王俊娟，陸許可，郭麗雪，陰祖軍，王德龍，陳修貴，王帥，樊偉麗，陳超，葉武威

（中國農業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室/農業(yè)部棉花生物學與遺傳育種重點實驗室，河南安陽455000）

脫水素（DHNs）屬于 LEA 蛋白（Late embryogenesis abundant protein，胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白）家族中的第二類[1]。脫水素基因受干旱、低溫、高鹽等逆境誘導，在植物響應非生物脅迫和適應性調控中起著重要作用[2]。

Gilmour等[3]克隆了擬南芥基因AtCOR47，屬于脫水素基因。Welin等[4]進一步研究表明，At-COR47是1個低溫響應基因，同時響應脫落酸（Abscisic acid，ABA）和干旱脅迫。 前期研究中，我們克隆了陸地棉的脫水素基因GhDHN1[5]，試驗結果顯示，GhDHN1響應低溫脅迫，在細胞膜附近發(fā)揮作用，與擬南芥脫水素基因AtCOR47有相似的功能。比較基因組學在后基因組時代是1門重要的工具學科。通過不同物種間的基因組序列比較，可以在功能基因組學的研究中將發(fā)揮重要作用[6]。本研究將棉花脫水素基因與模式植物擬南芥的脫水素基因進行比較，對他們的基因結構、蛋白質特性、蛋白質基序以及基因功能等方面進行系統(tǒng)分析，為研究GhDHN1基因的功能、物種的進化關系奠定基礎，為進一步研究棉花脫水素基因GhDHN1的應用提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 供試數(shù)據(jù)庫和基因

陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫（http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp）[7]和擬南芥數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis.org/）。供試基因：陸地棉脫水素基因GhDHN1[5]，在陸地棉數(shù)據(jù)庫中編號為CotAD_58358；擬南芥脫水素基因AtCOR47[3-4]，在擬南芥數(shù)據(jù)庫中編號為At1g20440。

1.2 方法

1.2.1脫水素基因GhDHN1和AtCOR47啟動子、DNA序列和CDS序列的獲得。在NCBI上下載最新的BLAST程序包，將BLAST本地化[8]，同時將GhDHN1和AtCOR47基因所需數(shù)據(jù)本地化。利用王俊娟等[5,9]報道的GhDHN1以及陸地棉數(shù)據(jù)庫中DNA序列位置，將GhDHN1基因的啟動子、DNA序列、CDS調取出來；依據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫中脫水素基因（At1g20440）的信息將擬南芥脫水素基因At-COR47的啟動子、DNA序列、CDS調取出來。

1.2.2染色體定位。將GhDHN1、AtCOR47的DNA序列分別與陸地棉和擬南芥的基因組數(shù)據(jù)進行比對，分別獲得GhDHN1、AtCOR47在染色體上的位置。

1.2.3脫水素GhDHN1、AtCOR47基因結構分析。利用在線軟件 Gene Structure Display Server（GSDS2.0，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[10]將GhDHN1 和AtCOR47的CDS與其對應的DNA序列進行比對，確定GhDHN1的外顯子/內含子結構，確定內含子的位置。

1.2.4脫水素GhDHN1、AtCOR47所編碼蛋白的性質分析。利用ProtParam在線程序（http://web.expasy.org/protparam/）對 GhDHN1、AtCOR47 蛋白質性質進行分析。

1.2.5脫水素GhDHN1、AtCOR47同源性比較。利用在線分析工具EMBOSS Water（https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/）分析GhDHN1 和AtCOR47的DNA序列、CDS、內含子以及其編碼蛋白質的一致性和相似性，參數(shù)設置為：空位罰分（Gap_penalty）為 10、延伸罰分（Extend_penalty）為 0.5。

1.2.6脫水素GhDHN1、AtCOR47內含子比較。利用DNAMAN 6.0軟件計算GhDHN1和AtCOR47基因的DNA序列和內含子中AT含量。

1.2.7GhDHN1和AtCOR47的啟動子中順式作用元件分析。利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫P1antCARE在線啟動子預測工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 預 測GhDHN1和的AtCOR47啟動子和內含子中的順式調控元件。

2 結果與分析

2.1 GhDHN1和AtCOR47基因染色體定位以及基因結構分析

染色體定位結果表明，GhDHN1位于陸地棉D亞組第9號染色體，DNA序列為726 bp?；蚪Y構分析表明，GhDHN1的DNA序列含有1個長度為90 bp的內含子，2個外顯子長度分別為258 bp和378 bp；AtCOR47位于擬南芥1號染色體上，DNA序列為943 bp，含有1個145 bp的內含子，2個外顯子長度分別為339 bp和459 bp（表1）。

表1 GhDHN1和AtCOR47基因的分子特征

圖1顯示，AtCOR47的DNA序列長于GhDHN1的DNA序列，內含子和外顯子均長于GhDHN1的外顯子長度；這兩個基因的第2個外顯子均長于第1個外顯子。GhDHN1定位于細胞膜附近[5]，AtCOR47定位于細胞質、細胞膜和細胞核中。

圖1 GhDHN1和AtCOR47基因的內含子-外顯子結構分析

2.2 GhDHN1和AtCOR47蛋白性質及同源性比較

由表2可以看出，GhDHN1和AtCOR47蛋白均為酸性，帶負電荷，屬于親水性蛋白質。AtCOR47的酸性強于GhDHN1，親水性也略高于GhDHN1。

利用在線分析工具EMBOSS Water分析兩基因以相關序列的同源性，結果表明，GhDHN1和AtCOR47的DNA序列、CDS、蛋白質序列和內含子序列的一致性分別為 53.80%、56.80%、45.2%、42.7%（表 3）。

2.3 GhDHN1和AtCOR47基因所編碼的蛋白質結構域分析

GhDHN1與AtCOR47基因所編碼的蛋白質均屬于SKn型脫水素，但不同的是GhDHN1的N段含有 1個S片段，C段含有2個K片段[9]，而 At-COR47的N段含有1個S片段，C段含有3個K片段[4]，比GhDHN1蛋白多了1個K片段。

2.4 GhDHN1和AtCOR47基因內含子比較

利用 DNANMAN 6.0軟件，GhDHN1基因DNA序列中AT堿基含量占52.62%，內含子序列中AT堿基含量占63.33%；而AtCOR47 DNA序列中AT堿基含量占54.61%，內含子序列中AT堿基含量占75.86%。2個基因的外顯子和內含子的剪接方式類似，均符合GT-AG規(guī)則。內含子均位于編碼S片段的核苷酸之間。

表2 GhDHN1和AtCOR47蛋白質性質比較

2.5 GhDHN1和AtCOR47基因啟動子中順式作用元件比較

GhDHN1和AtCOR47基因的啟動子中均含有參與非生物逆境脅迫響應的順式作用元件包括：無氧誘導必需順式作用調控元件、高溫脅迫響應順式作用元件、低溫響應順式作元件、參與干旱誘導的MYB結合位點，說明兩個基因在響應非生物逆境脅迫功能上極為相似，但AtCOR47基因中無參與保衛(wèi)與脅迫響應順式作用元件 （TC-rich repeats），推測GhDHN1擁有AtCOR47不具有的獨特抗逆功能。GhDHN1和AtCOR47基因的啟動子中均參與激素響應的順式作用元件包括：脫落酸響應元件、赤霉素響應元件、赤霉素響應元件、水楊酸響應元件，而AtCOR47基因的啟動子中含有2個GhDHN1啟動子中沒有的乙烯響應元件。

3 討論與結論

脫水素的結構是其行使功能的前提條件。K片段是脫水素的特征結構域[11]，K片段富含賴氨酸，其所形成的雙親性螺旋與部分變性蛋白的疏水位點相結合，起到類似于分子伴侶的作用[12]。Reyes等[13]研究表明，K片段是脫水素起冷凍保護作用的基本結構。Lin等[14]研究表明COR47作為低溫保護劑可能幫助植物忍受與冷凍相關的脫水逆境；Puhakainen等[15]轉基因試驗表明，在擬南芥中過表達AtCOR47等脫水素基因時，低溫脅迫后在轉基因體內積累了大量的脫水素，與對照相比，轉基因植株在受到冷凍時 （－10℃）表現(xiàn)出較低的LT50值（Lethal temperature of 50%，半致死溫度）和較高的存活率。同時證明了AtCOR47提高植株的抗凍性部分原因是由于AtCOR47對細胞膜所起的保護作用。而GhDHN1基因在僅響應4℃度低溫脅迫[5]，這也許與AtCOR47蛋白比GhDHN1多1個K片段有關，今后的工作重點可適當集中到對K片段功能的研究上。

許多脫水素響應激素脫落酸的刺激，因此被稱為 RAB 蛋白（Responsive to ABA）[16]。 Welin 等[4]研究表明，AtCOR47響應低溫脅迫的同時響應脫落酸 （ABA）和干旱脅迫，因此屬于RAB蛋白。GhDHN1和AtCOR47的啟動子中均含有脫落酸響應元件和參與干旱誘導的MYB結合位點元件，所以推測，GhDHN1也可能屬于RAB蛋白，同時響應ABA脅迫和干旱脅迫，該結論需進一步的試驗驗證。

[1]Bray E A.Molecular responses to water deficit[J].Plant Physiology,1993,103(4):1035-1040.

[2]Ingram J,Bartels D.The molecular basis of dehydration tolerance in plants[J].Annual Review of Plant Physiology and Plant molecular Biology,1996,47:377-403.

[3]Gilmour S J,Artus N N,Thomashow M F.cDNA sequence analysis and expression of two cold-regulated genes ofArabidopsis thaliana[J].Plant Molecular Biology,1992,18(1):13-21.

[4]Welin B V,Olson A,Palva E T.Structure and organization of two closely related low-temperature-induceddhn/lea/rab-like genes inArabidopsis thalianaL.Heynh[J].Plant Molecular Biology,1995,29(2):391-395.

[5]王俊娟,穆敏,王帥,等.棉花脫水素GhDHN1的克隆及其表達[J].中國農業(yè)科學,2016,49(15):2867-2878.

[6]張森,李輝,顧志剛.功能基因組學研究的有力工具——比較基因組學[J].東北農業(yè)大學學報,2005,36(5):664-668.

[7]Li Fuguang,Fan Guangyi,Lu Cairui,et al.……（王俊娟，等）陸地棉脫水素基因GhDHN1與擬南芥AtCOR47基因的比較Genome sequence of cultivated upland cotton(Gossypium hirsutumTM-1)provides insights into genome evolution[J].Nature Biotechnology,2015,33(5):524-530.

[8]冉昆，王少敏.Windows 7平臺下BLAST本地化構建[J].落葉果樹，2015，47(3)：39-42.

[9]王俊娟,陰祖軍,王德龍,等.陸地棉脫水素蛋白GhDHN1的結構特征和無序性分析[J].中國棉花,2017,44(8):17-19.

[10]Hu Bo,Jin Jinpu,Guo Aayuan,et al.GSDS 2.0:An upgraded gene feature visualization server[J].Bioinformatics(Oxford,England),2015,31(8):1296.

[11]Close T J.Dehydrins:Emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins[J].Physiologia Plantarum,1996,97(4):795-803.

[12]Kovacs D,Kalmar E,Torok Z,et al.Chaperone activity of ERD10 and ERD14,two disordered stress-related plant proteins[J].Plant Physiology,2008,147(1):381-390.

[13]Reyes J L,Campos F,Wei H,et al.Functional dissection of hydrophilins duringin vitrofreeze protection[J].Plant Cell Environment,2008,31(12):1781-1790.

[14]Lin Chentao,Guo Weiwen,Everson E,et al.Cold acclimation inArabidopsisand wheat:A response associated with expression of related genes encoding'boiling-stable'polypeptides[J].Plant Physiology,1990,94(3):1078-83.

[15]Puhakainen T,Hess M W,Ma¨kela¨P,et al.Overexpression of multiple dehydrin genes enhances tolerance to freezing stress inArabidopsis[J].Plant Molecular Biology,2004,54(5):743-753.

[16]Moez Hanin,Brini F,Ebel C,et al.Plant dehydrins and stress tolerance[J].Plant Signaling&Behavior,2011,6(10):1503-1509.●