]。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)信使[14]，具有調(diào)節(jié)胞內(nèi)酶活性、促進(jìn)細(xì)胞壁合成和調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓等多重作用；Ca2+能影響細(xì)胞骨架的組裝、分泌小泡的運(yùn)輸和融合、花粉管生長(zhǎng)方向等[15]。通?；ǚ酃艿捻敹松L(zhǎng)要求細(xì)胞中游離鈣的動(dòng)態(tài)平衡，如平衡被打破，花粉管生長(zhǎng)受抑制。適宜的γ-氨基丁酸(GABA)對(duì)煙草花粉的萌發(fā)也起著重要的作用。適宜濃度的GABA促進(jìn)花粉的萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)，高濃度的GABA抑制花粉管的萌發(fā)[16]。研究表明，GABA能結(jié)合到細(xì)胞膜上，可能通過GABA-B受體來調(diào)節(jié)花粉管Ca2+的通道，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流并調(diào)節(jié)花粉管的極性生長(zhǎng)[17]。非損傷測(cè)微技術(shù)證明了外源GABA會(huì)使花粉管Ca2+內(nèi)流，從而使花粉管內(nèi)Ca2+濃度增加[18]。因此，GABA和Ca2+在影響花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)過程中有相互促進(jìn)和協(xié)調(diào)的作用。

煙草花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)對(duì)煙草雜交育種過程至關(guān)重要。目前，有關(guān)煙草花粉的研究主要集中在花粉活力的測(cè)定[19]、花粉形態(tài)學(xué)[20]和花粉超微結(jié)構(gòu)[21]等方面。課題組前期開展了栽培煙草K326(N.tabacumL.cv.K326)同野生煙草種N.repanda、N.stocktonii(殘波煙草，斯托克通氏煙草，同屬于殘波煙草組)、N.alata(花煙草，碧冬煙亞屬)[22]種間雜交親和性及其生殖生理學(xué)基礎(chǔ)研究，表明N.tabacumL.cv.K32×N.alata表現(xiàn)為花柱雜交不親和障礙，而N.tabacumL.cv.K32×N.repanda、N.stocktonii則表現(xiàn)為柱頭雜交不親和[23-25]。本研究則主要對(duì)這幾個(gè)種花粉離體萌發(fā)的條件進(jìn)行探索，確定了不同煙草種花粉離體萌發(fā)最適的蔗糖、硼酸、鈣離子和GABA濃度，以期豐富煙草花粉離體萌發(fā)影響因素的探究，并為研究上述煙草種間雜交親和性差異的原因提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料的收集與處理

供試材料分別是花煙草(N.alata)、栽培煙草K326(N.tabacumL.cv.K326)、斯托克通氏(N.stocktonii)和殘波煙草(N.repanda)，于2015年10月播種于云南大學(xué)生物館東樓實(shí)驗(yàn)基地，3—5月后，取始開期的花，用鑷子輕輕夾取雄蕊花藥放進(jìn)1.5 mL eppendorf離心管中,室溫放置2 d，待其開裂后收集花粉。用一層濾紙包著大槍頭尾端，然后將濾紙包著的槍頭插進(jìn)真空泵上的橡膠管中，打開抽真空按鈕，將槍口尖的一端放入收集了花粉的離心管中，吸附花粉，花粉被抽到槍頭中和濾紙上，將槍頭中和濾紙上的花粉收集在一個(gè)新的1.5 mL Eppendorf離心管中，而花粉粒殼不會(huì)穿過槍頭尖端，所以仍保留在原來的離心管中，通過這種方式吸附過濾后得到較純凈的花粉，干燥后于4℃下保存7 d待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 煙草花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基的設(shè)置

根據(jù)研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究設(shè)置了4種不同的蔗糖濃度：8%、10%、12%及16%，5種不同的H3BO3濃度：0.03、0.05、0.1、0.2及0.3 g/L，7種不同的CaCl2·2H2O濃度：0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08和0.1 g/L，4種GABA濃度：0.7、1、3和5 mmol/L。每組不同濃度的培養(yǎng)基重復(fù)3次。

首先，僅用4種蔗糖濃度(8%、10%、12%和16%)的單因素培養(yǎng)基離體培養(yǎng)煙草花粉，確定每個(gè)煙草種花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基；在此基礎(chǔ)上，用最適蔗糖濃度+不同濃度的硼酸(0.03、0.05、0.1、0.2和0.3 g/L)確定每個(gè)種最適的蔗糖+硼酸培養(yǎng)基；之后，以最適的蔗糖+硼酸培養(yǎng)基加入不同濃度的Ca2+(0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08和0.1 g/L)，確定每個(gè)種最適的蔗糖+硼酸+Ca2+培養(yǎng)基，并以該培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，尋找各個(gè)種最適的蔗糖+硼酸+Ca2++GABA培養(yǎng)基。

1.2.2 煙草花粉離體培養(yǎng)

用移液槍取200 μL的液體培養(yǎng)基于干凈的96孔板中，將保存在1.5 mL的離心管中的花粉加入蒸餾水混勻后，然后用移液槍分別向每個(gè)孔中加入40 μL的花粉混勻液，用槍吹打混勻。將96孔板用濕潤(rùn)的濾紙遮蓋，放入28℃、黑暗環(huán)境的恒溫烘箱中培養(yǎng)3 h。

1.2.3 鏡檢

花粉在28℃黑暗恒溫烘箱中培養(yǎng)3 h后，用移液槍從96孔板吸取花粉培養(yǎng)液置于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，在Olympus BX51光學(xué)顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)狀況并統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率[萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%]，用測(cè)微尺測(cè)量花粉管的長(zhǎng)度(如花粉管長(zhǎng)度≥花粉直徑為萌發(fā)，花粉管長(zhǎng)度<花粉直徑為未萌發(fā))。每個(gè)樣本統(tǒng)計(jì)150粒以上花粉，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖濃度對(duì)煙草花粉萌發(fā)的影響

統(tǒng)計(jì)萌發(fā)3 h的煙草花粉萌發(fā)率，結(jié)果(圖1)顯示，蔗糖濃度在10%和12%時(shí)，花粉萌發(fā)率較高。N.alata和N.tabacumL.cv.K326花粉最適蔗糖濃度為10%，萌發(fā)率分別為46%和43% (圖1)，N.repanda和N.stocktonii在蔗糖濃度為12%時(shí)，花粉的萌發(fā)率分別達(dá)到最高值39%和36%。隨著蔗糖濃度逐漸升高，煙草花粉的萌發(fā)逐漸下降，在蔗糖濃度高于16%時(shí)，花粉萌發(fā)率低于25%。而在蔗糖濃度低于8%時(shí)，僅有N.alata花粉萌發(fā)率達(dá)到了25%，其他3個(gè)煙草種的花粉萌發(fā)率低于25%。

2.2 硼酸對(duì)煙草花粉萌發(fā)的影響

在最適蔗糖濃度的培養(yǎng)基中，加入不同濃度的硼酸，花粉的萌發(fā)率提高。由圖2可見，硼酸濃度達(dá)到0.05 g/L時(shí)，花粉萌發(fā)率最高，N.alata為72%，N.tabacumL.cv.K326為71%，N.stocktonii和N.repanda都為65%。硼酸濃度超過0.05 g/L 時(shí)，4個(gè)煙草種的花粉萌發(fā)率都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖1 蔗糖濃度對(duì)煙草花粉萌發(fā)生長(zhǎng)的影響Fig 1 The effect of sucrose concentration on tobacco pollen germination

圖2 硼酸濃度對(duì)煙草花粉萌發(fā)生長(zhǎng)的影響Fig 2 The effect of boric acid concentration on tobacco pollen germination

2.3 鈣離子對(duì)煙草花粉萌發(fā)的影響

在最適的蔗糖硼酸培養(yǎng)基中添加不同濃度的Ca2+，結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)，隨著Ca2+濃度的增加，煙草花粉的萌發(fā)率上升。由圖3可見，當(dāng)Ca2+濃度增加到0.05 g/L 時(shí)，花粉萌發(fā)率最高，N.alata和N.tabacumL.cv.K326萌發(fā)率分別為89%和90%，N.repanda和N.stocktonii花粉萌發(fā)率分別達(dá)到83%和86%。在最適0.05 g/L Ca2+濃度時(shí)，N.alata花粉萌發(fā)率比蔗糖硼酸培養(yǎng)基中萌發(fā)率增加20%，N.tabacumL.cv.K326和N.stocktonii增加19%，N.repanda增加21%。當(dāng)Ca2+濃度≥0.1 g/L，N.repanda和N.Stocktonii、N.alata和N.tabacumL.cv.K326的花粉管生長(zhǎng)受到明顯抑制。

2.4 GABA對(duì)煙草花粉萌發(fā)的影響

在最適濃度的蔗糖+硼酸+Ca2+培養(yǎng)基中，加入不同濃度GABA培養(yǎng)4個(gè)煙草種的花粉。從圖4可看出，培養(yǎng)基中加入0.7 mmol/L GABA后，供試的N.tabacumL.cv.K326、N.repanda和N.stocktonii花粉的萌發(fā)率分別為90%、83%和88%，GABA濃度達(dá)到1 mmol/L 時(shí)，3個(gè)種花粉萌發(fā)率分別為92%、 88%和89%(不加GABA時(shí)花粉萌發(fā)率分別為89%、83%和86%)。顯著性差異分析表明：3個(gè)煙草種在加入0.7 mmol/L GABA和1 mmol/L GABA時(shí)，與對(duì)照組CK3(10%蔗糖+0.05 g/L硼酸+0.05 g/L Ca2+，圖4)相比，花粉的萌發(fā)率差異不明顯；而當(dāng)GABA濃度為3 mmol/L時(shí)，GABA對(duì)3個(gè)煙草種的花粉萌發(fā)率起抑制作用；值得注意的是，N.alata花粉加入不同濃度的GABA后，花粉萌發(fā)率降低，加入0.7 mmol/L GABA 時(shí)，花粉萌發(fā)率為81%，加入1 mmol/L GABA 時(shí)，花粉萌發(fā)率為84%。顯著性差異分析表明，這兩種GABA濃度下，N.alata花粉的萌發(fā)率差異不明顯，但均較對(duì)照組(圖5，CK3，萌發(fā)率為89%)萌發(fā)率降低，伴隨GABA濃度升高，其對(duì)花粉萌發(fā)率的抑制作用更明顯。

圖3 Ca2+對(duì)煙草花粉萌發(fā)的影響Fig 3 The effect of calcium concentration on tobacco pollen germinate

圖4 GABA對(duì)煙草種花粉萌發(fā)的影響Fig 4 The effect of GABA concentration on tobacco pollen germinate

根據(jù)上述研究，本實(shí)驗(yàn)在不含Ca2+的培養(yǎng)基中檢測(cè)了GABA對(duì)N.alata花粉離體萌發(fā)的影響，結(jié)果(如圖6)表明：10%蔗糖+0.05 g/L 硼酸培養(yǎng)基中，濃度低于1 mmol/L 的GABA促進(jìn)N.alata花粉離體萌發(fā)，最適GABA濃度為1 mmol/L，高于該濃度則抑制花粉萌發(fā)。在10%蔗糖+0.05 g/L 硼酸+0.05 g/L Ca2+培養(yǎng)基(圖3)和10%蔗糖+0.05 g/L硼酸+1 mmol/L GABA培養(yǎng)基(圖6)中，N.alata花粉萌發(fā)率分別為89%和91%，二者差異不顯著，表明最適濃度的Ca2+和GABA促進(jìn)花粉萌發(fā)的作用相當(dāng)。

圖5 GABA對(duì)煙草種N.alata花粉萌發(fā)的影響Fig 5 The effect of GABA concentration on N.alata pollen germinate

圖6 GABA對(duì)煙草種N.alata花粉萌發(fā)的影響(不含Ca2+)Fig 6 The effect of GABA concentration on N.alata pollen germination (without Ca2+)

3 討論

花粉離體萌發(fā)需要碳源(如蔗糖)、硼酸和礦物質(zhì)(如鈣離子)。蔗糖為花粉萌發(fā)及花粉管壁的合成提供能源物質(zhì)，而硼酸可以加強(qiáng)花粉離體萌發(fā)時(shí)對(duì)糖的吸收和代謝，鈣在花粉管頂端物質(zhì)運(yùn)輸和引導(dǎo)花粉管生長(zhǎng)等過程中具有重要作用[26-31]。GABA則可能通過調(diào)控胞內(nèi)鈣離子引導(dǎo)和調(diào)控花粉管生長(zhǎng)[32]。已有研究表明，蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)具有重要作用。添加適量的蔗糖對(duì)花粉的萌發(fā)有促進(jìn)作用，但蔗糖濃度過高對(duì)花粉的萌發(fā)有抑制作用[33]。本實(shí)驗(yàn)研究得出N.alata、N.tabacumL.cv.K326、N.repanda和N.stocktonii花粉離體萌發(fā)時(shí)，隨著蔗糖濃度的升高，花粉萌發(fā)率逐漸升高，但超過一定的量時(shí)花粉萌發(fā)受到抑制，而且N.alata和N.tabacumL.cv.K326花粉離體萌發(fā)比N.repanda和N.stocktonii需要的蔗糖濃度低，這可能是由不同煙草種之間內(nèi)源糖含量差異引起，也可能是因?yàn)椴煌瑹煵莘N間花粉萌發(fā)的最適滲透壓不同。硼酸能夠增加花粉對(duì)糖的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝，促進(jìn)花粉萌發(fā)[34]。硼對(duì)花藥的花粉產(chǎn)生能力以及花粉粒生活力有重要的作用。硼能刺激花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)[26]。4個(gè)煙草種離體萌發(fā)最適硼酸濃度都為0.05 g/L，超過該濃度則抑制花粉。最適蔗糖培養(yǎng)基中加入硼酸后，煙草花粉的萌發(fā)率有較大提高，這可能是由于硼離子與蔗糖容易形成絡(luò)合物，更有助于糖在植物組織中運(yùn)輸，因此增加了蔗糖的吸收和代謝[35]。除此之外，硼還能參與果膠物質(zhì)的合成，從而有利于花粉管壁的構(gòu)造[13]，促進(jìn)花粉萌發(fā)。

鈣是花粉萌發(fā)中非常重要的一個(gè)影響因子，Ca2+濃度過高將影響花粉管內(nèi)細(xì)胞骨架的生理活動(dòng)，會(huì)使花粉管頂端形成較厚的管壁，導(dǎo)致花粉管的生長(zhǎng)受到抑制，適宜的Ca2+濃度能提高花粉的萌發(fā)率和促進(jìn)花粉管的生長(zhǎng)[26]。外源鈣能促進(jìn)花粉的萌發(fā)，一定濃度的鈣還能使花粉管生長(zhǎng)筆直，源鈣濃度過高會(huì)使花粉管生長(zhǎng)出現(xiàn)細(xì)弱、畸形，而且容易斷落[36]。4個(gè)煙草種最適Ca2+濃度都為0.05 g/L，蔗糖+硼酸培養(yǎng)基中加入Ca2+極大促進(jìn)了供試煙草種花粉離體萌發(fā)，表明煙草花粉離體萌發(fā)生長(zhǎng)需要提供外源的Ca2+，這與花粉在柱頭上萌發(fā)生長(zhǎng)需要雌蕊提供Ca2+一致，可能原因是煙草花粉內(nèi)源Ca2+不能滿足花粉萌發(fā)生長(zhǎng)所需。前人通過高效液相色譜(HPLC)測(cè)定GABA內(nèi)源含量結(jié)果證明，煙草雌蕊組織中GABA從柱頭到子房呈梯度分布，濃度介于0.75～4.2 mmol/L 之間[17]，據(jù)此設(shè)計(jì)的外源GABA濃度為0.7～5 mmol/L。在最適的蔗糖+硼酸+Ca2+培養(yǎng)基中添加GABA表明，N.alata花粉萌發(fā)受抑制的GABA濃度較其他3個(gè)種低。由于前人報(bào)道指出，雌蕊來源的GABA可能通過促進(jìn)花粉的鈣內(nèi)流而調(diào)控其萌發(fā)和生長(zhǎng)[17-18]，據(jù)此推測(cè)導(dǎo)致該結(jié)果的可能原因是，N.alata花粉內(nèi)源鈣離子可能較其他3個(gè)種高，導(dǎo)致其對(duì)GABA的耐受性較低。另外，在無Ca2+的培養(yǎng)基中添加GABA培養(yǎng)N.alata花粉，最適濃度的GABA促進(jìn)N.alata花粉萌發(fā)的效果和Ca2+無顯著差異，該結(jié)果表明，GABA也可能通過不依賴于促進(jìn)外源鈣離子內(nèi)流的途徑，在花粉萌發(fā)過程中發(fā)揮了作用。

4 小結(jié)

上述研究結(jié)果表明，外源提供的蔗糖、硼酸、Ca2+或GABA對(duì)于煙草花粉離體萌發(fā)具有重要作用，蔗糖、硼酸、GABA和Ca2+可能相互作用，共同促進(jìn)花粉離體萌發(fā)。供試不同煙草種離體萌發(fā)所需最適外源物質(zhì)濃度的差異，反映了煙草花粉的種間差異性，這種差異可能對(duì)煙草種間雜交親和性的差異有影響。后續(xù)將進(jìn)一步探究不同煙草種內(nèi)源Ca2+或GABA等物質(zhì)含量差異，及其對(duì)種間雜交親和性差異的影響。

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