郭茂東 王群英 陳燕萍 滕衛(wèi)軍 馬擁軍 楊小云 韋煒 丁進(jìn)

克羅恩?。–rohn′s disease，CD）是一種累及全消化道的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，病因至今未明。遺傳免疫學(xué)因素在其發(fā)病中的作用一直備受關(guān)注[1]。以Th1細(xì)胞亞群異常極化為特點的細(xì)胞免疫應(yīng)答失衡已被證實是CD的重要發(fā)病機(jī)制之一[2]。IL-12可促進(jìn)原始T淋巴細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分泌干擾素γ、TNF-α等炎癥因子,在調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)中起重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，CD患者腸黏膜IL-12 mRNA表達(dá)上調(diào)[4]。同時，動物實驗表明給予外源性IL-12不僅會使小鼠結(jié)腸炎癥加重，且更易發(fā)生爆發(fā)性結(jié)腸炎，甚至死亡[5]，而采用特異性抗體封閉IL-12則能明顯減輕小鼠結(jié)腸炎癥癥狀[6]。這些研究表明，IL-12可能在CD的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。IL-12由p40和p35 2個亞基組成，其中p40亞基的表達(dá)只局限于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞，對IL-12的表達(dá)水平具有決定性作用[7]。IL-12 p40表達(dá)受其IL-12B遺傳多態(tài)性影響[8]。目前，日本及部分高加索人群的研究證實IL-12B基因多態(tài)性與CD易感性相關(guān)[9-10]，我國漢族人群CD與IL-12B基因多態(tài)性的相關(guān)性報道少見。一項關(guān)于亞洲人群的研究表明rs3212227和rs6887695是IL-12B的2個常見功能性單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點[11]。本研究探討這2個SNP位點與CD易感性的關(guān)系，旨在為進(jìn)一步闡明CD的遺傳免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制提供理論參考，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年1月至2017年12月金華市中心醫(yī)院、金華市人民醫(yī)院消化內(nèi)科收治的CD患者94例（CD組）。CD診斷標(biāo)準(zhǔn)參照“炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2012年，廣州）”[12]?；颊呔?jīng)臨床、實驗室、電子結(jié)腸鏡、放射影像學(xué)及病理組織學(xué)檢查等明確診斷；按結(jié)腸鏡下CD病變范圍分為回腸型40例、結(jié)腸型12例、回結(jié)腸型42例，其中結(jié)腸型和回結(jié)腸型合并為結(jié)腸病變CD組；按疾病類型分為非狹窄非穿透型35例、狹窄型32例，穿透型27例。另擇同期在金華市中心醫(yī)院體檢的106例健康體檢者作為對照組。CD組與對照組均排除哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等自身免疫性疾病以及肺癌、肝癌、胃癌等腫瘤病史。兩組受檢者性別、年齡、吸煙史比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1，且為無血緣關(guān)系的浙江漢族人群。本研究經(jīng)金華市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受檢者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取受檢者外周靜脈血約3ml，乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2抗凝。用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取全基因組DNA。采用1%瓊脂糖電泳對所獲得的DNA樣本進(jìn)行質(zhì)量檢查及濃度檢測，然后根據(jù)檢測的濃度將樣本稀釋到工作濃度10ng/μl后置于-20℃冰箱凍存。

表1 兩組受檢者性別、年齡、吸煙史比較

1.2.2 改良多重高溫連接酶檢測反應(yīng)（iMLDR）技術(shù)檢測IL-12B基因多態(tài)性（rs3212227和rs6887695）

1.2.2.1 多重PCR獲取目的基因片段 所需PCR擴(kuò)增引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。rs3212227上游引物：5′-GAAGGCCCATGGCAACTTGAG-3′，下游物：5′-CAATGTCACCCCACATCAACTTTTG-3′。rs6887695上游引物：5′-ACCCAGGGAAGGTGTGCTTCTC-3′，下游引物：5′-CACCCCTGAAGCGAGGTCAAAT-3′?？偡磻?yīng)體系20μl，包含1×HotStarTaq緩沖液（大連寶生物工程有限公司），3.0mmol/L Mg2+（大連寶生物工程有限公司），0.3mmol/L dNTP（上海捷瑞生物工程有限公司），1U HotStarTaq聚合酶（德國Qiagen公司），1μl模板DNA和1μl多重PCR引物（引物濃度：rs3212227 1mmol/L，rs6887695 2mmol/L）。反應(yīng)條件：95℃ 2min；94℃ 20s，65℃ 40s（每個循環(huán)減0.5℃），72℃ 1.5min，共11個循環(huán)；94℃ 20s，59℃ 30s，72℃ 1.5min，共 24 個循環(huán)；72℃2min；置于 4℃保存。

1.2.2.2 多重PCR產(chǎn)物純化 在10μl PCR產(chǎn)物中加入5 U蝦堿性磷酸酶（SAP，美國Promega公司）和2U核酸外切酶（Exo I，美國Epicentre公司），37℃溫浴1h，然后75℃滅活15min。

1.2.2.3 iMLDR連接反應(yīng) 連接反應(yīng)體系包含10×連接緩沖液 1μl，純化后多重 PCR 產(chǎn)物 2μl，雙蒸水 6μl，高溫連 接 酶 0.25μl，5′連接 引物 混 合液（1μmol/L）0.4μl，3′連接引物混合液（2μmol/L）0.4μl，連接酶引物序列分別為 rs3212227:FG5′-TTCCGCGTTCGGACTGATATGCTGATTGTTTCAATGAGCATTTAGCAACG-3′；FP5′-AACTATACAAATACAGCAAAGATATCATTGTGATC-3′；FT5′-TACGGTTATTCGGGCTCCTGTGCTGATTGTTTCAATGAGCATTTAGCAGCT-3′。rs6887695:FC 5′-TGTTCGTGGGCCGGATTAGTCAGTTTGAGAGA－AGCAGTGTAGTGTAGTGTTC-3′;FG5′-TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTCAGTTTGAGAGAAGCAGTGTAGTGTAGTGTTG-3′;FP5′-AATAGTCTGGATTTACATCTTTGATCTTCCA-3′。連接反應(yīng)條件：94℃ 1min，56℃ 4min，共38個循環(huán)；置于4℃保存。

1.2.2.4 基因型判讀 取0.5μl稀釋后的連接反應(yīng)產(chǎn)物，與 9μl甲酰胺、0.5μl內(nèi)標(biāo)混勻，95℃變性 5min 后用ABI 3730XL測序儀（美國ABI公司）測序。最后采用GeneMapper 4.1軟件（美國ABI公司）判讀基因型。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較兩組受檢者的IL-12B基因多態(tài)性；分析IL-12B基因連鎖不平衡關(guān)系和單倍型，以及IL-12B基因多態(tài)性與CD患者病變部位、疾病類型的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用χ2檢驗分析IL-12B 2個SNP位點（rs3212227和rs6887695）的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用logistic回歸分析比較兩組間IL-12B 2個SNP位點的等位基因和基因型頻率的分布差異，以及IL-12B基因多態(tài)性與CD病變部位、類型的相關(guān)性。采用Haploview 4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡關(guān)系與單倍型分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受檢者IL-12B基因多態(tài)性比較 對照組受檢者IL-12B rs3212227、rs6887695位點的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（均P＞0.05）。CD組患者與對照組受檢者IL-12B rs3212227、rs6887695位點的基因型與等位基因頻率比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），見表2。

表2 兩組受檢者IL-12B基因多態(tài)性比較[頻次（%）]

2.2 IL-12B基因連鎖不平衡關(guān)系和單倍型分析 連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)rs3212227和rs6887695 2個SNP位點之間存在中等強(qiáng)度的連鎖不平衡關(guān)系（D′=0.545，r2=0.235），見圖1。應(yīng)用Haploview 4.2軟件共構(gòu)建4種單倍型，在兩組受檢者間分析上述4種單倍型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各單倍型頻率在兩組間分布均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），見表3。

圖1 IL-12B基因連鎖不平衡模式圖（方塊中數(shù)字代表2個SNP位點間的D′值；Block 1代表IL-12B基因各個SNP位點間存在連鎖不平衡）

表3 兩組受檢者IL-12B基因rs3212227、rs6887695位點4種單倍型比較[頻次（%）]

2.3 IL-12B基因多態(tài)性與CD病變部位、類型的關(guān)系采用非條件logistic回歸分析IL-12B基因rs3212227和rs6887695位點的等位基因和基因型頻率與CD病變部位的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-12B rs6887695位點的基因多態(tài)性與CD的病變部位有關(guān)（均P＜0.05）。與對照組相比，回腸型CD組患者rs6887695位點的C等位基因和GC+CC基因型頻率均明顯降低（28.75%vs 44.34%，P＜0.05，OR=0.507，95%CI:0.291～0.882；50.00%vs 71.70%，P＜0.05，OR=0.395，95%CI:0.186～0.836）；而 rs3212227和rs6887695位點的等位基因及基因型頻率分布在結(jié)腸病變CD組和對照組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。進(jìn)一步CD組內(nèi)分層比較發(fā)現(xiàn)，與結(jié)腸病變CD組比較，回腸型CD組患者rs6887695位點的C等位基因、GC+CC基因型以及CC基因型頻率亦均降低（28.75%vs 50.00%，P＜0.05，OR=0.404，95%CI:0.218～0.745；50.00%vs 72.22%，P＜0.05，OR=0.385，95%CI:0.163～0.908；7.50%vs 27.78%，P＜0.05，OR=0.150，95%CI:0.037～0.613），見表4。根據(jù)疾病行為進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示IL-12B基因多態(tài)性與CD疾病類型無關(guān)（P ＞0.05），見表5。

表4 IL-12B基因多態(tài)性與CD病變部位的關(guān)系[頻次（%）]

表5 IL-12B基因多態(tài)性與CD疾病類型的關(guān)系[頻次（%）]

3 討論

IL-12B基因定位于第5號染色體5q31-33區(qū)域，全長15kb，包含8個外顯子，編碼相對分子量為40KD的細(xì)胞因子受體樣亞基p40。p40與IL-12A基因編碼的細(xì)胞因子受體樣亞基p35通過二硫鍵連接形成具有生物學(xué)活性IL-12。由于人類p35為組成性表達(dá)，而p40為調(diào)節(jié)性表達(dá)，因此IL-12B基因?qū)L-12的表達(dá)水平及生物學(xué)功能影響意義更大[13]。rs3212227和rs6887695是IL-12B的2個SNP位點，其中rs3212227位于3′非翻譯區(qū)（UTR）。研究表明該多態(tài)性位點可能影響IL-12B mRNA穩(wěn)定性及IL-12蛋白表達(dá)水平[14]。來自健康人群的研究發(fā)現(xiàn)rs3212227位點純合子突變CC基因型攜帶者外周血單個核細(xì)胞活化后所表達(dá)的IL-12蛋白水平顯著高于AA基因型或AC基因攜帶者[14]。rs6887695位于IL-12B基因5′上游調(diào)控區(qū)域，有研究顯示該多態(tài)性位點可能影響轉(zhuǎn)錄因子 TSF1、MZF1、Oct-1、RORα 與DNA片段的親和力，因此是潛在的功能性位點[10]。迄今的研究已經(jīng)證實IL-12B（rs3212227和rs6887695）基因多態(tài)性與哮喘[15]、銀屑病[16]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[17]、Ⅱ型糖尿病[18]等多種免疫系統(tǒng)疾病相關(guān)。

本研究對照組受檢者IL-12B的突變等位基因G、C的頻率分別為49.53%、44.34%，與數(shù)據(jù)庫中千人基因組計劃所報道的中國南方人群的最小等位基因頻率（MAF）基本相符（rs3212227:47.4%，rs6887695:44.2%）。整體比較結(jié)果顯示，IL-12B 2個SNP位點（rs3212227和rs6887695）的等位基因和基因型頻率在對照組和CD組之間的分布均無統(tǒng)計學(xué)差異，表明IL-12B基因多態(tài)性與浙江漢族人群CD的易感性無關(guān)，這一結(jié)論與來自西班牙[19]、瑞典[20]以及新西蘭人群[21]的研究發(fā)現(xiàn)基本一致，而有學(xué)者報道盡管rs3212227多態(tài)性與CD易感性無關(guān)，但rs6887695突變后增加德國人群CD的發(fā)病風(fēng)險[10]。在亞洲人群的研究中，日本學(xué)者在一項納入484例CD患者的研究結(jié)果中首次報道rs6887695純合子突變CC基因型攜帶者罹患CD的風(fēng)險是其他基因型攜帶者的1.42倍[9]。本研究結(jié)果與日本人群及德國人群的研究報道相悖，推測可能與納入的樣本數(shù)量及種族遺傳背景差異有關(guān)。

目前認(rèn)為，自身遺傳多態(tài)性與CD患者的疾病表型密切相關(guān)。例如Wu等[22]報道芳香烴受體（AhR）基因多態(tài)性與回腸型CD密切相關(guān)，而與病變累及結(jié)腸的CD無關(guān)。這一研究結(jié)果提示病變局限于回腸的CD和病變累及結(jié)腸的CD兩者的遺傳免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制可能存在一定差異。本研究結(jié)果表明，rs6887695在對照組和回腸型CD組患者之間有統(tǒng)計學(xué)差異?；啬c型CD患者中突變C等位基因以及GC+CC基因型頻率明顯低于對照組，提示rs6887695基因突變可能是浙江漢族回腸型CD的保護(hù)因素。此外，組內(nèi)分層分析亦發(fā)現(xiàn)，回腸型CD組患者中rs6887695突變C等位基因和GC+CC基因型以及CC基因型頻率均低于結(jié)腸病變CD組患者，提示該位點基因突變可能導(dǎo)致CD患者更易累及結(jié)腸。國外學(xué)者亦曾探討IL-12B基因多態(tài)性與CD疾病部位的關(guān)系。Márque[19]等報道IL-12B基因rs3212227和rs6887695位點與西班牙人群CD病變部位及疾病行為均無關(guān)。而Ferguson等[21]報道rs6887695位點突變T等位基因是新西蘭小腸型CD的保護(hù)因素。另有研究表明rs3212227位點多態(tài)性可能與結(jié)腸型CD相關(guān)[10]。目前有關(guān)IL-12B基因多態(tài)性影響CD疾病部位的分子機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)盡管單核細(xì)胞分泌IL-12水平受其遺傳多態(tài)性影響，但外源性抗原激活單核細(xì)胞是促發(fā)IL-12表達(dá)的先決條件。有意思的是，IL-12B基因多態(tài)性對IL-12表達(dá)的影響只在某些特定的抗原如結(jié)核菌素、脂多糖誘導(dǎo)下呈現(xiàn)，而在其他抗原如葡萄球菌菌體蛋白誘導(dǎo)下，其基因多態(tài)性對IL-12表達(dá)無影響[14]，這表明IL-12B基因?qū)L-12表達(dá)的影響與環(huán)境菌群抗原種類密切相關(guān)。由于人類回、結(jié)腸中腸道菌群構(gòu)成迥然各異，筆者推測IL-12B基因?qū)D病變部位的影響可能是其遺傳多態(tài)性和腸道菌群抗原差異等多方面因素綜合作用的結(jié)果。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示IL-12B基因rs6887695位點多態(tài)性與浙江漢族人群CD的臨床表型可能相關(guān)，該位點的突變C等位基因、GC+CC基因型可能是回腸型CD的保護(hù)因素。由于體內(nèi)IL-12信號所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答錯綜復(fù)雜，本研究尚不能完全詮釋IL-12B對CD臨床表型影響的潛在機(jī)制，這有待于后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

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