朱國念，倪銀蕓，吳思思

(四川大學(xué) 華西醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，成都 610041)

在基因治療中，時常需要使用大質(zhì)粒，用于傳輸大編碼序列如全長肌營養(yǎng)不良蛋白基因[1]或同時轉(zhuǎn)染含有多個基因的大質(zhì)粒(如用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編程)[2]。對于大基因的轉(zhuǎn)染，病毒轉(zhuǎn)染法通常不是最好的選擇，因?yàn)樗鼈兛梢詳y帶的總DNA數(shù)量有限；此外，它們可能存在許多安全性問題，特別針對臨床應(yīng)用的限制。目前基因治療研究最多的是通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法、磷酸鈣沉淀法、電穿孔法及顯微注射法等技術(shù)實(shí)現(xiàn)[3-4]，不同基因轉(zhuǎn)染方法，其轉(zhuǎn)染效率也具有一定的差別。其中脂質(zhì)體介導(dǎo)法具有安全、操作簡便、對細(xì)胞毒性低、低免疫原性等特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用[5]。然而，在體外脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率會隨著質(zhì)粒大小的增加而下降，脂質(zhì)體包裹外源DNA向細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)散過程中強(qiáng)烈依賴于DNA的大小；同時通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在體內(nèi)也觀察到隨著質(zhì)粒的大小增加時，轉(zhuǎn)染效率下降。另一方面，盡管在陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染中，與小質(zhì)量分子相比，大質(zhì)量的質(zhì)粒在核遞送過程中更易受損，已有研究使用等效質(zhì)量或摩爾濃度的不同大小的構(gòu)建體觀察到這種效應(yīng)，表明質(zhì)粒的核遞送可能受細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的速率的限制，小質(zhì)粒通過快速轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞質(zhì)來避免降解，而不是通過飽和細(xì)胞防御[6]。

卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，是用于化學(xué)藥物及重組載體對腫瘤細(xì)胞治療效果評價的重要細(xì)胞系。此細(xì)胞也經(jīng)常用于基因治療有關(guān)功能的研究，在基因敲除實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分最常采用的是外源基因轉(zhuǎn)染的方法來實(shí)現(xiàn)敲除，故采用SKOV3細(xì)胞株來研究轉(zhuǎn)染試劑的效率，為以后基因治療提供更多的基本思路[7-9]。本研究分別用Lipofectamin3000、 FuGENE HD和DNA-In CRISPR 3種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染帶有綠色熒光蛋白的大質(zhì)粒pAdeasy-1-EGFP(35 kb)質(zhì)粒進(jìn)入SKOV3細(xì)胞，以探究較適合轉(zhuǎn)染大質(zhì)量質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系和質(zhì)粒

293T細(xì)胞、SKOV3細(xì)胞、pAdeasy-1-EGFP質(zhì)粒，均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司、DNA-In CRISPR轉(zhuǎn)染試劑購自Amsbio公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自東仁化學(xué)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒制備

在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中轉(zhuǎn)化pAdeasy-1-EGFP質(zhì)粒，在培養(yǎng)平板中倒置培養(yǎng)過夜后挑出陽性克隆，在含有卡那霉素抗性的溶菌肉湯培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，按照質(zhì)粒提取試劑盒中的產(chǎn)品說明書進(jìn)行提取純化，并測定濃度和純度。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

熒光觀察：將SKOV3細(xì)胞分別按3×104/孔接種于24孔板，待細(xì)胞融合至約60%融合度時轉(zhuǎn)染pAdeasy-1-EGFP質(zhì)粒，每孔轉(zhuǎn)染1 μg質(zhì)粒。Lipofectamine 3000和DNA-In CRISPR分別以轉(zhuǎn)染試劑(μL)∶質(zhì)粒(μg)=2∶1的比例配制脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物；FuGENE HD則以3∶1的比例配制脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物，后續(xù)轉(zhuǎn)染步驟分別按每種轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，在37℃培養(yǎng)24 h后觀察分析轉(zhuǎn)染效率。

CCK8檢測細(xì)胞增殖：將293T細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞分別按1×104/孔接種于96孔板，待細(xì)胞融合至約60%融合度時轉(zhuǎn)染pAdeasy-1-EGFP質(zhì)粒，每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒0.1 μg。3種轉(zhuǎn)染按比例配制脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物，后續(xù)步驟嚴(yán)格按照每種轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。37℃培養(yǎng)24 h后檢測細(xì)胞增殖情況。

1.2.3 熒光顯微鏡采圖

在轉(zhuǎn)染24 h后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基，使用ZEISS倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號，使用顯微鏡自帶ZEN軟件對熒光信號進(jìn)行采集與分析，以確定熒光細(xì)胞的比例。

1.2.4 細(xì)胞活性檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，按照每孔培養(yǎng)基體積∶CCK-8 溶液體積=10∶1的比例加入10 μL的CCK8，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng) 2 h，在酶標(biāo)儀450 nm 處測定各孔的吸光度值以此來計算細(xì)胞增殖情況。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，所獲得的數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計學(xué)分析中平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來表示，不同轉(zhuǎn)染試劑組間細(xì)胞活性的對比采用單因素方差分析，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計均在Graphpad Prism軟件中完成分析處理。

2 結(jié)果

2.1 293T和SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比較

圖1 DNA-In CRISPR轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞后熒光圖(5×)Fig 1 The fluorescence of 293T and SKOV3 cells transported by DNA-In CRISPR (5×)

a、b：293T和SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光; c、d：293T和SKOV3細(xì)胞明場

將DNA-In CRISPR(μL)和pAdeasy-1-EGFP質(zhì)粒(μg)以2∶1的比例配制脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物，對293T細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24 h后通過熒光顯微鏡觀察熒光信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)針對這兩種細(xì)胞，SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約5%，293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不到1%(圖1)。因此可得，同種轉(zhuǎn)染試劑針對不同細(xì)胞其轉(zhuǎn)染效率也會有所不同；而對于SKOV3細(xì)胞，需要使用更為合適的轉(zhuǎn)染試劑以此來提高其轉(zhuǎn)染效率。

2.2 3種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞的效率比較

將Lipofectamine 3000、FuGENE HD、DNA-In CRISPR 3種轉(zhuǎn)染試劑與pAdeasy-1-EGFP質(zhì)粒以不同比例配制成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物后對SKOV3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，作用24 h后用熒光顯微鏡觀察熒光情況，圖像結(jié)果表明Lipofectamine 3000(2∶1)的轉(zhuǎn)染效率高于50%；而FuGENE HD(3∶1)的轉(zhuǎn)染效率約20%；DNA-In CRISPR(2∶1)轉(zhuǎn)染效率在5%左右(圖2)。

圖2 3種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞熒光(5×)Fig 2 The fluorescence of SKOV3 cells transported by three transfection reagents(5×)

a、b、c：Lipofectamine 3000、FuGENE、DNA-In CRISPR轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞熒光圖; d、e、f：Lipofectamine 3000、FuGENE、DNA-In CRISPR轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞明場圖

2.3 3種轉(zhuǎn)染試劑對SKOV3細(xì)胞活性的影響

通過用CCK-8法檢測3種轉(zhuǎn)染試劑對SKOV3細(xì)胞增殖情況的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，Lipofectamine 3000、FuGENE HD和DNA-In CRISPR對SKOV3細(xì)胞增殖影響無明顯差異，Lipo3000轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞24 h后細(xì)胞活性達(dá)到97.5%±2.52%，F(xiàn)uGENE和DNA-In 轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞活性分別為89.5%±2.43%和95.5%±3.48%(圖3)，3種轉(zhuǎn)染試劑毒性均相對較低。

圖3 3種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞24 h后細(xì)胞活性Fig 3 The activity of SKOV3 cells transported for 24 hours

3 討論

目前轉(zhuǎn)染大質(zhì)粒的研究逐步增多，隨著大質(zhì)粒疫苗和產(chǎn)品的出現(xiàn)，獲得一個合格的藥用DNA建立穩(wěn)定宿主菌從而建立生產(chǎn)平臺成為一個重大研究方向[10]。除此之外，許多蛋白質(zhì)表達(dá)與功能研究都需要將大質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞或者菌株內(nèi)部，多種染色體編碼蛋白的豐度發(fā)生了變化從而研究大質(zhì)粒能否調(diào)控染色體編碼基因的表達(dá)[11]。針對不同實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，人們通常采用電穿孔法、病毒轉(zhuǎn)染法或使用脂質(zhì)體介導(dǎo)和腺病毒輔助共轉(zhuǎn)染的方式進(jìn)行大片段質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染[12-13]。楊蔚等在研究中顯示對于MDR胃癌細(xì)胞、HepG2細(xì)胞，電穿孔轉(zhuǎn)染法不易受其細(xì)胞膜成分的影響，能明顯提高大片段載體的轉(zhuǎn)染效率[14]，但是在李亞等的研究中顯示幾種轉(zhuǎn)染方法中電穿孔法細(xì)胞活力最低[15]，此外也有文獻(xiàn)顯示影響電穿孔法轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞活性的因素較多，如脈沖強(qiáng)度、脈沖時間、電穿孔介質(zhì)、溫度、細(xì)胞生長狀態(tài)等，實(shí)驗(yàn)過程中諸多因素不易控制。病毒轉(zhuǎn)染法是體外培養(yǎng)神經(jīng)元、組織切片及體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)效率最高的一種方法，主要病毒載體有腺相關(guān)病毒、腺病毒、單純孢疹病毒、慢病毒等；但考慮到安全性、經(jīng)濟(jì)、時間、細(xì)胞毒性，此種方法的應(yīng)用受到一定的限制[16]。

在本研究中，為了能夠獲得轉(zhuǎn)染pAdeasy-1-EGFP質(zhì)粒到SKOV3細(xì)胞效率較高的轉(zhuǎn)染試劑，我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，按轉(zhuǎn)染試劑的比例以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量進(jìn)行調(diào)整選擇最優(yōu)的轉(zhuǎn)染大質(zhì)粒的條件。結(jié)果表明陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞24 h后細(xì)胞活性達(dá)到97.5%，轉(zhuǎn)染效率大于50%，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率高于FuGENE HD，而DNA-In CRISPR轉(zhuǎn)染效率最低(見圖2和3)。有研究表明轉(zhuǎn)染效率到達(dá)38.36%以上即為有效的轉(zhuǎn)染手段[17-18]，我們的研究結(jié)果與此相符合。此外考慮到轉(zhuǎn)染方法對細(xì)胞活性會產(chǎn)生重要影響，因此在保證較高轉(zhuǎn)染效率的同時也要盡量減少對細(xì)胞的毒性。3種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞24 h后檢測細(xì)胞活性結(jié)果顯示，3種轉(zhuǎn)染試劑的毒性均相對較小，無明顯差異(見圖 3)。因此綜上考慮，在這3種轉(zhuǎn)染試劑中Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率最高，而且轉(zhuǎn)染毒性相對較低，更適合用于較大質(zhì)粒pAdeasy-1-EGFP的轉(zhuǎn)染。

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